ПОДХОДЫ МИКРОФЛЮИДИКИ В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ

Аннотация:

Современные автоматизированные микросистемы на основе микрогидродинамических (микрофлюидных) технологий - лаборатории на чипах, - позволяют решать разнообразные академические и прикладные исследовательские задачи. В последние полтора десятилетия мы наблюдаем развитие этих подходов в приложении к проблемам современной количественной (системной) биологии развития. Здесь важны высокопроизводительные эксперименты, нацеленные на наработку больших объемов количественных данных для последующего их компьютерного анализа. В обзоре мы рассмотрим основные направления в разработках и приложениях микрофлюидных подходов для задач современной биологии развития на примере такого классического модельного объекта, как эмбрион плодовой мушки дрозофилы. Микрофлюидные устройства предоставляют возможность выполнять эксперименты, которые практически невыполнимы другими подходами. Такие устройства позволяют автоматизировано, быстро, надежно и правильно размещать много живых эмбрионов на подложке для параллельного конфокального сканирования, отсортировывать их, или инъецировать их различными агентами. Такие устройства позволяют, в частности, создавать контролируемые градиенты параметров микроокружения вдоль ряда развивающихся эмбрионов или, даже, скачок параметров в пределах микроокружения одного эмбриона, так что головная половина находится в других условиях по сравнению с хвостовой (при непрерывном сканировании). Такие подходы находят применение как в академических исследованиях функций генных ансамблей контроля раннего развития включая проблемы устойчивости ранних паттернов к возмущениям, так и в тест-системах для скрининга химических агентов на развивающихся эмбрионах. Мы обсудим вопросы интеграции микрофлюидных устройств в системы для автоматизированного выполнения экспериментов, параллельно на многих развивающихся эмбрионах, при их непрерывном сканировании средствами современной флуоресцентной микроскопии. Методы и подходы, отработанные на дрозофиле, находят свое применение в приложениях к другим модельным объектам, вплоть до эмбрионов млекопитающих. Ключевые слова: системная биология, количественная биология, биология развития, эмбриология дрозофилы, микрофлюидика, флуоресцентная микроскопия, автоматизация экспериментов высокопродуктивные параллельные эксперименты, генетика развития, дифференцировка морфогенез устойчивость процессов эмбриогенеза ВВЕДЕНИЕ. Понимание того, как биологические системы функционируют макроскопически в процессах дифференцировки и морфогенеза, и как это функционирование управляется микроскопической активностью на уровне клеточного сигналин-га и экспрессии генов, является ключевой задачей современной биологии развития. В современной биологии разработано немало эффективных подходов, включая непосредственные наблюдения за биологическими процессами в живых организмах (прежде всего, прижизненная флуоресцентная микроскопия), и компьютеризированные техники извлечения полезной информации из этих наблюдений. В частности, разработчики в биологической инженерии добились впечатляющих успехов в создании автоматизируемых микрогидродинамических (микрофлюидных) технологий, позволяющих выполнять высокопродуктивную экспериментальную работу, и решать задачи, которые просто невозможно было решить другими способами. Область автоматизированных микросистем на основании микрофлюидики для задач количественной и системной биологии развития1 развивается впечатляющими темпами и ее прогрессу посвящено немало обзоров (Whitesides et al., 2001; Beebeet al., 2002; El-Ali et al., 2006; Feng et al., 2009). Микрофлюидные установки для генерации химических градиентов концентрации и их приложения в исследованиях клеточного хемотаксиса и процессов биологического морфогенеза рассмотрены в обзорах (Kim et al., 2010; Кухтевич и др., 2015).Отдельные обзоры посвящены использованию микрофлюидики в исследованиях по клеточным проблемам сосудистой биологии (van der Meer et al., 2009), по нейробиологии (Wang et al., 2009; Taylor et al., 2010), по материалам и технологиям пространственно-трехмерных клеточных культур (Ziolkowska et al., 2011), по общим проблемам клеточной биологии (Salieb-Beugelaar et al., 2010; Webster etal., 2011; Кухтевич и др., 2013). Несколько обзоров посвящены приложениям микрофлюидики в академических и прикладных задачах биологии развития на ряде модельных объектов, включая эмбрионы дрозофилы (Feng et al., 2009; Fakhoury et al., 2009; Levario et al., 2016a). В этом обзоре мы освещаем недавние достижения в области разработок и эффективного применения микрофлюидных методов в экспериментальной работе с живыми объектами биологии развития на примере ранних эмбрионов плодовой мушки дрозофилы (Drosophila melanogaster). Наш обзор отличается от близких (Feng et al., 2009; Fakhoury et al., 2009; Levario et al., 2016a), как существенным количеством новых публикаций, так и вниманием именно к дрозофиле, как самому репрезентативному объекту и для этой области. Микрофлюидные устройства в биологических исследованиях. Микрофлюидика (микрогидродинамика) это прикладное научное направление, изучающее поведение жидкостей (и газов) на микроуровне, нашедшее применение в самых различных областях. Стремительное развитие микрофлюидики привело к разработке приборов (микрофлюидных систем), в которых осуществляется воспроизводимое управление течением жидкостного (и газожидкостного) потоков нанолитровых объемов в микроразмерных каналах (Whitesides et al., 2001; Beebe et al., 2002; Squires, Quake, 2005). Как результат, появилась возможность реализации методик анализа и создания приборов с отличными от макроаналогов техническими характеристиками. В частности, биологические и медико-биологические приложения микрофлюидики рассмотрены и в отечественных обзорах (Евстрапов и др., 2011а; Занавескин и др., 2012). Микрофлюидная система (микрофлюидное устройство) — это компактное устройство, которое оперирует небольшим количеством жидкости (нано/микролитровыми объемами), используя каналы с размерами десятки-сотни микрон. Течение в таких каналах, как правило, ламинарное, перенос масс осуществляется посредством диффузии (Bruus, 2006). В мировой литературе микрофлюидные системы зачастую называют как "лаборатории на чипах" (lab-on-chips). И ряд публикаций из журнала с таким названием (Lab on a Chip) обсуждаются в этом обзоре. Топология и конструкция микроустройства для исследования биологических объектов определяются теми операциями, которые планируется реализовать на нем. В простейшем случае микрофлюидные устройства представляют собой конструкцию из двух герметично соединенных пластин: на одной пластине формируются миниатюрных размеров каналы, реакторы, клапаны, электроды и другие функциональные элементы, другая пластина - защитная (Зимина, 2009). Общая схема изготовления микрофлюидного устройства рассматривается, например, в обзорах (Whitesides et al., 2001; Beebe et al., 2002; Евстрапов и др., 2011; Занавескин и др. 2012). Идея дизайна такого устройства на примере проблематики этого обзора приведена на рис. 1. Две особенности типичного микроустройства для работы с эмбрионами — это его интеграция с системой микроскопирования (обычно как компонента автоматизированного микроскопного столика) и технические решения, обеспечивающие успешное манипулирование именно с такими необычными микрообъектами как живые эмбрионы (обеспечение их кислородом, прежде всего). Важным моментом в обеспечении работы микрофлюидного устройства является организация движения потоков жидкости по микроканалам. Для простых устройств удобнее использовать внешние насосы (см рис. 1). Такая внешняя система подвода жидкости обеспечивает сборно-разборную конструкцию. Зачастую применяют программируемые шприцевые насосы, в этом случае подача и расход жидкостей задаются программой (Занавескин и др., 2012). Сегодня полимерные технологии играют ключевую роль в развитии микрофлюидных устройств. В частности, полидиметилсилоксан (ПДМС) - наиболее дешевый, он оптически прозрачен в широком диапазоне длин волн, является мягким эластомером и основным материалом для поисковых и инженерных исследований (Whitesides et al., 2001; Занавескин и др., 2012). Технологии изготовления микроустройств из эластичных ("мягких") полимеров типа ПДМС получили название "мягкой" литографии (soft lithography), она несложна в освоении и именно она преимущественно применяется в приложениях для эмбриологии. Отметим в заключение, что приложения микро-флюидики к задачам системной эмбриологии опираются на хорошо отлаженные технические разработки и хорошо себя зарекомендовавшие подходы. Так что их освоение биологами-экспериментатора-ми не представляет каких-либо серьезных методических трудностей. Микрофлюидика и системная эмбриология дрозофилы Эмбрионы дрозофилы являются одной из наиболее доступных моделей экспериментального эмбриогенеза, поскольку оплодотворенные эмбрионы откладываются и развиваются непосредственно в окружающей среде, тем самым облегчая манипулирование ими (Campos-Ortega, Hartenstein, 1985; Bate et al., 1993). Дрозофила - весьма удобный с генетической точки зрения объект, так как позволяет в лабораторных условиях получать мушек практически с любым мутантным геном, нокаутным (knockout) геном или геном-репортером (reporter fusion), делая легкодоступным изучение соотношений генотипа и фенотипа. Кроме того, у плодовых мушек короткий период развития (~ 24 ч на эмбриогенез и.~10 дней от оплодотворенного яйца до взрослой мухи), что позволяет проводить быстрые и масштабные исследования в области биологии развития, которые чрезвычайно сложно выполнять на более медленно развивающихся высших организмах. Тем не менее, дрозофила сложна в обращении для решения таких задач, как визуализация процессов развития, сортировка (сортинг) эмбрионов и микроинъекции эмбрионов. Эмбрионы дрозофилы — относительно небольшие (они имеют форму неправильных эллипсоидов, размерами, примерно 200 х 200 х 500 мкм), и традиционные методы включают трудоемкие ручные манипуляции. Для устранения этих ограничений, был сконструирован ряд микросистем (микроустройств), чтобы облегчить и автоматизировать такие задачи, которые часто лимитируют скорость и эффективность выполнения эксперимента в целом. Кроме того, микрофлюидные устройства были разработаны для управления микросредой, в которою помещен эмбрион, для того, чтобы локальными возмущениями в пространстве (локализованные изменения микроокружения эмбриона) и/ или пульсами во времени воздействовать на индивидуальное развитие. Перспективная цель подобных разработок — масштабные автоматизированные эксперименты со многими развивающимися эмбрионами параллельно (и так чтобы эмбрионы были на близких временах развития). В современной биологии и медикобиологии потребность в масштабных автоматизированных тестах на живых эмбрионах модельных организмов как целого растет год от года, и эмбрионы и личинки дрозофилы по-прежнему остаются наиболее удобными организмами для таких целей (Fakhoury et al., 2009; Delubac et al., 2012). Соответственно, именно прогресс в разработках микросистем, включающих микрофлюидные устройства, делает возможным проведение масштабных параллельных тестов на живых эмбрионах как для академических целей анализа механизмов эмбриогенеза, так и для скрининга химических агентов и биохимических соединений. В самом общем, контролируемые возмущения живых эмбрионов в микросистемах естественно разделить на внешние возмущения и внутренние (как представлено на диаграмме рис. 2). Внутренние возмущения включают использование генетических манипуляций (например, нокаутов генов или зависящих от температуры мутаций) или фармакологических а ентов с целью оценить их эффект на эмбриональное развитие. В частности, микроинъекции позволяют в достаточно определенный интервал эмбриогенеза оказать направленное возмущение молекулярных компонентов эмбриональных процессов (Fakhoury et al., 2009). Внешние же возмущения — это прямое изменение среды, непосредственно окружающей развивающийся эмбрион (рис. 2). Это достигается посредством различных воздействий, включающих механические, температурные, жидкостные и химические, с целью оценить их эффект на эмбриогенез (Lucchettaet al., 2006). Оставшаяся часть обзора организована следующим образом. В разделе 2.1 мы рассмотрим применение микрофлюидики для сортинга эмбрионов. В разделе 2.2 будут рассмотрены микрофлюидные устройства для микроинъекций в эмбрионы дрозофилы. В разделе 2.3 рассматриваются микрофлюидные устройства для регулярного расположения многих эмбрионов для параллельных экспериментов с ними и, в частности, для выравнивания эмбрионов для их визуализации. В разделе 2.4 дается обзор подходов к экспериментальному возмущению нормального эмбриогенеза средствами микрофлюидики. В разделе 2.5 мы обсуждаем интеграцию микрофлюидики с микроскопией плоскостного освящения. Наконец, раздел "Выводы и перспективы" завершает обзор.Микрофлюидика для сортинга эмбрионов. Полностью картированный геном дрозофилы и широкие возможности генетических манипуляций делают дрозофилу отличной моделью для изучения молекулярных механизмов регуляции генов (Spradling et al., 1999; Adams et al., 2000). В частности, генные ансамбли, задающие своей активностью разметку (паттерн) раннего эмбриона для последующей дифференцировки и морфогенеза, относятся к наиболее изученным регуляторным сетям в эмбриогенезе. Поэтому эти сети все чаще используются как тестовые системы в отработке новых подходов и проверке новых идей. В исследованиях молекулярных механизмов работы генов дрозофилы обычно используют му-тантные линии, но трудности при этом заключаются в том, что зачастую требуется отобрать 25% гомозиготных мутантов от остальных эмбрионов в опыте. Обычные методы требуют визуальной идентификации представляющих интерес эмбрионов и их изоляции вручную, что является трудоемким процессом. Поэтому задача автоматизации сортинга была одной из первых, которую попытались решить методами микрофлюидики (см рис. 1 и рис. 3). Принципиальная схема организации сортирующих микрофлюидных систем представлена на обсуждавшимся рис. 1. Используемые конкретные техники могут отличаться. Для облегчения процесса сортинга Фёрлонг с соавторами (Furlong et al., 2001) (лаборатория Солгарда, Solgaard) разработали микросистему, сходную по дизайну с системами поточной цитометрии, которая может автоматически отсортировать флуоресцентно-меченные эмбрионы дрозофилы. По пути несущего эмбрионы потока жидкости, каждый эмбрион проходит через детектор флуо-ресции и эмбрионы сортируется в зависимости от отсутствия или наличия флуоресцентной метки (сравни рис. 1). Конкретно Фёрлонг и его коллеги использовали магнитно-управляемый клапан, который открывает или перекрывает поток жидкости к "мусорной корзине" для сбора ненужных эмбрионов. Когда клапан открыт, эмбрион отсортировывался как "ненужный", когда клапан закрыт, эмбрион отсортировывается как "годный". Это устройство может автоматически сортировать порядка 15 эмбрионов в секунду, требуя только внесения суспензии эмбрионов на "вход" устройства. Ченом с соавторами (Chen et al., 2004) была предпринята разработка микрофлюидного сортировщика эмбрионов, не использующего механических клапанов. В основе разработки — манипуляции сортируемыми объектами посредством изменений давлений в системе микроканалов (рис. 3). Система сходящихся и расходящихся каналов была настроена так, что изменение давления в каналах контроля перебрасывало основной поток (несущий сортируемые эмбрионы) от одного отводного канала к другому, и обратно, при возвращении давлений к исходным, допоро-говым уровням (рис. 3). Этот подход к сортингу наглядно иллюстрирует оригинальные технические решения, представляемые микрофлюиди-кой, и поэтому именно его мы привели в качестве иллюстрации в этом разделе. Такой тип микрофлюидного сортировщика, как на рис. 3, перспективен для микроманипуляцией с разнообразными биологическими объектами, и может обеспечивать автоматические операции с высокой пропускной способностью и точностью. К сожалению, это направление до сих пор не получило продолжения. Таким образом, автоматическая сортировка эмбрионов, как одна из базовых составляющих в организации практически любого масштабного эксперимента в области современной системной биологии развития, эффективно решается средствами микрофлюидики и при этом не единственным способом. Микрофлюидики для микроинъекции в эмбрионы Прогресс системной биологии требует разработки техник точных, эффективных и контролируемых инъекций химических препаратов, ДНК, протеинов, энзимов, ионов, антител и метаболитов в живые эмбрионы (идея новых стратегий изображена на рис. 4а) (Fakhoury et al., 2009). В частности, весьма актуальны такие техники микроинъекций для высокопродуктивного скрининга интерферирующих РНК (РНКи, RNAi), поскольку утомительное ручное манипулирование при микроинъекции обычными способами становится лимитирующим фактором (Bernstein et al., 2004а). Соответственно, в этом направлении были предприняты успешные попытки автоматизации средствами микрофлюидики. Так, Заппе с соавторами (Zappe et al., 2006) впервые успешно осуществили такую разработку и выполнили тесты с инъецированием двухцепочечной РНК (double-stranded, dsRNA), комплементарной ДНК гена armadillo (из класса генов segment polarity). Почти 80% инъецированных эмбрионов развилиожидаемую реакцию на эту инъекцию - сильный фенотип потери функции (loss-of-function). Позднее группа Заппе (Delubac et al., 2012) в продолжение этих разработок (Zappe et al., 2006) сконструировала микрофлюидную систему с интегрированным мйкроинъектором для автоматизирования инъекций в эмбрионы дрозофилы (рис. 4в). Это микрофлюидное устройство автоматически извлекает эмбрионы из резервуара и доставляет их в микроинъектор при помощи "сдвигового течения" (sheath flow). Эмбрионы прокалываются микроиглой, когда они вталкиваются потоком в камеру микроинъектора, что эффективнее, чем ввод иглы в эмбрион (т.е., движутся эмбрионы, а не инъектор; как показано на рис. 4в). Видеокамера, нацеленная на "сайт" для инъекции, автоматически определяет наличие эмбриона и посылает микроинъектору команду выполнить инъекцию; после инъекции, эмбрион "выгружается" из микроинъектора в резервуар для сбора (также за счет потока жидкости). Делибак с соавторами (Delubac et al., 2012) показали эффективность этой системы экспериментами с инъекцией эмбрионам, экспрессирующим флуоресцентный белок eGFP, короткой интерферирующей РНК, действующей на eGFP (так что вскоре после инъекции флуоресценция эмбрионов прекращалась). В этих тестах, удавалось производить инъекцию одного эмбриона каждые 3-4 сек (231 инъецированных эмбрионов за 14 мин), с 90% успешного "глушения" флуоресценции эмбрионов. Разработка подходов к автоматическому инъецированию многих эмбрионов параллельно и на сравнимых временах эмбриогенеза особенно актуальна в задачах химического скрининга. Поэтому именно в этом направлении ожидаются дальнейшие разработки высокопродуктивных автоматических систем (как иллюстрируется рис. 4а). Как расположить живые эмбрионы правильными рядами ? Для количественного анализа функций генов в эмбриогенезе, особенно в масштабных генных и геномных исследованиях, крайне значимо иметь технические возможности быстро и эффективно располагать, и надежно иммобилизовать на соответствующем субстрате (подложке или пластине с лунками) живые эмбрионы в строгом порядке и с правильной ориентацией (см рис. 5 и рис. 6). Для количественного анализа экспрессии факторов, контролирующих последующие ранние морфогенезы как вдоль передне-задней оси (сегментация) (рис. 5а), так и дорзо-вентральной оси (гас-труляция) (рис. 56) необходимо, чтобы эмбрионы были как можно аккуратнее иммобилизованы под объективом микроскопа относительно этих главных осей эмбриона: паттерны экспрессии реально пространственно трехмерны и даже небольшие различия в положении относительно планаожидаемую реакцию на эту инъекцию - сильный фенотип потери функции (loss-of-function). Позднее группа Заппе (Delubac et al., 2012) в продолжение этих разработок (Zappe et al., 2006) сконструировала микрофлюидную систему с интегрированным мйкроинъектором для автоматизирования инъекций в эмбрионы дрозофилы (рис. 4в). Это микрофлюидное устройство автоматически извлекает эмбрионы из резервуара и доставляет их в микроинъектор при помощи "сдвигового течения" (sheath flow). Эмбрионы прокалываются микроиглой, когда они вталкиваются потоком в камеру микроинъектора, что эффективнее, чем ввод иглы в эмбрион (т.е., движутся эмбрионы, а не инъектор; как показано на рис. 4в). Видеокамера, нацеленная на "сайт" для инъекции, автоматически определяет наличие эмбриона и посылает микроинъектору команду выполнить инъекцию; после инъекции, эмбрион "выгружается" из микроинъектора в резервуар для сбора (также за счет потока жидкости). Делибак с соавторами (Delubac et al., 2012) показали эффективность этой системы экспериментами с инъекцией эмбрионам, экспрессирующим флуоресцентный белок eGFP, короткой интерферирующей РНК, действующей на eGFP (так что вскоре после инъекции флуоресценция эмбрионов прекращалась). В этих тестах, удавалось производить инъекцию одного эмбриона каждые 3-4 сек (231 инъецированных эмбрионов за 14 мин), с 90% успешного "глушения" флуоресценции эмбрионов. Разработка подходов к автоматическому инъецированию многих эмбрионов параллельно и на сравнимых временах эмбриогенеза особенно актуальна в задачах химического скрининга. Поэтому именно в этом направлении ожидаются дальнейшие разработки высокопродуктивных автоматических систем (как иллюстрируется рис. 4а). Как расположить живые эмбрионы правильными рядами ? Для количественного анализа функций генов в эмбриогенезе, особенно в масштабных генных и геномных исследованиях, крайне значимо иметь технические возможности быстро и эффективно располагать, и надежно иммобилизовать на соответствующем субстрате (подложке или пластине с лунками) живые эмбрионы в строгом порядке и с правильной ориентацией (см рис. 5 и рис. 6). Для количественного анализа экспрессии факторов, контролирующих последующие ранние морфогенезы как вдоль передне-задней оси (сегментация) (рис. 5а), так и дорзо-вентральной оси (гаструляция) (рис. 56) необходимо, чтобы эмбрионы были как можно аккуратнее иммобилизованы под объективом микроскопа относительно этих главных осей эмбриона: паттерны экспрессии реально пространственно трехмерны и даже небольшие различия в положении относительно плана главных осей эмбриона будут давать свою систематическую и неустранимую ошибку измерения (микроскопирования, сканирования) (Gregor et al., 2007; Kanodia et al., 2011; 2012; Reeves et al., 2012; Petkova et al., 2014). Именно микрофлюидика предоставляет такие возможности. Паттерн генов-регуляторов раннего эмбриогенеза дрозофилы вдоль дорзально-вентральной оси является одним из наиболее понятных и наиболее изученных, но экспериментальное изучение затруднено из-за утомительного ручного манипулирования, необходимого для расположения эмбриона под конфокальным микроскопом вертикально, (головным) концом к объективу (как на рис. 6в, 6г). Поэтому, одной из первых такого рода задач было автоматически поместить и закрепить ряд эмбрионов в вертикальном положении (т.е., "стоймя") относительно объектива микроскопа (см (Witzbergeret al., 2008)). Группы Луи Шварцмана (Chung et al., 2011; Levario et al., 2013) разработали микрофлюидную ловушку для эмбрионов, которая может автоматически ориентировать живые или фиксированные эмбрионы передним или задним концом к объективу, используя гидродинамику (рис. 6в, 6г). Гидродинамические силы в каналах микрофлюидной установки дают возможность ориентировать эмбрион дрозофилы требуемым образом (например, головным концом к объективу), используя анизотропность формы эмбриона (близкой к неправильному, деформированному эллипсоиду) (рис. 6в). Эта система позволяет правильно ориентировать для последующего конфокального микроскопирования несколько сотен эмбрионов в течение нескольких минут, что требуется для количественной оценки пространственной протяженности областей экспрессии регуляторных генов, участвующих в формировании дорзо-вентрального паттерна эмбриона. Недавно группы Луи Шварцмана (Levario et al., 2016b), в продолжение совместного проекта, разработали установку, которая интегрирует подходы микрофлюидики, автоматизированную обработку изображений и извлечение данных программными средствами на компьютере. Система была использована для количественного анализа реакции эмбрионов дрозофилы на кратковременное кислородное голодание (аноксия). Эта система использует микрофлюидику для того, чтобы правильно расположить и правильно ориентировать десятки живых эмбрионов, а затем, чтобы кратковременно, пульсом, через микроканалы подать к этим живым развивающимся эмбрионам жидкую среду без кислорода, тем самым поместив их в условия кратковременной аноксии. В результате, Леварио с коллегами (Levario et al., 2016b) количественно оценили вызванную аноксией задержку в эмбриональном развитии и детали динамики реакции эмбриона на аноксию (арест развития при аноксии и восстановление развития после аноксии). Сходное микрофлюидное устройство было недавно разработано группой Шварцмана (Levario et al., 2016а) для автоматического выравнивания живых эмбрионов с их латеральной ориентацией к объективу микроскопа для исследований паттернов генной экспрессии и последующих морфогенетических движений вдоль главной, передне-задней оси эмбриона. Более общая задача автоматического размещения (и удержания в условиях экспериментов) множества живых эмбрионов на субстрате (например, пластинке на предметном столике под объективом микроскопа) решалась в серии публикаций группы Салгарда (Bernstein et al., 2004а; 2004b; Zhang et al., 2005; 2006). Идея подхода заключалась в использовании небольших (под размер эмбриона) золотых подложек, размещенных регулярно на гидрофильной пластинке (рис. 66). При этом, каждая подложка для эмбриона покрыта каплей гидрофобного флюорокарбонового масла. В результате, эмбрионы из суспензии в буфере захватывались золотыми подложками за счет капилярных сил (и демонстрировали тенденцию к правильной ориентации, вдоль подложки), как иллюстрирует микрофото рис. 6а. Быстрое, точное и надежное автоматическое размещение живых эмбрионов регулярно на поверхности (подложке) или в ряд (со строгой их ориентацией) требуется во многих современных проектах системной биологии развития. Мы в этом разделе рассмотрели актуальность этой проблемы на примере задач регулярного размещения эмбрионов в ряд и вертикально к объективу для их параллельного конфокального сканирования и задач автоматического размещения множества живых эмбрионов на субстрате (регулярными рядами) (сравни рис. 5). Актуальной эта проблема является и для других задач, таких как параллельное инъецирование многих эмбрионов (сравни рис. 4а и рис. 6а, 66) или для тестов с рядами эмбрионов, развивающихся в условиях градиентов химических факторов (см раздел 2.5). Возмущения нормального эмбриогенеза средствами микрофлюидики Как отмечалось, одно из самых больших преимуществ микрофлюидики это то, что она дает возможность проводить эксперименты, которые чрезвычайно трудно или даже невозможно выполнить другими средствами. Уже упоминалось, что Леварио с соавторами (Levario et al., 2016b), использовали микрофлюидное выравнивание, чтобы временно подвергнуть живые эмбрионы дрозофилы аноксии и непрерывно отслеживать динамику реакции эмбрионов в in vivo посредством конфокального сканирования при вертикальной ориентации эмбрионов. Что еще более важно, микрофлюидные подходы способны обеспечить точный контроль выбора момента времени начала действия и продолжительности действия изучаемого фактора (например, температура или газовый состав), а также возможности локальных изменений микросреды по этому фактору (например, воздействию подвергается только головная или только хвостовая половинка эмбриона). Физические явления, которые контролируемо происходят в микрометровом масштабе, тем самым обеспечивают точный пространственный контроль микросреды. Потоки жидкости в каналах микрометровых ширин характеризуется ламинарными токами (см рис. 7). В ламинарном потоке, частицы жидкости движутся в соседних слоях рядом без конвективного перемешивания. Это означает, что диффузия существует только вдоль оси, перпендикулярной к направлению потока. Поэтому работа с микрофлюидными устройствами позволяет стабильно поддерживать резкий скачок и/или устойчивый градиент концентрации или температуры (поперек канала) на протяжении всего микрофлюидного канала. В лаборатории Исмагилова (Ismagilov) была разработана микрофлюидная система, позволяющая поддерживать половинки эмбриона (головную и хвостовую) в соседних стационарных ламинарных потоках буфера, отличающихся температурой (Lucchetta et al., 2005; 2006; 2008), как на рис. 7а. Устройство из ПДМС имеет "игрек-образную" форму, живой эмбрион крепился в канале вручную липкой лентой и буфер подводился от спаренных шприцевых насосов. Использование внешних механизированных поршневых насосов и систем охлаждения / подогрева позволяло поддерживать стационарно или быстро менять температуру буфера в этих соседних ламинарных токах. Ключевой эксперимент сводился к тому, что ранний развивающийся эмбрион подвергался перепаду температур вдоль его главной оси в течение заданного периода времени, после чего температура выравнивалась. (Напомним, что темпы развития эмбриона существенно определяются температурой). В этих неестественных условиях, когда головная и хвостовая половины эмбриона развивались при разных температурах и, соответственно,разными темпами, эмбрион как целое оказывался в состоянии в дальнейшем компенсировать эти различия и обеспечить нормальное развитие в значительном диапазоне экспериментальных возмущений температур и длительностей этих возмущений (Lucchetta et al., 2005; 2008). Авторы пришли к заключению (Lucchetta et al., 2005; 2008), что такой подход с локальными возмущениями температур можно трактовать как своего рода комплементарный к широко распространенным методам экспериментальных возмущений молекулярных компонент контроля раннего эмбриогенеза (нокаут определенных генов, мутации, включая чувствительные к температуре, инъецирование определенных макромолекул и ингибиторов, и пр.). В этой роли новый подход позволил сделать некоторые существенные заключения о механизмах устойчивости раннего эмбриогенеза на примере модельного объекта дрозофилы. Эти результаты говорят о том, что, эмбриогенез (включая ранний) в условиях постоянных возмущений окружающей среды, устойчив к этим возмущениям, плоть до таких маловероятных в природных условиях, как скачек температур в пределах одного эмбриона. Анализ результатов привел авторов, в частности, к новым заключениям о механизмах, обеспечивающих устойчивое развитие передне-задних паттернов экспрессии регуляторных генов раннего эмбриона. В частности, они пришли к выводу, что простая система перекрестных морфогенетических градиентов вдоль главной оси раннего эмбриона, скорее всего не является механизмом, лежащим в основе такой устойчивости (Lucchetta et al., 2005). Лукетта с коллегами (Lucchetta et al., 2008) использовали эту же экспериментальную технику в опытах на линии дрозофилы, экспрессирующей гибридный (fusion) белок Bicoid-GFP, и показали, что точный и воспроизводимый морфогенетический градиент бикоида не является необходимым для нормального эмбрионального развития . В свою очередь, это ставит вопрос о новых, еще не исследованных механизмах обеспечения устойчивости раннего эмбриогенеза в нестабильной окружающей среде. В частности, авторы пришли к заключению, что широко распространенная гипотеза, что градиент морфогенетического фактора бикоид формируется простой диффузией, не может объяснить устойчивое формирование передне-заднего паттерна раннего эмбриона. В последней из этой серии публикаций лаборатории Исмагилова обсуждаемая система была использована для исследования роли сигнального пути endo-siRNA в компенсации последствий температурных возмущений в эмбриогенезе дрозофилы (Lucchetta et al., 2009). В экспериментах с температурным скачком авторы показали, что белки DICER-2 и ARGONAUTE2 (а это интегральные факторы сигнального пути endo-siRNA) необходимы для устойчивого развития эмбриона в условиях температурных возмущений. Примечательно, что эмбрионы с нарушением этого сигнального пути развиваются нормально в нормальных условиях, но чувствительны к возмущениям и отклонениям температуры за пределы нормы. Охарактеризованная функция — новая для этого сигнального пути у дрозофилы, и авторы предполагают, что этот консервативный сигнальный путь может играть сходные роли у других видов, включая млекопитающих. В свое время, Лукетта с соавторами (Lucchetta et al., 2006) выяснили, в частности, что точность, правильность положения и воспроизводимость, с какой эмбрион вручную помещается в требуемое место канала микрофлюидного устройства, являются критичными для воспроизводимости таких экспериментов. Соответственно, используемые в этом подходе ручные манипуляции могут приводить к существенной невоспроизводимости результатов и, к тому же, требуют немало времени до начала эксперимента (а эмбрион при этом продолжает свое развитие). Более того, подобные системно-биологические эксперименты, нацеленные на сбор количественных данных с высокой воспроизводимостью и надежностью, нуждаются в возможностях работы не с одним, а с несколькими (в идеале - многими) эмбрионами параллельно, и это становится критичным для развития подхода в целом. В продолжение этого направления исследований, Дагани с соавторами (Dagani et al., 2007) реализовали (так называемую) самосборку микрофлюидного устройства с целью устранить утомительное размещение эмбрионов в микроканале вручную, как иллюстрируется схемами рис. 7. Подход, в свою очередь, основывается на статьях Жанга с соавторами (Zhang et al., 2005; 2006), где разработана техника для иммобилизации эмбрионов на субстрате "самосборкой" (рассмотрена в разделе 2.3). Конкретно ими использовались пластинки с гидрофобным покрытием, которое способно захватывать и удерживать эмбрион на пластинке (рис. 6а и рис. 7в, 7г). Кратковременная добавка в омывающий эмбрион буфер этанола позволяет быстро "смыть" эмбрион с его золотой подложки и тем самым завершить эксперимент с ним (Dagani et al., 2007). Эту технику Дагани с соавторами (Dagani et al., 2007) использовали в микрофлюидном устройстве (рис. 7в) для автоматизированных экспериментов с пространственным скачком температуры эмбриона, как и в опытах Лукетты с соавторами (рассмотренных выше). Используя съемку таймлапс (time-lapse) интерференционно-контрастной микроскопией авторы продемонстрировали, что температурные возмущения приводят к нарушениям морфогенетических движений у эмбрионов. Эта же исследовательская группа (группа Жанга, Zhang) продемонстрировала возможность и эффективность микрофлюидных экспериментов по скринингу химических соединений на живых эмбрионах в параллельных тестах (Fakhoury et al., 2009). Конкретно они использовали колхицин и цитохалазин Б и показали, что они нарушают целлюляризацию и эмбриогенез в условиях такого эксперимента. Такое устройство установки с двумя ламинарными токами позволяет быстро начать омывать эмбрион буфером с тестируемым химическим агентом и быстро это прекратить, переключив буфер. При этом, непрерывное микроскопирование в реальном времени позволяет точно датировать время эмбрионального развития и состояние эмбриона. Тестируемое соединение может быть добавлено в один из ламинарных токов или в оба, и, соответственно, обработке будет подвергаться или одна из половин эмбриона или он весь. Более того, техника позволяет подавать в один канал - одно соединение, а в другой - другое, тем самым анализируя синергизм или антагонизм их действия. Авторы полагают, что все эти возможности делают такую микрофлюидную технику тестирования химических соединений на развивающихся эмбрионах перспективной и требующей дальнейшего развития (Fakhoury et al., 2009). Описанные в этом разделе эксперименты лаборатории Измагилова (Lucchetta et al., 2005; 2008; 2009) по скачку температуры вдоль главной оси развивающегося эмбриона средствами микрофлюидики — наиболее известные в этой новой области системной биологии, тогда как дальнейшее развитие этого подхода группой Жанга (Fakhoury et al., 2009) демонстрирует его новые возможности и перспективы. Объединение микрофлюидики с микроскопией плоскостного освещения. В последние годы значительные успехи в оптических методах делают возможным микрокопирование в глубине интактных тканей с высоким пространственно-временным разрешением, получая на выходе объемные (3D) изображения с высокой детализацией (например, (Royeret al., 2016)). Одна из самых актуальных проблем для микрофлюидных технологий в биологии это — интеграция с различными техниками микроскопии и, в частности, с микроскопией плоскостного освящения (light-sheet microscopy). В микрофлюидных устройствах, предполагающих микроскопи-рование, обычно используются покровные стекла для микроскопии на той стороне устройства, которое обращено к объективу, но проблема в том, что покровные стекла вызывают сильные оптические аберрации при микроскопии плоскостного освящения. Не так давно МакГорти с соавторами (McGorty et al., 2015) разработали новую конструкцию микроскопа плоскостного освещения (selective plane illumination microscope), совместимую с микрофлюидными устройствами. Ключевым элементом разработки стала водяная призма, которая уменьшает оптические аберрации, вызываемые микроскопиро-ванием через покровное стекло под углом 45 градусов (рис. 8а). Микрофлюидное устройство (как и в большинстве разработок этого обзора), изготовлялось из ПДМС стандартной техникой мягкой литографии. Это устройство позволяет помещать в микроканал "цепочку" живых развивающихся эмбрионов (располагающихся один за другим и ориентированных главной эмбриональной осью вдоль оси канала) (рис. 8б-8в). Этот канал со всеми эмбрионами в нем (32 эмбриона в приводимом как пример эксперименте на вставке рис. 86) непрерывно сканируется целиком методом микроскопии плоскостного освящения, выдавая в итоге многочасовую (36 час) серию 3D данных сканирования (рис. 8в). Дыхание эмбрионов поддерживается, как и в других подобных микроустройствах, стационарным потоком буферного раствора с кислородом. Это микрофлюидное устройство, посредством сложной системы дополнительных микроканалов (рис. 86) поддерживает нарастающий градиент хлорида метилртути вдоль канала с эмбрионами, а этот химикат подавляет развитие центральной нервной системы (ЦНС) у эмбрионов. Для контроля развития ЦНС использовались линии эмбрионов с нейронами ЦНС, продуцирующими флюоресцирующий гибридный белок cGFP, так что при подавлении нейрогенеза не появляется сигнал от GFP. ЦНС развивалась лишь у тех эмбрионов, которые оказались в начале микроканала — в начале градиента концентрации хлорида метилртути. Такие интегрированные подходы к высокоэффективным экспериментам в сочетании микрофлюидных устройств с новыми разработками в микроскопии, в частности, микроскопии плоскостного освещения, позволяют в режиме реального времени наблюдать в динамике реакции живых развивающихся эмбрионов на контролируемые воздействия, так что получаемые в итоге 3D+t массивы данных дают возможность количественного анализа деталей эмбриогенеза. Мы убеждены, что рассмотренные здесь разработки МакГорти с соавторами (лаборатория Хуанга, Huang) послужат прототипами для следующего поколения интегрированных с микроскопией систем на основе микрофлюидики для новых высокопродуктивных количественных экспериментов в биологии развития, как в академических, так и прикладных областях. ВЫВОДЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ. В этом обзоре мы показываем, что новые подходы микрофлюидных технологий с помощью флуоресцентной микроскопии и благодаря привлечению методов компьютерной визуализации для автоматического извлечения данных позволяют масштабно увеличить эффективность и продуктивность экспериментов биологии развития (Levario et al., 2016а). В частности, мы имеем все основания ожидать что именно микросистемы на основе микрофлюидных техник позволят разрешить известные проблемы с оценками биологической вариабельности первичных морфогенетических градиентов (бико-ид и Dorsal) и непосредственных генов-мишеней этих градиентов в раннем эмбриогенезе дрозофилы (Houchmandzadeh et al., 2002; Spirov, Holloway, 2003; Crauk, Dostatni, 2005; Hollowayetal., 2006; Bergmann et al., 2007; Gregoret al., 2007; Heet al., 2008; 2015; Kanodiaet al., 2011; 2012; Reevesetal., 2012). Последние разработки лаборатории Шварцмана (Levario et al., 2016a; 2016b) явно нацелены на такие задачи. Широкое использование микрофлюидных технологий в биологии, в свою очередь, зависит как от разработки простых в обращении устройств, так и от разработок удобного программного обеспечения для автоматизации экспериментов (Levario et al., 2016а). В ближайшие годы мы ожидаем дальнейшего прогресса в области микросистем, включающих микрофлюидику, для академических и прикладных задач, так что распространенный термин "лаборатория на чипе" будет все более соответствовать своему названию по сути. Более того, ожидаемый прогресс в нано-элек-тромеханических системах (nano electromechanical systems, NEMS), включающих нанофлюидные устройства (Fakhoury et al., 2009; Евстрапов, 2011 в), позволит ставить задачи количественного анализа локального отклика процессов эмбриогенеза на локализованные возмущения и микроманипуляции (в сериях параллельных опытов на многих эмбрионах). Принимая во внимание, что современная биофото-ника позволяет успешно визуализировать отдельные макромолекулы и их комплексы и на живых объектах (и замерять сигнал от них количественно) (Raj et al., 2008; Little et al., 2013), мы ожидаем существенного прогресса именно на стыке нано-чипов и биофото-ники отдельных молекул. В частности, имеющиеся технические возможности инъецировать РНК (и другие молекулы) в отдельные клетки эмбриона (Zhang, Yu, 2008; Kieserman et al., 2008; Weisblat, Kuo, 2009), можно ожидать, позволят разработать микроустройства для прицельной инъекции в отдельные клетки раннего эмбриона (в параллельных экспериментах). Например, естественно было бы попытаться такими подходами трансформировать (отдельные) полярные клетки (клетки зародышевого пути) или получать мозаичные эмбриональные пласты и ткани. Помимо эмбрионов дрозофилы, микрофлюидные устройства разрабатываются для работы с живыми личинками дрозофилы (смотри (Levario et al., 2016а)) и для других модельных организмов биологии развития: нематода Caenorhabditis elegans (например, (Krajniak, Lu, 2010)), рыбка-зебра Danio rerio (например, (Choudhuryet al., 2012)), цветковое растение Arabidopsis thaliana (например, (Busch et al., 2012)) и даже эмбрионы мышей (например, (Esteveset al., 2013)). По всем этим модельным объектам мы отсылаем читателей для начального ознакомления к обширному недавнему обзору (Levario et al., 2016а).

Авторы:

Издание: Онтогенез
Год издания: 2018
Объем: 16с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.165-180. Библ. 85 назв.
Просмотров: 186