Синтетический аналог лей-энкефалина предотвращает развитие эндотелиальной дисфункции in vitro

Аннотация:

Цель исследования - изучить эффективность действия синтетического стабилизированного аналога лей-энкефалина в качестве средства, предотвращающего повреждение монослоя эндотелиальных клеток in vitro под действием сывороток пациентов с септическим шоком. Материалы и методы. Эксперименты выполнены на монослое эндотелиальных клеток ЕаНу.926. Изучали влияние синтетического аналога лей-энкефалина in intra на развитие повреждения клеток под действием сывороток пациентов (5 больных с септическим шоком). Состояние межклеточных контактов эндотелия оценивали методами иммунофлуоресцентной микроскопии и иммуноблотинга с антителами к белку адгезивных контактов — VE-кадгерину и белку плотных контактов — клаудину. Жизнеспособность клеток определяли с помощью окраски йодистым пропидием. Результаты. Прекондиционирование синтетическим аналогом лей-энкефалина (10,50 и 100 мкг/мл) клеток эндотелия in vitro приводило к предотвращению деструкции плотных и адгезивных контактов, а также частично предотвращало гибель эндотелиоцитов. Заключение. Прекондиционирование синтетическим аналогом лей-энкефалина частично предотвращает гибель эндотелиоцитов, вызванную воздействием сыворотки септических больных in vitro. Эти данные диктуют необходимость проведения клинических испытаний эффективности применения синтетического аналога лей-энкефалина с целью профилактики сепсис-ассоциированной эндотелиальной дисфункции. Ключевые слова: лей-энкефалин; проницаемость эндотелия; синдром системного воспалительного ответа; септический шок; Даларгин. Введение: Эндотелий представлен одним слоем специализированных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов. Помимо барьерной, эндотелий выполняет ряд других физиологических функций: поддержание онкотического давления, участие в свертывании крови, ангиогенезе и проч. При развитии некоторых патологических процессов, эндотелиальная дисфункция становится их важной составляющей и во многом определяет тяжесть течения атеросклероза, сепсиса, ишемических и реперфузионных повреждений, тяжелой сочетанной травмы, а также синдрома системной воспалительной реакции (ССВР), в том числе, и в раннем послеоперационном периоде. Транскапиллярная утечка жидкости, возникающая вследствие нарушения барьерной функции эндотелия или гибели клеток, приводит к возникновению интерстициального отека, что, на уровне организма, манифестирует полиорганной недостаточностью — состоянием, представляющем серьезную угрозу жизни больного ССВР. Важной составляющей ССВР является эндотелиальная дисфункция — ключевой феномен критических состояний, сопровождающийся увеличением проникновения провоспалительных цитокинов через гистогематические барьеры и приводящий к нарушению целостности последних, с последующей инфильтрацией тканей лейкоцитами и цитокинами. Барьерная функция эндотелия закономерно нарушается при септическом шоке, что способствует развитию неблагоприятных клинических исходов. Предупреждение, лечение и минимизация последствий ССВР является одной из основных задач анестезиологов-реаниматологов. Наличие противовоспалительной активности (т.е. способности тормозить развитие ССВР) и, как следствие, способность предотвращать развитие эндотелиальной дисфункции, является положительным побочным эффектом немалого числа известных препаратов. Однако, их эффективность в обсуждаемом плане не велика и, с учетом важности проблемы ССВО, представляется чрезвычайно важным поиск новых препаратов, способных тормозить развитие эндотелиальной дисфункции. Более 30-ти лет назад в клинику был внедрен синтетический стабилизированный аналог лей-энкефалина с дельта- и мю-опиоидной активностью — Даларгин, который представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg. Синтетический аналог лей-энкефалина (Даларгин) разрешен к клиническому применению для лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка в период обострения; острого панкреатита; острого некротического панкреатита в составе комплексной терапии. В ранних исследованиях было показано наличие у препарата кардиопротекторных свойств при операциях с ИК, однако, неизученность механизмов его действия и непостоянство эффекта, помешали Даларгину в то время занять достойное место в арсенале анестезиолога. После открытия феномена опиоидного прекондиционирования возникло предположение, что органопротекторные эффекты Даларгина реализуются теми же биохимическими путями, и если эта гипотеза найдет свое подтверждение, то у клиницистов появится средство для лечения или предотвращения осложнений, прежде всего органной недостаточности, связанной с эндотелиальной дисфункцией, в том числе, при сепсисе и септическом шоке. Цель настоящего исследования — изучить эффективность действия синтетического стабилизированного аналога лей-энкефалина в качестве средства, предотвращающего повреждение монослоя эндотелиальных клеток in vitro под действием сывороток пациентов с септическим шоком. Материал и методы: Сыворотки забирали у больных с развившимся септическим шоком, которые были отобраны в соответствии с критериями «Сепсис-З»: 5 человек, средний возраст 45 [29-55] лет, а также у здоровых доноров, подписавших информированное согласие: 5 человек, средний возраст 35 [28-45] лет 57. Флуоресцентная микроскопия. Эндотелиальные клетки Ea.hy926 растили в среде DMEM (Gibco, USA) с 10% телячьей эмбриональной сывороткой — FBS (Ну-Clone, USA) до монослоя. Затем клетки инкубировали в течение 3-х часов при 37°С с 5%-ной телячьей эмбриональной сывороткой (контроль), с сывороткой здорового человека, а также с сывороткой пациента с сепсисом без Даларгина и в его присутствии в конечных концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкг/мл. Даларгин добавляли за 1 час до смены сывороток. После инкубации клетки промывали теплым раствором DMEM без сыворотки, а затем фиксировали 2%-ным раствором пара-форма и пермеабилизовывали 1%-ным раствором Triton Х-100. Фиксированные клетки окрашивали первичными антителами к VE-кадгерину (BD Biosciences, USA), а затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем Oregon Green 488 (Life Technologies, USA), а также с фаллоидином, меченным TRITC (Sigma, USA) и красителем Hoechst 33342 (Life Technologies, USA). Обработку изображений, полученных на флуоресцентном микроскопе, а также их количественный анализ проводили с помощью программ ImageJ 1.44р и MetaVue 4.6 с определением относительной площади межклеточных промежутков в % от общей площади в эндотелиальных клетках. Вестерн-блоттинг. Эндотелиальные клетки Ea.hy926 растили и инкубировали так же, как описано выше. После инкубации клетки лизировали в горячем буфере (62,5 шМ Трис-HCl, рН 6,8; 2% SDS; 10% глицерин; 50 тМ ДТТ, 0,01% бромфенолового синего) при температуре 94°С, в течение 4 мин. Белки разделяли в 12% полиакриламидном геле и переносили на PVDF-мембраны. Были использованы антитела к VE-кадгерину и клаудину (BD Biosciences, USA), а также вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (BD Biosciences, USA). Визуализацию проводили набором SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, USA). Для денситометрического анализа и определения относительного содержания VE-кадгерина (%) в межклеточных контактах эндотелиальных клеток использовали программу Image Lab (BioRad, USA). Изучение влияния сывороток пациентов с септическим шоком на апоптоз эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки Ea.hv926 растили до монослоя. Затем клетки инкубировали в течение 12 часов при 37°С с 5%-ной телячьей эмбриональной сывороткой (контроль), с сывороткой здорового человека, а также с сывороткой пациента с сепсисом без Даларгина и в его присутствии в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкг/мл. После инкубации клетки снимали раствором трипсин-Версена, фиксировали 70%-ным этанолом и окрашивали йодистым пропидием. Клетки, содержащие фрагментированную геномную ДНК анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии, как описано ранее. Статистический анализ. Данные представили в виде медианы с межквартильным интервалом. Статистическую значимость различий показателей оценивали с помощью U-теста Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р<0,05. Результаты и обсуждение: Инкубация монослоя эндотелиальных клеток сывороткой пациентов с септическим шоком приводила к потере белка адгезионных контактов VE-кадгерина. Септическая сыворотка также изменяла форму клеток: они теряли правильную многоугольную форму, вытягивались, между ними образовывались промежутки, поскольку «разбирались» еще и пучки периферических актиновых микрофиламентов (рис. 1). Такие изменения характерны для эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся нарушением межклеточных контактов. Подобные эффекты не наблюдали при инкубации с 5%-ной телячьей эмбриональной сывороткой (контроль) или 5%-ной сывороткой здоровых добровольцев. Таким образом, данный эксперимент может рассматриваться как модель эндотелиальной дисфункции при сепсисе in vitro. Для изучения возможного ангиопротекторного эффекта Даларгина в рамках предложенной модели использовали следующие концентрации активного вещества: 1, 10, 50 и 100 мкг/мл. По данным иммунофлуоресцентой микроскопии, инкубация с Даларгином в низких концентрация (1 и 10 мкг/мл) незначительно предотвращает «разборку» актина и VE-кадгерина в межклеточных контактах. Прединкубация с Даларгином в более высоких концентрациях (50 и 100 мкг/мл) практически полностью защищала эндотелиальный монослой от разрушения межклеточных контактов под действием сыворотки пациентов с септическим шоком (рис. 2, а). Численный анализ данных флуоресцентной микроскопии представлен в таблице. Для количественной оценки содержания белков межклеточных контактов (клаудина и VE-кад-герина) использовали Вестерн-блоттинг. Инкубация с 5%-ной сывороткой пациента с сепсисом примерно вполовину уменьшала количество VE-кадгерина в клеточных лизатах (рис. 2, b). Инкубация с Даларгином дозозависимо защищала этот белок от расщепления под действием септической сыворотки (рис. 2, с). Инкубация с 5%-ными сыворотками пациентов с септическим шоком приводила к значительном) увеличению количества апоптотических клеток (рис. 2, d). Даларгин в концентрации 1 мкг/мл незначительно уменьшал количество апоптотических клеток, а при концентрациях 10, 50 и 100 мкг/мл наблюдали значимое снижение количества апоптотичесих клеток (табл.). Клетки линии Ea.hy 926 обладают основными фенотипическими и функциональными характеристиками эндотелиальных клеток сосудов человека, поэтому они были выбраны нами в качестве модели для исследования эндотелиальной дисфункции. Ранее было установлено, что различные про-воспалительные цитокины, например, TNF-a (Tumour Necrosis Factor а) вызывают расщепление VE-кадгерина — эндотелиального белка адгезионных контактов. Также, при действии подобных провоспалительных агентов, происходит деградация белков плотных контактов, в том числе, клаудина. Эндотелиальные межклеточные контакты выполняют важнейшую роль в поддержании целостности сосудов. Повышение проницаемости эндотелия под действием провоспалительных цитокинов (TNF-a, интерлейкины-1, -8, -12.) происходит за счет реакций фосфорилирования и убиквитинирования основных белковых компонентов адгезивных межклеточных контактов (VE-кадгерина, окклудина, клаудина). Протеолиз этих важнейших белков межклеточных контактов вызывает образование промежутков между клетками, что приводит к увеличению проницаемости и нарушению барьерной функции эндотелия. В крайних случаях может развиться эндотелиальная дисфункция, которая в настоящее время считается одним из основных факторов развития полиорганной недостаточности при сепсисе и септическом шоке. Также в рамках выбранной модели изучали влияние сывороток пациентов с септическим шоком на апоптоз эндотелиальных клеток. Известно, что в норме in vivo эндотелий практически не подвергается апоптозу. Однако есть данные, что при сепсисе увеличивается количество апоптотических эндотелиальных клеток. В моделях in vitro многие провоспалительные агенты, такие, как LPS (Lipopolysac-charide), TNF-a, IL-1, увеличивают апоптоз различных линий эндотелиальных клеток. Ранее считали, что опиоидные рецепторы находятся исключительно в нервной ткани, и только совсем недавно они были обнаружены и в других тканях, в том числе на поверхности эндотелиальных клеток. Было доказано, что морфин действует на мю-опиоидные рецепторы эндотелиальных клеток, что приводит к активации синтеза N0 и вазодилатации. Даларгин является неселективным агонистом мю- и дельта-опиоидных рецепторов, причем, преимущественно периферического действия. В настоящей работе удалось показать, что Даларгин способен предотвращать апоптоз, а также деградацию актина и VE-кадгерина в межклеточных контактах эндотелиоцитов линии Ea.hy 926, вызванную действием сывороток септических больных. Эти данные полностью согласуются с ранее полученными результатами о протективном антиапоптотическом действии Даларгина на эндотелиальные клетки, обработанные антиэндотелиальными антителами и сенсибилизированными лимфоцитами. Косвенно перспективность использования Даларгина с целью предотвращения эндотелиальной дисфункции подтверждает недавняя работа А. Донцова, в которой было показано, что включение в терапию Даларгина у больных ишемической болезнью сердца сопровождалось достоверным снижением активности параметров оксидативного стресса и повышением антиоксидантных свойств крови. Возможно Даларгин также индуцирует защитные антиоксидантные механизмы в эндотелии при различных патологических состояниях. Известно, что антиоксиданты способны предотвращать апоптоз эндотелиальных клеток и препятствовать развитию эндотелиальной дисфункции. На сегодняшний день механизмы действия Даларгина на эндотелиальные клетки остаются неизученными. В этой связи, нам представляется важным продолжить исследования молекулярных механизмов его защитных свойств на эндотелий. Изучение биологических процессов, связанных с действием отдельных веществ на эндотелий требует использования методов и in vitro, и in vivo. Полученные в настоящей работе данные требуют также проверки в моделях с использованием животных. При этом не исключено, что концентрации Даларгина, используемые в настоящей работы, могут значительно отличаться от действующих концентраций in vivo. Ограничения исследования. Относительно небольшое количество образцов сывороток, использованных в работе, не позволяет сделать вывод о том, что все пациенты с сепсисом подвержены эндотелиальной дисфункции. В работе отсутствуют данные о содержании цитокинов в сыворотоках пациентов с септическим шоком. Заключение: Прекондиционирование Даларгином дозозависимо частично предотвращает гибель эндотелиоцитов, вызванную воздействием сыворотки септических больных, in vitro на клетки эндотелия человека. Даларгин также дозозависимо предотвращает деградацию актина и VE-кадгерина в межклеточных контактах эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926 под действием сыворотки пациентов с септическим шоком, что свидетельствует о протекторном эффекте препарата на эндотелий, но не выявляет, посредством какого механизма он осуществляется. Такое защитное действие может обеспечивать сохранение функционального сосудистого барьера при опасных для жизни критических состояниях. Подтверждение вышеизложенного в моделях in vivo и раскрытие молекулярных механизмов защиты эндотелия, позволит инициировать клиническое испытание Даларгина (IV фаза) для доказательства его органопротекторных свойств.

Авторы:

Издание: Общая реаниматология
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.60-68. Библ. 26 назв.
Просмотров: 74