МИГРАЦИЯ ДНК-СОДЕРЖАЩИХ ОРГАНЕЛЛ МЕЖДУ МИКРОСПОРОЦИТАМИ ТАБАКА ПРИ ЦИТОМИКСИСЕ

Аннотация:

Выполнен ультраструктурный анализ межклеточной миграции ДНК-содержащихорганелл (ядер, митохондрий и пластид) в микроспорогенезе табака при цитомиксисе. Впервые показано, что мигрирующая часть ядра покрыта рибосомами и может содержать скопления ядерных пор. Впервые доказана возможность миграции митохондрий между клетками растений. Показано, что митохондрии крайне редко переходят в соседние клетки, при этом их перемещение происходит по одному цитомиктическо-му каналу. В свою очередь, пластиды могут образовывать скопления вокруг цитомиктических каналов и активно мигрируют между клетками, даже через цитомиктические каналы малого размера. Установлено, что пластиды могут переходить в другую клетку по одному или нескольким цитомиктическим каналам, также несколько пластид могут одновременно мигрировать через один канал. Обсуждаются последствия миграции ДНК-содержащих органелл в клетках, продуцирующих пыльцу. Ключевые слова: цитомиксис, микроспорогенез, цитомиктические каналы, Nicotiana tabacum, митохондрии, пластиды ВВЕДЕНИЕ. Цитомиксис это процесс миграции ядер или их фрагментов, а также других органелл между растительными клетками. Такая миграция становится возможной при образовании межклеточных каналов особого типа — цитомиктических каналов (ЦК), которые значительно превосходят по размеру плазмодесмы. Это явление широко распространенно в растительном мире и на сегодняшний день цитомиксис описан у сотен видов растений (см. обзоры Lone, Lone, 2013; Mursalimov et al., 2013). Межклеточная миграция ядер привлекает к себе внимание не только как уникальный клеточный феномен, но и как механизм, который может иметь эволюционное значение, поскольку, чаще всего, такая миграция выявляется в микроспороцитах — клетках, продуцирующих пыльцу и, в дальнейшем, гаметы. Существует несколько взглядов на причины и последствия миграции ядер между клетками. Часть авторов придерживается мнения, что цитомиксис это процесс, который приводит к селективной гибели клеток (Kravets, 2011; Barton et al., 2014). Другие исследователи склонны рассматривать цитомиксис как нормальную характеристику мейоза, которая встречается у многих (или у всех) видов растений. Сторонники этой точки зрения предполагают, что миграция ядер или их фрагментов между клетками, продуцирующими пыльцу, не приводит к их гибели или повреждению, а является причиной формирования жизнеспособных нередуцированных или анеуплоидных гамет (Falistocco et al., 1995; Ghaffari, 2006; Negron-Ortiz, 2007; Laviaet al., 2011; Pecrix et al., 2011). Именно эта точка зрения в последние годы получает все больше экспериментальных подтверждений. Было показано, что хроматин мигрирует между клетками окруженный неповрежденной ядерной оболочкой (Mursalimov, Deineko, 2011). Ядро может переходить в реципи-ентную клетку целиком, образуя двуядерный мик-роспороцит, или разделяться на несколько частей, образуя в реципиентной клетке одно или несколько микроядер (Farooq et al., 2014). Хроматин не проявляет признаков повреждения в момент миграции по ЦК и после попадания в реципиентную клетку. В клетках, вовлеченных в цитомиксис, не выявляются маркеры программируемой клеточной гибели (ПКГ) (Mursalimov et al. 2015). Также было показано, что у растений, с высокой частотой цитомик-сиса в мейозе, обнаруживается определенный процент нередуцированной пыльцы (Falistocco et al., 1995; Ghaffari, 2006; Negron-Ortiz, 2007). Несмотря на значительный прогресс в изучении цитомиксиса, до сих пор остается много вопросов о механизмах этого процесса. В первую очередь, возникают вопросы о функциональной активности хроматина, попадающего в другую клетку, и его дальнейшей судьбе. Установлено, что цито-миктичный хроматин не подвергается дополнительной гетерохроматизации и в нем присутствуют нормальные маркеры эухроматина, которые не исчезают после попадания хроматина в другую клетку (Mursalimov et al., 2015), однако неизвестно остается ли мигрирующее ядро функционально активным. Неизученным аспектом цитомикси-са также остается межклеточная миграция других компонентов клетки. Известно, что по ЦК могут переходить не только ядра или их фрагменты, но также и другие элементы клетки, такие как цитоплазма, фрагменты цитоскелета, различные везикулы и другие органеллы (Sumner, Remphrey, 2005; Wang et al., 2002, 2004; Wang et al., 2006). Миграция ДНК-содержащих полуавтономных органелл — митохондрий и пластид, привлекает к себе интерес в первую очередь. К. настоящему моменту миграция пластид в микроспорогенезе разных видов растений наблюдалась неоднократно (Feijo, Pais, 1989; Polowick, Sawhney, 1992; Sumner, Remphrey, 2005; Wang et al., 2002; Wang et al., 2006), но убедительных доказательств возможности миграции между микроспороцитами митохондрий предоставлено не было. Детальный анализ межклеточной миграции органелл возможен только с помощью электронной микроскопии, кроме того ультраструктурный анализ клеток с цитомиксисом может выявить морфологические особенности ядер, характеризующие их функциональное состояние. Таким образом, целью данной работы было с помощью ультраструктурного анализа выявить признаки функциональной активности цитомик-тичного ядра, установить возможность участия митохондрий в цитомиксисе, изучить ультраструктурные особенности пластид и митохондрий, мигрирующих через ЦК между микроспороцитами табака. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Растительный материал. В работе была использована линия табака SRI (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SRI, 2n=4x=48). Пыльники для фиксации и последующего анализа собирали с пяти индивидуальных растений. Все растения выращивали в условиях гидропонной теплицы с фотопериодом 16/8 часов (день/ночь) при температуре 22/18°С (день/ночь). Ультраструктурный анализ. Пыльники табака анализировали с помощью светового микроскопа и среди них отбирали содержащие микро-спороциты на нужной стадии мейоза. После чего пыльники нарезали на куски размером 2—3 мм и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом (Serva, Германия) в фосфатном буфере (рН 7.2—7.4) в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем материал промывали в ф ^сфатном буфере 3 раза по 10 мин, с постфиксацией в 1% растворе тетрао-киси осмия (Азурит, Россия) в течение 2 часов при комнатной температуре, и вновь промывали в фосфатном буфере 2 раза по 15 мин. Далее проводили дегидратацию этанолом в возрастающей концентрации. После этого образцы переносили в ацетон на один час и заливали в эпоксидную смолу Арал-дит (Fluka, Швейцария). Ультратонкие срезы толщиной около 80 нм получали на ультрамикротоме Ultracut UCT (Leica, Швейцария), после чего проводили двойное окрашивание цитратом свинца и уранил ацетататом (Serva, Германия). Окрашенные срезы исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Jeol JEM-1400 (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Микроскопирование проводилось на базе группы микроскопических исследований института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Подготовка материала выполнялась на базе центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Ультраструктурный анализ микроспороцитов табака проводился в первой профазе мейоза на стадии зиго-пахитены, когда ЦК уже сформированы и частота цитомиксиса максимальна. На рис. 1а представлена общая цитологическая картина миграции ядра между клетками через ЦК (стрелка). Все компоненты ядра (хроматин, ядрышко, ядерный матрикс) перемещаются между клетками, не покидая ядерной оболочки. Находясь внутри ЦК, хроматин испытывает сильное сжатие и выглядит как бесструктурная темная масса, однако после выхода из канала хроматин начинает восстанавливать свою исходную структуру (рис. 1а). Полученная картина совпадает с тем, что было описано для табака ранее и подтверждает гипотезу о сохранности мигрирующего хроматина (Mursalimov, Deineko, 2011). Однако использование больших увеличений позволило выявить новые детали этого процесса. На рис. 16 и 1в представлены фрагменты мигрирующего ядра, которые уже перешличерез ЦК и оказались в реципиентной клетке. Отчетливо можно видеть, неповрежденную двуслойную ядерную мембрану, которая окружает мигрирующее ядро, после выхода из ЦК. При этом содержимое мигрировавшей части ядра может быть различно. В некоторых случаях в реципиентную клетку переходит только ядерная оболочка без хроматина (рис. 16). В других случаях мигрирующая часть ядра содержит хроматин (рис. 1а, в). Следовательно, можно сделать вывод, что при цитомик-сисе через ЦК в первую очередь перетягивается ядерная оболочка, которая затем увлекает за собой все содержимое ядра, в том числе и прикрепленный к ней хроматин. При этом попадание хроматина в мигрирующую часть ядра происходит случайным образом, в зависимости от того, находится ли в этом участке ядра место заякоривания хроматина или нет. На поверхности мигрировавшего фрагмента ядра можно наблюдать большое количество рибосом (рис. 16, чёрные точки, отмеченные треугольными стрелками), которые, вероятно, прикрепились к ядерной оболочке уже после ее попадания вреципиентную клетку. В ряде случаев в мембране мигрировавшего фрагмента ядра выявляется большое количество ядерных пор (рис. 1в), которые являются ключевыми элементами ядерно-цито-плазматического транспорта и участвуют в большинстве синтетических процессов в клетке. Известно, что ядерные поры тесно связаны с белками ламины (ламиноподобными белками в случае растений) и распределяются по поверхности ядра неслучайным образом (Fiserova et al., 2009). Вполне возможно, что выявленное нами скопление (концентрация) ядерных пор в мигрировавшей части ядра также неслучайно, однако, этот вопрос требует дальнейшего исследования. Таким образом, выявленные нами скопления рибосом на поверхности ядерной мембраны и ядерных пор в оболочке мигрирующей части ядра, в совокупности с данными о сохранности хроматина, являются косвенными доказательствами функциональной активности ядер, вовлеченных в цитомиксис. Подобные наблюдения сделаны впервые. Миграция неповрежденного и функциональ-но-активного ядра или его фрагментов между клетками потенциально имеет эволюционное значение, так как может способствовать формированию анеу-, ди- и полиплоидных гамет (Falistocco et al., 1995; Ghaffari, 2006; Negron-Ortiz, 2007; Lavia et al., 2011; Pecrix et al., 2011). Однако, ядро является не единственной ДНК-содержащей органеллой клетки и межклеточная миграция пластид и митохондрий, также может нести определённые последствия для развивающихся клеток, особенно в том случае, если популяции этих органелл становятся гетерогенными, например, в результате мутаций (Aldridge et al., 2005). В микроспороцитах табака нам удалось наблюдать миграцию через ЦК митохондрий и пластид. Миграция митохондрий между клетками растений доказана и детально описана впервые (рис. 2а). Следует отметить, что эти события в значительной степени различались как по частоте проявления, так и по ультраструктурной организации самого процесса перемещения. Было показано, что межклеточная миграция митохондрий является крайне редким событием, и, несмотря на тщательный анализ большого количества образцов, нам удалось наблюдать лишь единичные случаи такой миграции. Во всех наблюдаемых случаях одна митохондрия мигрировала только по одному ЦК (рис. 2а). После сжатия в ЦК митохондрии восстанавливают свою исходную структуру в реципиентной клетке без каких-либо видимых изменений или повреждений во внешней и внутренней мембране. В целом митохондрии, вовлеченные в цитомиксис, не имеют видимых отличий от остальных митохондрий микроспороцитов. На данной стадии мейоза для них характерны небольшой размер и слабое развитие внутренней структуры (Polowick, Sawhney, 1992). Нормальная структура митохондрий в клетках с цитомиксисом подтверждает сделанные ранее выводы об отсутствии маркеров ПКГ (Mursalimov et al., 2015). В отличие от митохондрий, миграция пластид между микроспороцитами растений ранее была неоднократно описана у разных видов растений, однако детального ультраструктурного анализа этих органелл в ходе процесса межклеточного перемещения сделано не было (Feijo, Pais, 1989; Polowick, Sawhney, 1992; Wang et al., 2006). Кроме того, авторы не всегда верно толковали наблюдаемую картину. Так, например, Ван с коллегами (Wang et al., 2006) ошибочно объясняли нахождение пластид внутри межклеточных каналов не миграцией органелл, а образованием временных мостов между пластидами соседних клеток через ЦК для "межклеточной коммуникации пластид". Также авторы полагали, что пластиды не могут мигрировать через ЦК, размер которых не превышает плазмодесмы (10—80 нм) (Wang et al., 2006). Однако, как мы показали ранее, это утверждение также ошибочно — миграция пластид между микроспороцитами табака возможна при размере каналов 40—50 нм (Mursalimov et al., 2010). Кроме того, ранее предполагалось, что одним из возможных путей появления пластид внутри ЦК может быть заключение органелл в клеточную стенку в момент деления клетки (Wang et al., 2006), что нам также представляется маловероятным. В нашей работе мигрирующие пластиды выявлялись практически во всех изученных микроспо-роцитах табака. Пластиды на изучаемом этапе мейоза малого размера, слабо дифференцированы и не имеют сложной внутренней структуры и включений (Rashid et al., 1982; Polowick, Sawhney, 1992). Весьма интересен тот факт, что в микроспороцитах табака пластиды часто образуют скопления вблизи ЦК (рис. 26). При этом их миграция может происходить тремя разными способами: одна органелла переходит через один канал (рис. 26,2д), две или более органелл одновременно переходят через один канал (рис. 2в, 2г) и одна органелла переходит в другую клетку сразу по нескольким близкорасположенным каналам (рис. 2е, 2ж). Последний случай следует выделить особо. Наши наблюдения позволяют предположить, что в процессе миграции через несколько ЦК единичная пластида может разделяться на несколько частей, а затем вновь сливаться воедино в реципи-ентной клетке, что говорит о чрезвычайно высокой пластичности этих органелл. Мы допускаем, что из-за ограничений, накладываемых ультраструктурным анализом, возможна иная интерпретация наблюдаемой картины. Однако, учитывая большое количество проведённых наблюдений, предлагаемая нами версия представляется достаточно убедительной, хоть и отображает необычные, ранее не описанные свойства пластид. В большинстве случаев видимых повреждений или изменений в структуре мембран пластид в результате межклеточной миграции не обнаруживалось. Однако, в некоторых случаях мы наблюдали миграцию через ЦК аномальных пластид с инвагинациями (рис. 2д). Подобные изменения в структуре пластид обычно являются симптомом их деградации (Parra-Vega et al., 2015). Появление пластид с инваги-нациями мембран неоднократно было описано в нормальном мейозе разных видов растений, без связи сцитомиксисом (Rashid et al., 1982; Gonzalez-Melendi etal., 2008) и, маловероятно, что появление аномальных пластид является следствием сжатия внутри ЦК. По нашему мнению, сначала в пластидах появляются инвагинации, а уже затем они мигрируют через ЦК. Дальнейшая судьба пластид с инвагинациями известна — инвагинации в мембранах увеличиваются, как показано на рис. 2е (звездочка), что приводит к формированию аутофагических структур на основе пластид, что, однако, не является признаком повреждения клеток или маркером ПКГ (Parra-Vega et al., 2015). Появление подобных структур в ходе нормального мейоза связывают с перестройками в цитоплазме клетки в связи со вступлением в мейоз (Rashid et al., 1982). Интересно отметить, что митохондрии не образуют аномальных структур и, по всей видимости, не участвуют в аутофагических процессах как в мейозе табака, так и у других видов (Parra-Vega et al., 2015). Следует отметить, что никаких морфологических признаков ПКГ (конденсация хроматина, инвагинации ядерной оболочки и т.д.) в клетках с цитомиксисом обнаружено не было. При изучении микроспорогенеза табака помимо миграции нормальных пластид, китайские ученые также наблюдали миграцию "пластидободобных тел" — темноокрашенных пластид без внутренней структуры (Wang et al., 2006). В нашей работе существование подобных структур в микроспорогенезе табака подтверждено не было. Таким образом, установлено, что в микроспорогенезе табака миграция митохондрий происходит крайне редко. И, если судить по тому, что нам впервые удалось детально описать этот процесс, это верно и для других видов растений. В тоже время миграция между клетками пластид выявляется часто и это не может быть простой случайностью. Можно предположить два возможных объяснения таким различиям. С одной стороны, пластиды могут быть более мобильны и пластичны, чем митохондрии, что обеспечивает им легкое прохождение через каналы, как, например, было представлено на рис. 2ж, где одна пластида переходит сразу через три канала одновременно. Кроме того, митохондрии могут быть тем или иным образом заякорены в цитоплазме, взаимодействуя с элементами цитоскелета или другими компонентами клетки. С другой стороны, можно предположить, что пластиды могут активно и целенаправленно мигрировать между клетками. Однако цель такой миграции определить сложно. Известно, что даже при однородительском наследовании пластид по женской линии, с небольшой частотой мужские пластиды все же попадают в зиготу (Yu, Russell, 1994; Thyssen et al., 2012a). Однако, чтобы миграция пластид между клетками имела смысл нужно допустить, что микроспороциты в локуле пыльника неравноценны. Например, часть из них может быть выведена из мейотического деления в результате непрохождения контрольных точек мейоза. В таком случае можно допустить, что питательные вещества и часть клеточных органелл, в том числе пластиды могут быть перенаправлены в активно развивающиеся клетки, в ущерб поврежденным. Такие возможности предоставляют ЦК, намного превосходящие по размерам плазмодесмы и объединяющие ци-топлазматическими мостами большинство микроспороцитов в локуле пыльника (Кравец, 2012, 2013). Однако, в данном случае непонятно, почему митохондрии практически не участвуют в процессах межклеточной миграции и перераспределения. К тому же было показано, что клетки, вовлеченные в цитомиксис, не проявляют признаков повреждения или ПКГ (Mursalimov et al., 2015). Межклеточного миграцию органелл также удавалось наблюдать не только в тканях развивающегося пыльника, но и в вегетативных органах растений, например, в меристематических клетках (Guzicka, Wozny, 2005). Возможным объяснением присутствия цитомиксиса в вегетативных тканях является реорганизация пластидной популяции клеток. Особенно ярко этот феномен проявляется при срастании гетерогенных тканевых трансплантатов. Показано, что при сращивании трансплантатов табака, несущих разные селективные маркеры в ядерном и хлоропласт-ном геноме, постепенно происходит перенос генетического материала трансплантатов через зону срастания, что проявляется в присутствии в клетках в зоне срастания селективных маркеров обоих типов (Stegemann, Bock, 2009; Thyssen et al., 2012b; Fuentes et al., 2014). Предполагается, что в данном случае между клетками трансплантатов происходит миграция пластидной ДНК, несущей селективные маркеры (Stegemann, Bock, 2009; Thyssen et al., 2012b; Fuentes et al., 2014). Однако авторы этих работ не могут объяснить механизм переноса пластидного генома через плазмодесмы. Опираясь на наши результаты, мы можем обоснованно предполагать, что в зонах срастания трансплантатов образуются ЦК, сходные с тем что мы наблюдаем в развивающемся пыльнике, через которые возможна миграция органелл. То есть, в указанных экспериментах, между клетками трансплантатов происходит перенос не части пластидного генома, а целых пластид с помощью цитомиксиса. Интересно отметить, что в работах по изучению тканевых трансплантатов авторы показали отсутствие или минимальную возможность переноса селективных маркеров, принадлежащих митохондриям (Thyssen et al., 2012b), что совпадает с нашими наблюдениями на микроспороцитах. Важным вопросом является механизм межклеточной миграции органелл. Маловероятно, что митохондрии и пластиды пассивно перетекают через ЦК, которые меньше их по размеру, тем более это касается ядра. Наиболее вероятно, что перемещение органелл через ЦК — это активный процесс, осуществляемый с участием цитоскелет-ных структур. Как известно из данных, представленных в научной литературе, мигрирующее ядро, а также другие органеллы контактируют с большим количеством нитеобразных структур (Zhang et al., 1990), однако идентифицировать их до сих пор не удалось. Анализ динамики тубулинового цитоске-лета в мейозе растений табака не выявил участие микротрубочек в цитомиктичной миграции ядер (Sidorchuk et al., 2007). В связи с этим, логично предположить, что основную роль в миграции органелл при цитомиксисе играет не тубулиновая, а актиновая часть цитоскелета растительной клетки. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что перемещение содержимого клетки по ЦК останавливается в присутствии цитоха-лазина В, который препятствует росту актиновых микрофиламентов (Zhang et al., 1985). Однако прямых доказательств участия актинового цитоскелета в цитомиксисе до сих пор нет, в первую очередь, из-за его высокой нестабильности и, связанной с этим, сложностью визуализации актинового цитоскелета в микроспороцитах растений. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно данным электронной микроскопии ядро, мигрирующее через ЦК, не проявляет каких-либо видимых признаков повреждения. В реципиентной клетке ядерная оболочка мигрирующего ядра покрыта рибосомами и может содержать участки скопления ядерных пор. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу сохранности функциональной активности ядра в ходе цитомиксиса. Впервые доказана и детально описана миграция митохондрий по ЦК между растительными клетками. Показано, что пластиды могут образовывать скопления вокруг ЦК и активно мигрируют между клетками, даже через ЦК малого размера. Выявлена способность нескольких пластид мигрировать одновременно через один ЦК, а также возможность одной пластиды мигрировать через несколько ЦК. Не выявлено каких-либо признаков повреждения митохондрий и пластид в момент миграции по ЦК и после попадания в реципиентную клетку. Полученные данные подтверждают идею о том, что цитомиксис это нормальный клеточный процесс, который может приводить к изменению генетического статуса вовлеченных в этот процесс клеток.

Авторы:

Издание: Онтогенез
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.181-188. Библ. 87 назв.
Просмотров: 138