Перспективы использования средств на основе митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl в лечении труднозаживающих ран (обзор)

Аннотация:

Длительно заживающие, хронические раны являются нерешенной проблемой современной медицины. Важнейшую роль в патогенезе таких ран при старении, диабете, многих патологических состояниях играет избыточный окислительный стресс. Обзор посвящен роли митохондрий в этом стрессе и перспективам использования новых митохондриально-направленных антиоксидантов для терапии труднозаживающих ран. Недавние исследования на старых мышах и мышах с диабетом 2-го типа показали, что отечественный мито-хондриально-направленный антиоксидант SkQl [10-(6-пластохинонил) децилтрифенилфосфония] стимулирует заживление полнослойных кожных ран. Прием SkQl ускоряет протекание воспалительной фазы заживления, созревание грануляционной ткани, ангиогенез и эпителизацию ран. Противовоспалительное действие SkQl, возможно, связано со снижением воспалительной активации эндотелия сосудов, которая характерна для старения, диабета и других патологий. Локальное введение SkQl также ускоряет заживление ран и имеет выраженное противовоспалительное действие при экспериментальном моделировании острого асептического воспаления. Кроме того, SkQl стимулирует апоптоз нейтрофилов и подавляет их активацию, а также угнетает воспалительную активность тучных клеток. В условиях моделирования раневого процесса in vitro SkQl ускоряет движение эпителиоцитов и фибробластов в «рану» и стимулирует миофибробластную дифференцировку подкожных фибробластов человека. Можно полагать, что препараты для локальной терапии труднозаживающих ран на основе SkQl послужат эффективным средством борьбы с длительно незаживающими ранами, в том числе — у пациентов с хроническими критическими состояниями. Ключевые слова: активные формы кислорода; митохондрии; заживление ран. Введение: Длительно незаживающие или хронические раны остаются существенной медицинской проблемой. Настоящий обзор сконцентрирован на анализе значения активных форм кислорода (АФК) в патогенезе хронических ран, участия митохондрий в генерации АФК и окислительном стрессе, а также на перспективах применения нового класса соединений — митохондриально-направленных антиоксидантов. Основная цель обзора — подробно обсудить уникальные результаты, полученные авторами данного обзора, по (а) действию митохондриально-направленных антиоксидантов на заживление ран в моделях с использованием лабораторных животных in vivo и (б) изучению механизмов действия митохондриально-адресованных антиоксидантов с использованием подходов in vitro. Заживление ран является важнейшей комплексной реакцией организма на повреждения. В этом процессе участвуют многие типы клеток, в том числе лейкоциты, эпителиоцнты, фибробласты и макрофаги, а также многочисленные гуморальные факторы, вырабатываемые этими клетками. Успешное заживление ран достигается с помощью четырех четко запрограммированных фаз: гемостаза, воспаления, пролиферации и ремоделинга. Эти фазы частично перекрываются, но для осуществления нормального ранозаживления, каждая из этих фаз должна начинаться и заканчиваться в определенное время. Гемостаз заключается в вазоконстрикции и образовании фибринового сгустка, однако вскоре наступает процесс активной вазодилатации, который сопровождается увеличением капиллярной проницаемости. Ключевым медиатором, обеспечивающим этот процесс, является гистамин, выделяемый тканевыми тучными клетками (ТК). Таким образом начинается фаза воспаления: в рану последовательно мигрируют нейтрофилы, затем моноциты, тканевые макрофаги и лимфоциты. Нейтрофилы выделяют большое количество цитокинов, протеаз и активных форм кислорода (АФК), которые не только уничтожают патогенов, но также вызывают дополнительное повреждение тканей. Макрофаги на ранних стадиях синтезируют цитокины, которые усиливают воспалительный ответ и дополнительно привлекают лейкоциты к ране. На более поздних стадиях макрофаги способствуют разрешению воспаления, очищая рану от апоптотических клеток, в первую очередь-нейтрофилов. Пролиферативная фаза заключается в реэпителизации, при которой происходит пролиферация и миграция клеток эпителия, а также в формировании грануляционной ткани. Первостепенную роль в формировании грануляционной ткани играют фибробласты, синтезирующие первичный внеклеточный матрикс. В построении и последующем ремоделинге грануляционной ткани и формировании рубца важную роль играет дифференцировка фибробластов в миофибробласты. Миофибробласты обладают повышенной способностью к сокращению, что способствует стягиванию краев раны, а также секретируют ферменты, расщепляющие первичный внеклеточный матрикс (такие как металлопротеазы внеклеточного матрикса) и интенсивно синтезируют новый внеклеточный матрикс, волокна которого более упорядочены. Важную роль в заживлении играет прорастание сосудов в грануляционную ткань. Этот процесс происходит главным образом благодаря пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, которые активируются гипоксией и проангиогенными факторами, такими как фактор роста эндотелия (VEGF). На последней стадии ранозаживления происходит ремоделирование рубца. Происходит частичный лизис незрелых неправильно ориентированных и избыточных коллагеновых волокон под действием матриксных металлопротеаз, выделяемых макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками, и постепенное их замещение более толстыми фибриллами. Труднозаживающие раны и окислительный стресс Хронические раны характеризуются нарушением нормальной смены стадий ранозаживления. Этиология хронических ран разнообразна, но подавляющее большинство из них связано с сосудистой недостаточностью, диабетом и старческими изменениями. Безусловно, основным подходом для лечения подобных ран является устранение соответствующих повреждающих факторов, однако этот вопрос не является целью настоящего обзора. Несмотря на различную этиологию, нарушение заживления ран происходит по общему сценарию. Для них характерно удлинение воспалительной фазы, продолжительное персистирование нейтрофилов, замедление формирования грануляционной ткани, ангиогенеза и эпителизации. Венозная недостаточность является одной из распространенных причин возникновения хронических ран. Нарушение нормального кровотока, с одной стороны, приводит к затруднению миграции клеток из кровяного русла к месту повреждения, а, с другой стороны, способствует постоянной гипоксии поврежденных тканей. Артериальная недостаточность вызывается, как правило, эндотелиальной дисфункцией, сопровождающей диабет или иные патологии, и также может приводить к появлению ишемизированных незаживающих ран. Возраст является важным фактором риска нарушения ранозаживления. Старение практически всегда сопровождается окислительным стрессом и изменениями в иммунной системе. С возрастом каждая фаза ранозаживления претерпевает характерные изменения: происходит повышение секреции воспалительных медиаторов, задержка инфильтрации макрофагов и лимфоцитов, нарушение фагоцитоза, снижение секреции факторов роста, отсроченный ангиогенез и реэпителизация, уменьшение скорости ремоделинга коллагена. Важно отметить, что как гипоксия, так и гипероксия, приводят к повышению уровня АФК. Особенно высокий уровень АФК вызывается повторяющейся ишемией-реперфузией, характерной для пролежней. Согласно последним данным, одной из основных причин возникновения труднозаживающих ран является хронический окислительный стресс, при котором уровень АФК остается высоким в течение продолжительного времени. Окислительный стресс развивается из-за действия целого ряда факторов, характерных для большинства хронических ран: бактериального осеменения, локальной гипоксии тканей и старческих изменений. Для нормального ранозаживления требуется тонкий баланс между положительной ролью АФК и их потенциально деструктивным действием. В тканях раневой области происходит активное образование АФК, которые выполняют как бактерицидную, так и регуляторную функцию. Концентрация пероксида водорода в раневом экссудате на фазе воспаления достигает сотен микромолей на литр и затем постепенно снижается. В фазе регенерации АФК в низких концентрациях стимулируют образование грануляционной ткани и ангиогенез. После повреждения кожи микроорганизмы, находящиеся на ее поверхности, неизбежно попадают в ткани организма. Уничтожение микроорганизмов происходит на стадии воспаления, на которой используется богатый арсенал системы врожденного иммунитета. Однако, при недостаточно эффективной деконтаминации, воспалительная фаза продолжается, так как оставшиеся микроорганизмы продолжают вызывать продукцию цитокинов воспаления (IL-1, TNF) и хемокинов. При достаточно долгом влиянии микроорганизмов рана может войти в хроническую стадию воспаления, что ведет к повышенной активности матриксных металлопротеиназ (ММР), которые разрушают внеклеточный матрикс и дополнительно препятствуют ранозаживлению. АФК, продуцируемые иммунными клетками, нацелены на уничтожение микроорганизмов, однако их длительная повышенная продукция приводит к дополнительному повреждению тканей. На ранних стадиях раневые ткани всегда находятся в состоянии гипоксии. Это происходит из-за повреждения сосудов, что приводит к нарушению кровоснабжения, а также активному потреблению кислорода метаболически активными клетками. Временная гипоксия после повреждения запускает процесс ранозаживления, однако длительная или хроническая гипоксия приводит к нарушению этого процесса. Если оксигенация раны не восстанавливается, то процесс ранозаживления затягивается. Хронические раны всегда гипоксичны, для них характерно пониженное парциальное давление кислорода, от 20 до 5 мм рт.ст., тогда как в контрольных тканях это значение находится в диапазоне от 50 до 30 мм рт.ст. На молекулярном уровне гипоксия тканей приводит в первую очередь к нарушению окислительного фосфорилирования в митохондриях, что снижает выработку АТФ, необходимой для осуществления практически всех метаболических процессов в клетках. В частности, нехватка АТФ чревата нарушением работы кальциевых АТФ-аз и накоплением в клетках ионов кальция, что ведет к запуску внутриклеточных воспалительных каскадов. В результате высвобождаются цитокины воспаления и хемокины, привлекающие к месту повреждения иммунные клетки. Длительное уменьшение количества АТФ может приводить к дальнейшему нарушению функционирования митохондрий, повышенной продукции АФК и гибели клеток и тканей. Кроме того, гипоксия приводит к индукции экспрессии эндотелиальных молекул адгезии, таких как ICAM-1, VCAM-1, которые способствуют проникновению нейтрофилов и макрофагов к месту повреждения. Длительная экспрессия этих молекул приводит к нарушению разрешения воспаления за счет избыточной инфильтрации иммунных клеток. На гистологических срезах хронических ран также выявляются общие закономерности. Например, гистологическое исследование трофической язвы нижней конечности при варикозном расширении вен демонстрирует наличие утолщенного и находящегося в состоянии гиперплазии края эпидермиса, примыкающего к основанию язвы, покрытому экссудатом, содержащим некротический детрит. Большинство хронических ран плохо васкуляризованы, в них практически отсутствуют миофибробласты, но в большом количестве присутствует воспалительный инфильтрат, представленный в основном нейтрофилами. Для хронических ран также характерны избыточное накопление и активация тучных клеток вокруг кровеносных сосудов. Основные функции этих клеток иммунной системы связаны с аллергическими реакциями, но ТК также являются одним из ключевых инициаторов и регуляторов воспалительного процесса. Активация ТК сопровождается дегрануляцией с последующим выбросом во внешнюю среду содержимого внутриклеточных везикул, содержащих различные медиаторы воспаления, среди которых важнейшую роль играет гистамин. Гистамин вызывает увеличение проницаемости стенок сосудов и отек окружающих тканей, способствуя тем самым миграции лейкоцитов в очаг воспаления. С другой стороны, ТК секретируют основной фактор роста сосудов VEGF, способствуя прорастанию сосудов в область раны. Кроме того, ТК участвуют в завершающих стадиях ранозаживления и их избыточная активация может вызывать образование гипертрофированных рубцов. Для лечения хронических ран в клинике недавно стали применять антиоксиданты. Недавнее мультицентровое двойное слепое исследование на 200-х пациентах продемонстрировало эффективность применения пероральной смеси анти-оксидантов, аргинина и цинка для лечения пролежней. Еще одно двойное слепое исследование на 20-и пациентах с нарушенным заживлением ран показало эффективность пероральной смеси антиоксидантов (витамина С, а-токоферола, бета-каротина, цинка, селена и глутамина) по сравнению с плацебо (мальтодекстраном). Данные антиоксиданты способствовали скорейшей эпителизации раны. В отечественной литературе также описывается положительное действие приема антиоксидантов на процесс ранозаживления. Антиоксиданты стандартно назначаются при лечении венозных трофических язв, а также при иных патологиях. Таким образом, антиоксиданты при пероральном приеме могут быть успешно использованы для лечения труднозаживающих ран. При этом следует отметить несколько обстоятельств. Во-первых, количество клинических исследований пероральной эффективности антиоксидантов до сих невелико и требуются дальнейшие испытания. Во-вторых, зачастую в таких исследованиях одновременно использовалось несколько различных антиоксидантов, а также аминокислоты. Антиоксиданты различной химической природы могут иметь разнообразные биологические активности, и их совместное применение может приводить к разнообразным последствиям. Аминокислота аргинин, например, является субстратом для синтеза оксида азота II (N0), который вызывает вазодилатацию и имеет множество других физиологических активностей, включая антимикробное действие. В-третьих, нельзя исключить, что антиоксиданты не достигают раневой поверхности в значительных количествах и действуют опосредованно, влияя на системы организма. При этом, эффективность местного применения антиоксидантов изучена хуже. Одним из немногих примеров является мексидол, применяемый для терапии трофических язв. Митохондрии как источник АФК Основным источником экзогенных АФК при воспалении является НАДФН-оксидаза. Этот фермент присутствует как в фагоцитах, обеспечивая уничтожение микроорганизмов в очаге воспаления, так и в нефагоцитирующих клетках, принимая участие в регуляции различных внутриклеточных сигнальных путей. При окислительном стрессе, вызванном внешними окислителями, основным источником эндогенных АФК являются митохондрии. Основными формами АФК являются перекись водорода (Н202), радикал супероксид-аниона (О2-) и гидроксильный радикал (ОН-). За последние несколько лет произошел прорыв в понимании роли митохондриальных АФК в различных воспалительных процессах. В целом, окислительный стресс может вызывать воспалительный ответ, а избыточное воспаление, в свою очередь, вызывает окислительный стресс, что приводит к повреждению тканей и органов. Такой порочный круг описан, например, при активации инфламмасомы NLRP3. Эта инфламмасома типична для миелоидных клеток и ответственна за созревание IL-lbeta и IL-18. NLRP3 активируется под действием молекулярных образов опасности (DAMPs и PAMPs), которые в большом количестве присутствуют в ранах. Недавно было обнаружено, что митохондриальные АФК вызывают чрезмерную активацию NLRP3 и подавление АФК с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов снижает ее активацию. Митохондриальные АФК также принимают участие в патогенезе атеросклероза и гипертензии. В развитии окислительного стресса при ишемии-реперфузии первоочередную роль играет выброс митохондриями супероксид-аниона. Митохондриально-направленные антиоксиданты В лаборатории проф. В.П.Скулачева были созданы новые эффективные митохондриально-направленные антиоксиданты семейства SkQ. Они состоят из антиоксидантной части (пластохинона) и катиона, способного проникать через мембрану (рис. 1). Благодаря положительному заряду эти соединения избирательно накапливаются в митохондриях, что позволяет использовать их в крайне низких концентрациях. Высокая эффективность SkQ против широкого круга патологических состояний была подтверждена в многочисленных экспериментах на клеточных культурах и in vivo на моделях заболеваний человека с использованием лабораторных животных (см. обзор). Ключевые отличия митохондриальных антиоксидантов семейства SkQ от обычных антиоксидантов заключается в том, что они: 1) действуют непосредственно в месте образования АФК - во внутренней мембране митохондрий; 2) действуют многократно, при нейтрализации АФК они окисляются, а затем восстанавливаются дыхательной цепью митохондрий. Классические антиоксиданты выполняют свою функцию однократно. Окислившись, они превращаются в бесполезные, или даже токсичные соединения; 3) предотвращают окисление кардиолипина - ключевого регулятора апоптоза клеток. На основе SkQl были созданы глазные капли (Визомитин), данный препарат официально зарегистрирован как лекарственное средство от синдрома сухого глаза (ЛП-001355 от 13 декабря 2011 г.), в процессе клинические испытания по применению SkQl в лечении глаукомы, макулодистрофии и увеита. Большой комплекс доклинических экспериментов лекарственной формы SkQl - глазных капель «Визомитин» позволил провести 3 отдельных клинических исследования с участием пациентов, страдающих синдромом сухого глаза. Недостаток увлажненности глаза при этом заболевании ведет к повреждению эпителия роговицы. Важным клинически значимым параметром при медикаментозном лечении синдрома сухого глаза является эффективное восстановление целостности эпителия роговицы, т.е. заживление поверхностных повреждений. В клинических исследованиях, а именно открытое рандомизированное российское исследование 2-й фазы, мультицентровое двойное слепое плацебоконтролируемое исследование 3-й фазы и проведенное под эгидой управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) исследование в США показали выраженный эффект SkQl по ускорению заживления ран роговицы по сравнению с эффектом применения увлажняющих глазных капель того же состава, но без SkQl. SkQl ускоряет заживление полнослойных кожных ран у старых мышей. Для старых животных характерно нарушение репарационных процессов, что приводит к удлинению воспалительной фазы раневого процесса и к значительному замедлению заживления ран. В экспериментах на старых (24 мес.) самках мышей гибридов СВАхС57В1/6 наблюдалось значительное замедление сокращения площади ран на ранних этапах заживления (1—5 сут.). В опытной группе (п=10) животные перорально получали SkQl в суточной дозе 100 нмоль/кг веса в течение 8 мес. начиная с 16-ти мес. возраста. Динамика сокращения площади ран у старых мышей, получавших SkQl, была практически идентична динамике, наблюдавшейся у молодых животных (рис. 2, а). Гистологический анализ ран на 7-е сутки показал, что в группе молодых животных область повреждения была целиком заполнена грануляционной тканью, а у старых мышей очаги формирования грануляций были расположены только по краям раны (рис. 3, а). У старых мышей, получавших SkQl, обильно васкуляризованная грануляционная ткань заполняла практически всю область раневого дефекта, в ней располагались более зрелые и регулярно ориентированные коллагеновые волокона, реже встречались очаги лейкоцитарной инфильтрации. Прием SkQl повышал содержание миофибробластов в грануляционной ткани, что, по-видимому, ускоряло ее созревание. Морфометрический анализ выявил значительное снижение объемной плотности сосудов в грануляционной ткани у старых животных по сравнению с молодыми. Значение этого показателя у старых мышей, получавших SkQl, достоверно повышалось, и было сопоставимо с объемной плотностью сосудов в ранах молодых животных. Этот эффект SkQl во многом способствовал заполнению поврежденной области грануляционной тканью, поддерживая ее оксигенацию и питание. У старых животных наблюдалось замедление эпителизации раны, при этом SkQl вызвал значительное ускорение этого процесса, не влияя на толщину эпидермиса. Никакого эффекта SkQl на толщину рубца также не было обнаружено. В целом, динамика заживления ран у старых мышей, получавших SkQl, напоминала таковую у молодых животных. Анализ воспалительного процесса выявил значительное усиление нейтрофильной инфильтрации ран у старых мышей по сравнению с молодыми, a SkQl вызвал достоверное снижение числа нейтрофилов. У старых животных наблюдалось заметное снижение макрофагальной инфильтрации по сравнению с молодыми на 7-е сут. заживления, а на 13-е сут. число макрофагов в ранах старых мышей примерно в 2 раза превышало его значение у молодых. В ранах старых мышей, получавших SkQl, численность макрофагов на 7-е сут. значительно возрастала и сохранялась на том же уровне и на 13-е сут. Таким образом, полученные результаты указывали на нормализацию воспалительной фазы заживления ран у старых животных под действием SkQl. SkQl ускоряет заживление полнослойных Формирование незаживающих ран является одним из основных осложнений при диабете. В качестве модели этой патологии были использованы мыши линии C57BL leprdb (db/db) с врожденным диабетом 2-го типа. Длительный прием SkQl не снижал основных признаков диабета (гипергликемия, ожирение, полиурия) у этих мышей, но снижал выраженность маркеров окислительного стресса. Заживление ран у диабетических мышей было резко замедлено по сравнению с гетерозиготными животными (C57BL lepr db/+). Мыши опытной группы (n=8) ежедневно получали SkQl перорально в дозе 250 нмоль/кг веса в сутки в течение 12 недель, начиная с 10-недельного возраста. Прием SkQl практически полностью нормализовал заживление ран у db/db мышей (рис. 2, b). Гистологический анализ ран выявил у db/db мышей те же патологические изменения, что и у старых животных. SkQl вызывал нормализацию как формирования грануляционной ткани, так и воспалительной фазы процесса. Особо ярко был выражен эффект стимуляции ангиогенеза под действием SkQl. У db/db мышей не наблюдалось заметного торможения эпителизации раны, но и в этом случае SkQl заметно ускорял процесс. Аномально длительная воспалительная фаза раневого процесса продолжалась у db/db в той же степени, что и у старых животных, а прием SkQl ее нормализовал. Вероятно, окислительный стресс, сопровождающий диабетическую патологию, во многом определяет затрудненное заживление ран. SkQl значительно ускорял образование грануляционной ткани у диабетических мышей, не вызывая при этом гипертрофии рубцевой ткани (рис. 3, b). Локальное введение SkQl ускоряет репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у крыс В первой серии экспериментов крысам ежесуточно под кожу вокруг ран инъецировали 50 мкл 200 нМ раствора SkQl. Забор материала для гистологического анализа проводили через 7 часов, 1—3, 5 и 14 сут. Было обнаружено статистически значимое уменьшение площади раны на пятый день эксперимента. Подсчет количества нейтрофилов на ранних сроках заживления ран показал более чем двукратное уменьшение количества нейтрофилов через 7 час. В фазе созревания грануляционной ткани SkQl вызывал 3-х кратное увеличение количества миофибробластов, экспрессирующих гладкомышечный бета-актин. Во второй серии экспериментов крысам линии Sprague-Dawley на раны накладывали пленочное покрытие «Биоплен» с 0,019 мкг SkQl/r пленки. Смену пленок проводили один раз в 3 дня в течение 14 сут. Статистически значимое уменьшение площади раны по сравнению с контролем было обнаружено на 4-ый и 7-ой дни. Гистологический анализ на 14-е сутки эксперимента показал, что в затянувшихся к этому времени ранах у животных, получавших SkQl, содержатся более толстые пучки коллагеновых волокон, чем в контроле, что может быть связано с повышением активности миофибробластов. Исследования противовоспалительного действия SkQl in vivo Для старения характерен повышенный уровень системного воспаления. В экспериментах со старыми мышами было установлено, что длительный прием SkQl снижает воспалительную активацию эндотелия сосудов, измеренную по уровню экспрессии молекул адгезии. В модели синдрома острого воспалительного ответа вызванного внутривенным введением летальных или сублетальных доз фактора некроза опухолей (TNF). SkQl также снижал воспалительную активацию эндотелия. Интраперитонеальное введение SkQl не только понижало экспрессию молекул адгезии в эндотелии сосудов, но и предотвращало гибель мышей в этой модели. Подавление избыточной активации клеток эндотелия, по-видимому, является основным механизмом снижения нейтрофильной инфильтрации ран. Действие SkQl было исследовано также в моделях острого асептического воспаления. В первой модели воспаление индуцировали путем введения под кожу в межлопаточной области покровных стёкол. У мышей, которые получали SkQl в дозе 250 нмоль на 1 кг массы тела ежедневно с питьевой водой в течение 3 недель до операции, количество нейтрофилов в очаге воспаления, измеренное через 12 ч после операции, снижалось в 2 раза. Одновременно под действием SkQl существенно повышалось относительное содержание макрофагов, что указывало на ускоренный переход к макрофагальной стадии воспалительной реакции. Через 2 сут нейтрофилы практически исчезали из очага воспаления, как у мышей, которые получали SkQl, так и в контрольной группе. На более поздних сроках (5—14 сут) наблюдалось накопление фибробластов в очаге воспаления, причем SkQl существенно ускорял этот процесс. Во второй модели в межлопаточной области мышей формировали подкожные воздушные мешки и через 7 сут индуцировали в них острое воспаление инъекцией 1% раствора каррагинана. Эта модель является одной из общепринятых для доклинического исследования эффективности фармацевтических противовоспалительных препаратов и позволяет исследовать как клеточные, так и экссудативные реакции в очаге подкожного воспаления. У мышей, получавших SkQl по той же схеме, что и в предыдущей модели, содержание клеток воспаления в экссудате, полученном через 4 часа после введения каррагинана, было снижено почти в 2 раза по сравнению с контролем. Около 90% клеток в экссудате составляли нейтрофилы. Содержание основных провоспалительных цитокинов TNF и IL-6 под действием SkQl снижалось, но этот эффект был небольшим. Более выраженные эффекты SkQl наблюдались в той же модели, но при внутрибрюшинном введении препарата (250 нмоль/кг массы тела) ежедневно в течение 7 сут до индукции воспаления. Таким образом, SkQl вызывал снижение интенсивности привлечения нейтрофилов в очаг воспаления и, в меньшей степени, снижал продукцию провоспалительных цитокинов. В модели воздушного мешка было исследовано содержание клеток воспаления в выстилающих тканях. Было показано, что численность нейтрофилов в верхней внутренней выстилке «воздушного мешка» у мышей, получавших SkQl, была снижена в 1,5 раза по сравнению с контролем. В то же время относительное содержание моноцитов/макрофагов в выстилке у мышей, получавших SkQl было достоверно выше, чем в контрольной. Эти данные свидетельствуют о том, что SkQl способствует более быстрому переключению к макрофагальной стадии воспалительной реакции. В той же модели было исследовано влияние SkQl на содержание и активацию тучных клеток в очаге воспаления. В модели воздушного мешка было показано, что общая численность ТК и в особенности содержание дегранулирующих ТК в верхней внутренней выстилке была снижена у мышей получавших SkQl с питьевой водой. Как и в случае нейтрофилов, более выраженное влияние SkQl на содержание и степень активации ТК наблюдались в той же модели, но при внутрибрюшинном введении препарата. Исследования in vitro (см ниже) подтвердили подавление дегрануляции ТК под действием SkQl. Эти наблюдения позволяют предполагать, что SkQl эффективно понижает активацию ТК в ранах, что предотвращает гистамин-зависимое повышение проницаемости сосудов и отечность. Механизмы стимуляции регенеративных процессов под действием SkQl К настоящему времени установлено, что SkQl оказывает влияние как на воспалительную фазу рано-заживления, так и на пролиферативную стадию. Мишенями SkQl являются клетки разных типов, ответственные за ранозаживление. Ниже представлены основные результаты исследования механизмов действия SkQl на заживление ран in vitro (рис. 4). Для исследования механизмов действия SkQl на воспалительную активацию эндотелия были использованы культуры клеток эндотелия, активированные TNF, основным провоспалительным цитокином. Было установлено, что: 1) SkQl подавляет TNF-зависимую экспрессию молекул адгезии и их экспозицию на поверхности клеток. Как следствие, под действием SkQl снижается адгезия нейтрофилов к монослою клеток эндотелия. 2) SkQl подавляет TNF-зависимую экспрессию провоспалительных цитокинов. 3) SkQl предотвращает TNF-зависимое нарушение цитоскелета и разборку межклеточных контактов, что ведет к нарушению изолирующих свойств эндотелия. 4) Противовоспалительное действие SkQl определяется подавлением активности транскрипционного фактора NFkB, который контролирует экспрессию молекул адгезии и ММР-9, расщепляющий основной белок межклеточных контактов VE-кадгерин. 5) SkQl защищает клетки эндотелия от апоптотической гибели, вызванной высокими дозами TNF. Описанное выше противовоспалительное действие SkQl на эндотелий во многом объясняет снижение инфильтрации нейтрофилов в раны. Однако ускоренный переход к макрофагальной стадии воспалительной реакции наблюдавшийся под действием SkQl in vivo указывает на возможное участие митоАФК в регуляции активности нейтрофилов и других иммунных клеток. На иммунных клетках человека ex vivo было установлено, что: 1) SkQl стимулирует как спонтанный апоптоз нейтрофилов, так и, в особенности, апоптоз, частично подавленный под действием патоген-ассоциированных сигнальных молекул (РАМР) или сигнальных молекул, связанных с повреждением (DAMP). 2) SkQl подавляет активацию НАДФН оксидазы и связанный с этим окислительный взрыв при активации нейтрофилов компонентами, имитирующими бактериальные патогены. 3) SkQl ингибирует экзоцитоз (дегрануляцию) внутриклеточных везикул при активации нейтрофилов. Сходное подавление дегрануляции под действием SkQl наблюдалось в тучных клетках. 4) Структурно сходный с SkQl митохондриально-направленный антиоксидант MitoQ ингибировал продукцию провоспалительных цитокинов и повышению продукции противовоспалительных цитокинов (сдвиг к фенотипу М2) в макрофагах. Подавление активности нейтрофилов под действием SkQl может препятствовать их бактерицидному действию. В тоже время установлено, что высокие концентрации SkQl обладают антисептическим действием против широкого круга Грамположительных и Грамотрицательных бактерий. Таким образом, SkQl при локальном применении может способствовать уничтожению патогенных микроорганизмов в ране, компенсируя недостаток нейтрофилов. Исследования механизмов действия SkQl на прохождение пролиферативной фазы ранозаживления показали, что: 1) В культуре подкожных фибробластов человека SkQl вызывает дифференцировку части популяции (около 30%) фибробластов в миофибробласты. Этот эффект был связан с активацией TGFбета1, основного цитокина, регулирующего дифференцировку фибробластов. Вместе с тем SkQlпoдaвляeт накопление миофибробластов, вызванное избытком TGFбета1, ингибируя TGFбета1-зависимые сигнальные пути. Эти данные соответствуют отсутствию гипертрофированных рубцов и иных признаков фиброза у животных получавших SkQl; 2) SkQl стимулирует подвижность фибробластов в модели «раны» in vitro при гипергликемии]; 3) SkQl стимулирует ангиогенез in vitro благодаря активации в фибробластах TGFбета1 и стимуляции синтеза других факторов роста, приводящих к ускорению роста сосудов. 4) SkQl способствует ускорению эпителизации в модели «раны» в монослое клеток иммортализованной линии эпителия крысы, ускоряя миграцию этих клеток к краям «раны». Заключение: Митохондрии играют определяющую роль в формировании окислительного стресса, который является ключевым фактором патогенеза трудно-заживающих и хронических ран. Высокоэффективный митохондриально-направленный антиоксидант SkQl стимулирует заживление кожных ран, действуя на воспалительную и пролиферативную фазы ранозаживления в различных экспериментальных моделях in vivo и in vitro. Имеются основания полагать, что препараты для локальной терапии труднозаживающих ран на основе SkQl послужат эффективным средством борьбы с длительно незаживающими ранами у разных категорий пациентов, в том числе — при сахарном диабете, а также у пациентов с хроническими критическими состояниями и рецидивирующими инфекциями. Благодарности. Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда, проект № 14-50-00029 (разделы обзора с опытами на животных) а также при поддержке проекта РФФИ № 16-04-01074_а (разделы обзора с опытами in vitro). Отдельная благодарность А. Приходько за критическое прочтение текста и помощь в работе с рисунками.

Авторы:

Издание: Общая реаниматология
Год издания: 2018
Объем: 18с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.69-86. Библ. 63 назв.
Просмотров: 699