Эффективность внутриматочного введения аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови перед переносом эмбриона у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах вспомогательных репродуктивных технологий

Аннотация:

Цель исследования - оценить эффективность внутриматочного введения аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) перед переносом эмбриона у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Материал и методы. В исследование включены 129 пациенток с повторными неудачами имплантации в программе экстракорпорального оплодотворения: 1-я группа - 42 женщины, которым перед переносом эмбриона проводилось внутриматочное введение аутологичных МКПК, активированных хорионическим гонадотропином человека - ХГЧ (Прегнил 500 ME); 2-я группа - 42 пациентки, которым проводилось внутриматочное введение аутологичных МКПК без активации ХГЧ, 3-я группа (плацебо) - 45 участниц, которым проводилось внутриматочное введение физиологического раствора. Результаты. В группе пациенток с внугриматочным введением МКПК, активированными ХГЧ, частота положительного анализа крови на ХГЧ, имплантации и наступления клинической беременности была значимо выше по сравнению с аналогичными показателями в группе пациенток с внутриматочным введением МКПК без активации ХГЧ и в группе плацебо как в стимулированном, так и криоцикле (р<0,05). Заключение. Внутриматочное введение аутологичных МКПК перед переносом эмбриона в программе экстракорпорального оплодотворения/ИКСИ (интрацито-плазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку) повышает эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с повторными неудачами имплантации в анамнезе. Ключевые слова: повторные неудачи имплантации, внутриматочное введение, аутологичные мононуклеарные клетки периферической крови, хорионический гонадотропин человека. Несмотря на несомненные достижения в области вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), частота повторных неудач имплантации продолжает оставаться высокой и достигает 50-75% . Повторные неудачи имплантации (repeated implantation failure - RIF) - серьезная проблема, решению которой посвящено большое количество как клинических, так и фундаментальных исследований в области репродукции человека. Молекулярные и иммунологические аспекты неудач имплантации находятся в фокусе научных исследований последних лет. Некоторые аспекты иммунных взаимоотношений матери и эмбриона до сих пор остаются неизвестными, несмотря на то что последние достижения в области молекулярной биологии позволили выявить некоторые иммунологические параметры, определяющие взаимосвязь между иммунными нарушениями матери и плода во время имплантации. Имплантация - сложный многоступенчатый процесс, регулируемый как системными, так и локальными факторами. Как известно, успешное наступление и прогрессирование беременности ассоциировано с преимущественным профилем Т112-цитокинов (LIF, интерлейкины - ИЛ-1,ИЛ-8, ИЛ-11, L-4 и ИЛ-10), а преобладание Thl-цитокинов (интерферон у, ИЛ-2 и фактор некроза опухоли а, ИЛ-1, ИЛ-6) неблагоприятно для наступления беременности.Большое значение имеют Т-регуляторные клетки, фено-типически определяющиеся как CD4+CD25+Foxp3+, которые модулируют иммунологическое микроокружение эндометрия, необходимое для имплантации . В последнее время появились данные о том, что локальные иммунные клетки вносят существенный вклад в имплантацию эмбриона. Так, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), к которым относятся Т-, В-лим-фоциты и моноциты, индуцируют образование ряда цито-кинов, таких как ИЛ- 1а, ИЛ-10 и фактор некроза опухоли а, позитивно влияющих на рецептивность эндометрия. Более того, они инициируют и контролируют инвазию трофобласта и регулируют иммунную толерантность к эмбриону во время имплантации. В настоящее время отсутствует единая точка зрения на необходимость проведения иммунологических исследований и назначения различных видов иммунотерапии у женщин с повторными неудачами имплантации. Обсуждается целесообразность проведения иммунизации отцовскими лимфоцитами, внутривенного введения иммуноглобулина, терапия интралипидом, а также локального повреждения эндометрия. Одним из методов иммунокоррекции при повторных неудачах имплантации является внутриматочное введение аутологичных мононуклеарных клеток перед переносом эмбриона в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Роль периферических мононуклеарных клеток в обеспечении рецептивности эндометрия обсуждается с тех пор, как было показано, что клетки селезенки беременных мышей могут регулировать рецептивность эндометрия , а МКПК, введенные в полость матки перед переносом эмбриона, повышают вероятность имплантации . Также показано, что МКПК, полученные от женщин с беременностью ранних сроков, могут индуцировать продукцию прогестерона и усиливать инвазию трофобласта эмбрионов мышей in vitro . Прямое влияние МКПК на имплантацию впервые изучили S.Yoshioka и соавт. в 2006 г. и показали, что внутриматочное введение аутологичных МКПК перед переносом эмбрионов, которые культивировали с хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ) в течение 48 ч, значительно повышало частоту имплантации, клинической беременности и родов у пациенток с повторными неудачами имплантации в программе ЭКО . Позднее было показано, что внутриматочное введение МКПК повышает частоту имплантации в криоциклах как на фоне подготовки эндометрия препаратами эстрогенов и прогестерона, так й в естественном цикле у женщин, имеющих до 3 неудач имплантации в анамнезе . Подобный подход применяли также на животных, и было выявлено повышение частоты имплантации у мышей с предшествующими неудачами имплантации [12]. Более поздние исследования также продемонстрировали положительные эффекты внутриматочного введения ХГЧ и аутологичных МКПК, ак: тивированных ХГЧ, перед переносом эмбрионов у пациенток с 2 и более неудачами имплантации [6]. Однако в исследованиях A.Santibanez (2014 г.) и M.Volovsky (2018 г.) не выявлено позитивного эффекта внутриматочного введения аутологичных МКПК перед переносом эмбриона на исходы программ ВРТ у женщин с повторными неудачами имплантации в анамнезе . Целью исследования явилась оценка эффективности программ ЭКО/ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку) при использовании внутриматочного введения аутологичных МКПК как активированных ХГЧ, так и МКПК без активации ХГЧ перед переносом эмбриона в стимулированном и криоцикле у пациенток с повторными неудачами имплантации. Материал и методы. В исследование были включены 129 пациенток 1-ю группу составили 42 женщины, которым перед переносом эмбриона проводилось внутриматочное введение аутологичных МКПК, активированных ХГЧ (Прегнил 500 ME); 2-ю - 42 пациентки, которым перед переносом эмбриона проводилось внутриматочное введение аутологичных МКПК без активации ХГЧ; 3-ю (плацебо) составили 45 участниц, которым перед переносом эмбриона проводилось внутриматочное введение физиологического раствора. Исходя из различных протоколов ВРТ (стимулированный и криоцикл) было выделено по 2 подгруппы в каждой из 3 групп: 1а (п=17) - пациентки группы МКПК+ХГЧ в стимулированном цикле, 16 (п=25) - пациентки группы МКПК+ХГЧ в криоцикле; 2а (п=21) - пациентки группы МКПК в стимулированном цикле и 26 (п=21) - пациентки группы МКПК в криоцикле; За (п=22) - пациентки группы плацебо в стимулированном цикле и 36 (п=22) - пациентки группы плацебо в криоцикле. Критериями включения в исследуемые группы явились: возраст пациенток 37 лет и менее, неудачные попытки ЭКО как минимум в 3 стимулированных или криоциклах при условии переноса эмбрионов хорошего качества. Критериями невключения в группы явились: хромосомные аномалии супругов, выраженная патозооспермия у партнера, хронический эндометрит, верифицированный при гистологическом исследовании, толщина эндометрия менее 7 мм, врожденные аномалии матки, миома матки 3 см и более, наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) III—IV стадии; гидросальпинкс с одной или обеих сторон, синдром поликистозных яичников, «бедный ответ» яичников на гонадотропную стимуляцию, наличие системных аутоиммунных заболеваний. Методы. Пациенткам проводили полное клинико-лабораторное обследование в соответствии с Приказом Минздрава России от 30.08.2012 №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Программу ЭКО проводили в протоколе с антагонистом гонадотропин-рилизинг-гормона (антГнРГ). Со 2-3-го дня менструального цикла начинали стимуляцию суперовуляции препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона или человеческого менопаузального гонадотро-пина. При достижении фолликулами диаметра 14 мм для предотвращения преждевременного пика лютеинизирую-щего гормона пациенткам вводили антГнРГ (цетрореликс 0,25 мг) до дня введения триггера овуляции включительно. При наличии не менее 3 фолликулов диаметром 18 мм назначали триггер овуляции (ХГЧ в дозе 10 000 ME) за 35-36 ч до проведения трансвагинальной пункции яичников, которую производили в асептических условиях под кратковременным внутривенным наркозом посредством вакуумной аспирации фолликулов под трансвагинальным ультразвуковым мониторингом. Учитывая безуспешные попытки ЭКО в анамнезе, оплодотворение выполнялось методом ИКСИ. Оценку качества полученных эмбрионов осуществляли по морфологическим критериям в соответствии с классификацией, принятой Istanbul consensus workshop on embryo assessment (ESHRE, 2011; «модифицированная» классификация D.Gardner) . Перенос эмбрионов в полость матки производили на 5-е сутки культивирования под контролем ультразвукового исследования (УЗИ). Число переносимых эмбрионов не превышало 2. Для поддержки лютеиновой фазы использовали микронизированный прогестерон со следующего дня после трансвагинальной пункции яичников в дозе 600 мг/сут вагинально. Проведение криоцикла осуществляли на фоне подготовки эндометрия с использованием препаратов эстрогенов и микронизированного прогестерона под контролем УЗИ. Перенос размороженных после витрификации эмбрионов на стадии бластоцисты в полость матки выполняли на 5-е сутки от начала приема прогестерона под ультразвуковым контролем. Для получения фракции МКПК забор крови у пациенток в стимулированном цикле осуществлялся натощак из локтевой вены в день трансвагинальной пункции, у пациенток в криоцикле в день начала приема препаратов микронизированного прогестерона. Процедура выделения МКПК осуществлялась в стерильные пробирки общим объемом 18 мл, содержащие в качестве консерванта гепарин (ваку-тейнер Sarstedt Monovette LН/9мл) в соответствии с протоколом «Проведение иммунотерапии с помощью внутрима-точного введения аутологичных мононуклеарных клеток», утвержденным на ученом совете ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И.Кулакова». Эффективность программы оценивали путем исследования концентрации бетаХГЧ в сыворотке крови через 12-14 дней после переноса эмбриона. При бетаХГЧ>20 МЕ/л констатировали положительный результат. При условии положительного бетаХГЧ осуществляли УЗИ через 21 день после переноса эмбриона. Частоту имплантации оценивали как отношение числа перенесенных эмбрионов к числу плодных яиц по данным УЗИ. Клиническую беременность диагностировали при наличии живого эмбриона по данным УЗИ через 4-5 нед после переноса эмбриона. Для статистической обработки результатов исследования использовался Statistical Package for Social Sciences (SPSS v21.0). Все полученные в исследовании количественные анамнестические, клинические, инструментальные и лабораторные данные были обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), ошибка среднего (ш), медиана (Me), для качественных данных - частоты (%). При нормальном характере распределения данных результаты представлены как среднее + стандартная ошибка среднего (М+ш). Для сравнения частот встречаемости признаков в анализируемых группах использовался критерий х2 с поправкой на непрерывность. Разница в менее 0,05 считалась существенной. Результаты. Мы провели анализ клинико-анамнестических и лабораторных характеристик пациенток с повторными неудачами ВРТ, включенных в исследование (табл. 1). Медиана возраста женщин, включенных в исследование, в 1-й группе составила 34 года (интерквартильный интервал 30-35 лет), во 2-й - 32 года (интерквартильный интервал 30-35 лет), в 3-й - 34 года (интерквартильный интервал 31-36 лет). Анализ менструальной функции пациенток исследуемых групп показал, что возраст менархев з группах был в пределах от 10 до 18 лет (13,0+0,1), продолжительность менструального цикла в среднем составила в 1-й группе - 30,1±0,3 дня, во 2-й - 29,0+0,3, 3-й -32,0+0,7 (р>0,05). Нарушений становления и характера менструального цикла среди обследованных женщин выявлено не было. Статистически значимых различий по всем перечисленным показателям в 3 исследуемых группах не выявлено ф>0,05). Длительность бесплодия колебалась от 3 до 14 лет и в среднем составила в 1-й группе 6,0+0,3 года, во 2 и 3-й -5,0+0,2. Первичное бесплодие было выявлено у 28 (66,7%) пациенток 1-й группы, 26 (61,9%) женщин 2-й группы и 26 (57,8%) - 3-й. Вторичное - у 14 (33,3%), 16 (38,1%), 19 (42,2%) пациенток 3 групп соответственно (р>0,05). Значимых различий в распределении факторов бесплодия среди пациенток исследуемых групп не выявлено. Бесплодие было обусловлено трубно-перитонеальным фактором у 18 (42,9%) женщин 1-й группы, 19 (45,2%) - 2-й и 13 (28,9%) -3-й (р>0,05). Мужской фактор был выявлен у 24 (57 2%) 22 (52,4%) и 31 (68,9%) пациентки 3 групп соответственно, характеризовался умеренными нарушениями сперматогенеза, которые наиболее часто проявлялись в виде астенозо-оспермии 1-2-й степени (49,8%) и астенотератозооспер-мии 1-2-й степени (26,9%). НГЭ I—II стадии диагностирован у 10 пациенток: в 9,5 и 14,3% случаев в 1 и 2-й группе соответственно. Сочетание факторов наблюдалось у 24 (18%) женщин. Идиопатическое бесплодие отмечено у 28 (17,6%) пациенток. Число безуспешных попыток ЭКО в анамнезе было сопоставимо в 3 группах, в том числе в 1-й 2 неудачи имели 14 (33,3%) пациенток, 3 или 4 неудачи - 27 (64,3%) и 5 неудач - у 1 (2,4%) пациентки. Среди пациенток 2-й группы 2 неудачи имели 12 (28,6%), 3 или 4-28 (66,7%) и более 5 -2 (4,8%) пациентки. Среди участниц 3-й группы 2 неудачи имели 7 (15,6%) пациенток, 3 или 4-31 (68,9%) и 5 неудач 2 (4,4%) пациентки (р>0,05). Параметры овариального резерва у пациенток 3 групп на момент вступления в программу ЭКО находились в пределах нормативных значений, статистически значимых различий между исследуемыми группами не выявлено -уровни антимюллерова гормона были сопоставимы в 3 группах (медиана 2,4, 2,1 и 2,0 МЕ/л; /^=0,154, р7=0 143 рз=0,539). ' ' Таким образом, анализ клинико-анамнестических и лабораторных данных показал, что исследуемые пациентки с повторными неудачами имплантации находились в репродуктивном возрасте, имели овуляторный характер менструального цикла, а также сопоставимые факторы бесплодия и показатели овариального резерва. Анализ эмбриологических показателей продемонстрировал отсутствие существенных различий в количестве перенесенных эмбрионов (1,85+0,038, 1,83+0,035, 1,83+0,035; Л=0,247,/>2==0,792,/>з=0,549) и количестве эмбрионов хорошего качества (1,04+0,08, 0,8+0,07, 0,8+0,07; р,=0 0в2 р2=0,9б7,?з=0,074). Мы провели сравнительную оценку исходов программ ВРТ при проведении внутриматочного введения аутологичных мононуклеарных клеток как активированных ХГЧ, так и без активации перед переносом эмбриона в стимулированном и криоцикле у пациенток с повторными неудачами имплантации. Результаты представлены в табл. 2, 3. Как видно из данных табл. 2, в стимулированном цикле частота положительного анализа крови на (ЗХГЧ, имплантации и наступления клинической беременности была существенно выше в группе пациенток, которым проводили внутриматочное введение МКПК как активированных ХГЧ, так и в группе женщин с МКПК без активации ХГЧ в сравнении с аналогичными показателями в группе плацебо (35 3 и 9,1,%,р3=0,034; 29,4 и 9,1%, р,=0,009, 33,3 и 7,6%, р3=0,б01; 33,3 и 9,1%; р2=0,00б; 23,8 и 9,1%, р2=0,035; 28,6 и 7,6%, />2=0,01)- При этом в группе пациенток с МКПК, активированных ХГЧ, частота анализируемых показателей была выше по сравнению с группой МКПК без активации ХГЧ, однако статистически значимых отличий не зафиксировано (35,3 и 33,3%, р!=0,988; 29,4 и 23,8%, рг=0,95б; 33,3 и 28,6%,р2=0,873). В криоцикле частота положительного анализа крови на (ЗХГЧ, клинической беременности и имплантации в группе пациенток с МКПК, активированными ХГЧ, была выше по сравнению с аналогичными показателями в группе МКПК без активации и группе плацебо (40 и 25%, р1=0,04б; 36 и 20,8%, А=0,014; 35,4 и 17,3%, А=0,001; 38,1 и 25%, р3=0,001; 33,3 и 20,8%,рз=0,005; 30,3 и 17,3%,р3=0,034). При этом в группе пациенток с МКПК, активированными ХГЧ, частота анализируемых показателей была выше по сравнению с группой женщин с МКПК без активации ХГЧ, однако достоверно значимых отличий не зафиксировано (40 и 38,1%, рх=0,597- 36 и 33,3%,р1=0,595; 35,4 и 30,3%,А=0,134); см. табл. 3. Обсуждение полученных результатов. В литературе существует много противоречивых данных по значимости различных иммунологических исследований и различных видов иммунотерапии у женщин с RIF . Внутриматочное введение аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови перед переносом эмбрионов является одним из новых методов иммунокоррек-ции при RIF. В данном исследовании мы оценивали эффективность внутриматочного введения аутологичных МКПК как активированных ХГЧ, так и МКПК без активации перед переносом эмбриона в стимулированном и криоцикле у пациенток с повторными неудачами имплантации. Полученные данные продемонстрировали значимое повышение частоты наступления клинической беременности и частоты имплантации в группе пациенток с проведением внутриматочного введения МКПК, активированных ХГЧ, перед переносом эмбриона у пациенток с повторными неудачами имплантации как в стимулированном, так и криоцикле по сравнению с группой плацебо. Обсуждается несколько механизмов действия МКПК. Во-первых, МКПК могут индуцировать дифференциацию эндометрия, что повышает вероятность имплантации эмбриона. Во-вторых, хотя МКПК и являются аутологичными клетками, они индуцируют асептические воспалительные реакции в полости матки in vivo . В-третьих, МКПК способны секретировать протеазы, которые эффективно влияют на функцию и структуру поверхностных молекул, экспрессируемых на люминальных эпителиальных клетках эндометрия . ХГЧ потенцирует эти множественные эффекты, непосредственно участвуя в регуляции имплантации эмбриона. ХГЧ - это основной эмбриональный сигнал, стимулирующий секрецию цитокинов и хемокинов в МКПК, таких как LIF и ИЛ-1, матриксная металлопротеи-наза 2, матриксная металлопротеиназа 9 и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), способствующих инвазии тро-фобласта . Следовательно, можно предположить, что МКПК, активированные ХГЧ, повышают частоту имплантации и частоту наступления клинической беременности за счет создания адекватного баланса цитокинов Th2/Thl и адекватного уровня и функции Т-регуляторных клеток, создавая благоприятное иммунное микроокружение для имплантации эмбриона. В результате проведения сравнительной оценки эффективности данного метода иммунотерапии в зависимости от типа протокола ВРТ было выявлено, что частота наступления клинической беременности и имплантации была выше в криоцикле по сравнению с аналогичными показателями в стимулированном цикле, что согласуется с данными литературы о снижении частоты клинической беременности в стимулированных циклах по сравнению с криоциклами . Действительно, в стимулированных циклах эндометрий подвергается влиянию высоких уровней гормонов вследствие гонадотропной стимуляции, что может приводить к нарушению созревания эндометрия, негативно влияя на его рецептивность . В криоциклах в отличие от стимулированных циклов эндометрий не подвергается повышенным гормональным нагрузкам вследствие стимуляции суперовуляции, поэтому в них создаются более оптимальные условия для имплантации, приближенные к естественному циклу . Таким образом, проведение внутриматочного введения аутологичных МПК, активированных ХГЧ, перед переносом эмбриона в стимулированных и криоциклах повышает частоту имплантации и наступления клинической беременности у пациенток с повторными неудачами имплантации в анамнезе. Полученные данные позволяют рекомендовать проведение этого метода иммунотерапии у пациенток с повторными неудачами в программах ВРТ.

Авторы:

Издание: Гинекология
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.28-33. Библ. 22 назв.
Просмотров: 284