ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ТЕЧЕНИЕ РАЗВИТИЯ

Аннотация:

Проведено исследование метаболизма меди у лабораторных крыс, получавших с пищей ионы серебра (Ag-диета) с первого дня жизни в течение 5, 20, 40 и 180 дней. В сыворотке крови измерены показатели статуса меди и получены данные о распределении ионов серебра в организме. Проведен сравнительный гистологический анализ срезов головного мозга, печени, почек и селезенки взрослых крыс, получавших Ag-диету в течение месяца или полугода. В клетках печени, как центрального органа, контролирующего метаболизм меди у млекопитающих, определены содержание меди и серебра, уровень экспрессии генов медь-транспортных белков, а также ферментативная активность купроэнзи-мов. Показано, что у взрослых крыс, получавших Ag-диету в течение месяца, показатели статуса меди падают почти до нуля. Напротив, у крыс, получавших с пищей серебро в течение полугода с первого дня жизни, эти показатели снижаются только в 2 раза. При этом уровень экспрессии генов, контролирующих гомеостаз меди, снижается. Экспрессия генов, кодирующих купроэнзимы, не меняется. Ферментативная активность церулоплазмина, основного медьсодержащего белка крови, снижается, активность клеточного купроэнзима СОД1 не меняется. В работе обсуждаются пути вмешательства серебра в метаболизм меди, и механизмы, компенсирующие это вмешательство. Данные могут помочь оценить последствия увеличения серебра в окружающей среде в связи с прогрессивным ростом использования наночастиц серебра во всех сферах деятельности человека. Ключевые слова: медь, серебро, метаболизм меди, пищевое серебро как экологический фактор, животная модель ВВЕДЕНИЕ. Функционирование живых систем в различных условиях окружающей среды обеспечивается существованием потенциальных возможностей их адаптации. Это касается всех организмов, находящихся на различных уровнях эволюции. Метаболическая система меди (МСМ) млекопитающих сложилась под влиянием множества факторов и благодаря своей многокомпонентности составляющих, которые обеспечивают поступление, транспорт, распределение, рециклизацию и выведение ионов меди (Prohaska, Gybina, 2004), представляет собой интерес с точки зрения исследования возможностей альтернативных механизмов функционирования в разных условиях, например, при увеличении поступления ионов серебра. Серебро обоснованно можно отнести к экологическим факторам, т.к. в последние десятилетия резко возросло содержание серебра в пище (потребление "серебряной" воды, дезинфекция питьевой воды, применение серебра для обеззараживания плавательных бассейнов и др.). К тому же наночастицы серебра широко используются для изготовления одежды с противогрибковыми свойствами, применяются в медицине для дезинфекции и обработки ожогов и ран, рассматриваются как перспективное терапевтическое средство против HIV-1 и опухолей (Elechiguerra et al., 2005; Liu et al., 2008; Medvetz et al., 2008; Payne, Ambrosio, 2009; Lansdown, 2010). Медь является важнейшим микроэлементом для всех организмов, которые имеют окислительный метаболизм. Вместе с железом и цинком она входит в тройку наиболее распространенных важных для млекопитающих переходных металлов (Lewinska-Preis et al., 2011). Медь задействована в клеточном сигналинге, а также является структурным и функциональным кофактором ключевых жизненно важных ферментов, обеспечивающих рост и развитие организмов (Hordyjewska et al., 2014). В то же время ионы меди при переходах Cu(I)«Cu(II) способствуют образованию активных метаболитов кислорода, которые обладают эффектом ионизирующего излучения (Armendariz et al., 2004). Дефицит и избыток меди в организме приводит к нарушению ее гомеостаза, что у человека становится причиной развития сердечнососудистых, нейродегене-ративных и онкологических заболеваний. Система, контролирующая гомеостаз меди млекопитающих (МСМ), высоко консервативна, включает интегральные мембранные и растворимые белки, которые транспортируют медь в состоянии Cu(I) (Gupta, Lutsenko, 2009; Band et al., 2010). MCM op-гано- и тканеспецифична и изменяется в течение онтогенеза (Пучкова, Платонова, 2003; Платонова и др., 2005; Пучкова, 2015). В поддержании гомеостаза меди в целом организме ключевую роль играет печень. В зависимости от периода развития млекопитающих различают два типа поддержания баланса меди, которые определяются как эмбриональный и взрослый типы метаболизма меди (Hurley et al., 1980; Платонова и др., 2004; Zatulovskaia et al., 2015). Ag(I) изоэлектронен Cu(I), поэтому он связывается транспортерами меди, снижая ее биодоступность (Petris et al., 2003; Choi et al., 2006), и встраивается в активные центры купроэнзимов, вызывая их инактивацию отчасти из-за того, что Ag(I), в отличие от Cu(I), не может быть окислен в водных системах (Скворцов и др., 2010; Ilyechova et al., 2011; Wilcoxen et al., 2011). Экспериментальный дефицит меди в течение беременности вызывает у плодов множественные нарушения в развитии (Shavlovski et al., 1995), а у родившихся животных — отдаленные нарушения в деятельности центральной нервной системы (Penland, Prohaska, 2004). Ранее нами было показано, что у взрослых крыс, содержащихся на Ag-диете в течение 30 дней, Ag всасывается в кишечнике, доставляется в печень, где встраивается в ключевой белок метаболизма меди церулоплазмин (ЦП), нарушая его третичную структуру и ферментативные функции: оксидазная активность в сыворотке крови падает до нуля (Клотченко и др., 2008; Ильичева и др., 2012; Ilyechova et al., 2014). Самки таких животных не дают потомства. Однако, у крыс, с момента рождения получавших Ag-корм в течение 180 дней, оксидазная активность и концентрация меди в сыворотке крови снижены только в 2 раза, концентрация иммунореактивного ЦП не изменяется, а в печени снижается транскрипционная активность генов белков метаболизма меди и сопряженных с ним белков обмена железа. Крысы этой группы производят здоровое потомство. Показано, что у них в кровотоке циркулируют 2 изоформы ЦП, отличающиеся третичной структурой и уровнем гликозилирования. Одна из этих изоформ секре-тируется не клетками печени (Ilyechova et al., 2014; Ilyechova et al., 2017). Остается неизвестно: на каком этапе постнатального развития в метаболизме крыс, выросших на Ag-диете, происходят перечисленные выше изменения. Чтобы ответить на этот вопрос были предприняты исследования, результаты которых представлены в данной работе. На фоне Ag-индуцированного дефицита меди у крыс с эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди определены количественные параметры статуса меди в сыворотке крови: концентрация меди, содержание иммунореактивного ЦП и оксидазная активность (Harvey et al., 2009), исследовано распределение ионов Cu(I) и Ag(I) по внутренним органам, а также изучена активность генов, ассоциированных с метаболизмом меди в печени. Полученные данные помогут оценить влияние хронической длительной пищевой экспансии серебра на гомеостаз меди млекопитающих. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Экспериментальные животные. Работа выполнена на потомстве белых беспородных крыс, полученном в виварии ФГБНУ "ИЭМ" от крыс из питомника "Рапполово" Ленинградской области. В помещении поддерживалась температура около 25 °С, влажность около 60%, световой режим сменялся автоматически каждые 12 часов. Все животные получали корм и водопроводную воду без ограничения. Содержание меди в рационе контрольных и опытных групп оставалось стандартным. С первого дня жизни крыс разделили на две группы. Группу 1 составили контрольные крысы. Группу 2 — крысы, вскормленные самками, которые с первого дня лактации получали с кормом AgCl (Ag-самки), а с 23-го дня жизни в течение 6-ти месяцев продолжавшие получать корм, содержавший AgCl. Содержание AgCl в корме составляло 50 мг на 1 кг массы тела животных в сутки. Животные, получавшие с пищей AgCl с момента рождения в течение 5, 20, 40 и 180 дней жизни, обозначены соответственно: Ag-5, Ag-20, Ag-40 и Ag-180 крысы. Кроме того, в рассмотрение были взяты взрослые животные, получавшие с пищей AgCl в течение 30 дней, обозначенные Ag-A30 крысы (А - adult) (рис. 1). В качестве контроля были использованы интактные животные из референсных групп. Животных умерщвляли путем смещения шейных позвонков, кровь собирали из шейных сосудов и извлекали органы. Сыворотку крови отбирали после образования сгустка центрифугированием при 2000 х g 10 минут. Биологические образцы хранили при —80 °С. Все манипуляции с животными, включая уход за ними, осуществляли в соответствии с действующими утвержденными правилами РФ (Министерство здравоохранения РФ, Приказ № 267, от 19 июня 2003 года; "Руководство по использованию лабораторных животных, Москва, 2005"). Исследования были одобрены комитетом по этике при Институте экспериментальной медицины (протокол № 2/13 от 27 июня 2013 года, ул. Академика Павлова, д. 12, Санкт-Петербург, 197376 Россия). Приготовление корма для Ag-диеты. Животные экспериментальных групп получали стандартный корм с добавкой ионов серебра (Ag-корм) в форме AgCl в среднем 50 мг на кг массы тела в день (Ilyechova et al., 2011). Введение ионов серебра с кормом в виде AgCl имеет некоторые преимущества по сравнению с внутрибрюшинным введением в виде AgN03 (Prybil et al., 1982). При использовании раствора AgN03 в желудке образуется AgCl и токсичные ионы NO,(—). Несмотря на низкую растворимость AgCl в воде, в желудочно-кишечном тракте ионы серебра, легко мобилизуются из AgCl, координирующими серебро маленькими молекулами, например, аминокислотами. Разработанный и применяемый нами метод введения с пищей серебра в виде соли AgCl является физиологичным, поскольку ионы Ag, абсорбируются в кишечнике, поступают в клетки печени и включаются в ЦП (Zatulovsky et al., 2012; Ilyechova et al., 2014). Расчет Ag-добавки производили, исходя из того, что крыса (250 г массы тела) потребляет около 30 г сухого корма в день, поэтому на каждый 1 кг корма добавляли 330 мг AgCl. Корм тщательно перемешивали и увлажняли дистиллированной водой (-1:1 вес/ объем). Для контроля равномерности распределения серебра определяли его концентрацию в ~100 мг случайных образцов, взятых из Ag-кор-мов. Средняя концентрация серебра была 1600 ± ± 160 мкг/Л (п = 4). Согласно стандартному отклонению, в корме, используемом для вскармливания животных экспериментальных групп, серебро было распределено довольно равномерно. Поэтому можно считать, что ежедневное потребление серебра было регулярным. В стандартном корме, содержание меди составило 12,5 мг/кг. Таким образом, в Ag-корме молярное отношение Ag/Cu равнялось -15. Получение субклеточных фракций печени крыс. Субклеточные фракции выделяли методом дифференциального центрифугирования. Образцы печени гомогенизировали на льду с помощью дезинтегратора Т10 basic ULTRA-TURRAX® (IKA, Германия) в буфере, содержащем 0.25 М сахарозу, 20 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, ингибиторы протеаз (буфер А). Для получения фракции митохондрий гомогенат последовательно центрифугировали 2 раза по 8 мин 800 х х g и 20 мин 12000 х g на центрифуге Microfuge® 22R (BeckmanCoulter, США). Полученный осадок ресуспендировали в буфере А и инкубировали с 1% раствором "Triton Х-100" в течение 20 минут на льду, после чего центрифугировали при 18000 х х g в течение 10 минут на той же центрифуге. Для выделения цитозоля постмитохондриальный су-пернатант центрифугировали при 18000 х g в течение 1 часа. Концентрацию белка в полученных клеточных фракциях измеряли методом Брэдфорда (Bradford, 1976). Определение активности ферментов. Оксидаз-ную и ферроксидазную активности ЦП определяли окрашиванием в геле после фракционирования в нем белков сыворотки крови о-дианизидином и ферроцином соответственно (Owen, Smith, 1961; Chen et al., 2004). Электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) в неденатуриру-ющих условиях. Для выявления ферментативной активности SOD1 в цитозоле печени крыс гель после нативного электрофореза инкубировали 15 минут в 0.1% растворе Nitro blue tetrazolium (NBT), приготовленном на 100 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.0. Затем гель отмывали водой и 15 минут инкубировали в темноте в 100 мМ калий-фосфатном буфере с добавлением 0,001% TEMED и 0.1% рибофлавина с последующим отмыванием водой. Просмотр геля осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора в течение 5—10 минут до появления полос белого цвета, соответствующих активности супероксид-дисмутазы (Vives-Bauza et al., 2007). Активность SOD3 в сыворотке крови измеряли спектрофотометрически, определяя степень торможения реакции окисления кверцетина (Костюк и др., 1990). Аутоокисление кверцетина проводили при комнатной температуре в 0.015 М фосфатном буфере (рН 7.8), содержащем 0.08 мМ ЭДТА и 0.8 мМ ТЕМЕД в конечном объеме 3.5 мл. Образцы сыворотки крови, разведенные в 1000 раз, вносили в объеме 0,1 мл. Реакцию начинали добавлением в среду инкубации 1,4 мкМ кверце-тина в 0,1 мл ДМСО. Оптическую плотность измеряли при длине волны 406 нм сразу после добавления кверцетина и через 20 минут прохождения реакции. Концентрацию SOD3 определяли по калибровочному графику зависимости степени инги-бирования реакции аутоокисления кверцетина от концентрации фермента. Иммуноблотинг. Для проведения иммуноблот-тинга белки, разделенные электрофоретически в 8, 10 или 12% ПААГ в нативных условиях или в присутствии SDS переносили на нитроцел-люлозную мембрану Amersham Hyperfilm™ ECL (GE Healthcare, США) в камере для переноса MiniTrans-Blot (BioRad, США). Качество переноса белков контролировали окрашиванием мембран раствором Ponceau S. Для "забивки" мембраны использовали 5% раствор белков обезжиренного молока, приготовленный на PBS и содержащий 0,1% Tween 20. Для выявления ЦП крысы использовали кроличьи специфические поликлональ-ные антитела к ЦП крысы, полученные методом, разработанным нами (Gaitskhoki et al., 1981). Содержание COMMD1 и металлотионеина выявляли с помощью коммерческих антител Santa Cruz Biotechnology (США). Для выявления SOD1 и СОХ использовали антитела Abeam (Великобритания). В качестве вторых антител использовали антикроличьи козьи или антикозьи ослиные иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена (Abeam, Великобритания; Santa Cruz Biotechnology, США). Иммунные комплексы визуализировали хемилюминесцентным методом с помощью набора Amersham ECL Western Blotting System (GE Healthcare, США). Иммуноэлектрофорез. Количественное содержание ЦП определяли методом ракетного иммуно-электрофореза в 1% агарозном геле как описано ранее (Zatulovskiy et al., 2012). После электрофореза гель высушивали и окрашивали о-дианизидином. Выделение тотальной клеточной РНК, обратная транскрипция (ОТ), полимеразная цепная реакция (ПЦР) и полуколичественный метод определения уровня специфических мРНК. Тотальную РНК выделяли с использованием коммерческого реагента TRIZOL (Ambion, "Thermo Scientific", США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию РНК в препаратах измеряли на спектрфо-тометре "NanoDrop 2000" ("Thermo Scientific", США). Степень очистки РНК от белков оценивали по отношению значений оптической плотности А260/А280. Нативность РНК в образцах контролировали методом электрофореза в 1,4% агарозном геле с бромистым этидием по соотношению 16S/28S РНК. Реакцию ОТ и ПЦР (состав инкубационных проб, температурный и хронометрический профили осуществляли, как описано ранее (Ilyechova et al., 2014). Транскрипционную активность генов взятых в рассмотрение белков метаболической системы меди оценивали полуколичественным методом, используя соотношение между квазистационарным уровнем мРНК данного гена и мРНК (3-актина, который экспрессируется во всех тканях и органах организма так, что доля его мРНК от тотальной мРНК примерно одинакова (Marone et al., 2001). Дизайн специфических праймеров осуществляли с помощью программы Primer-BLAST (NCBI, США) (табл. 1). ПЦР-про-дукты, полученные с помощью специфических праймеров, фракционировали в 1,4% агарозном геле с EtBr и анализировали с помощью программы Image J. Относительный уровень специфических мРНК определяли по содержанию мРНК (3-актина. Каждое значение получали трижды в независимых повторах ПЦР на кДНК, получаемых на образцах РНК, выделенных из грех животных в независимых экспериментах. Подготовка гистологических срезов органов крыс для морфологических исследований. Для проведения морфологических исследований материал фиксировали цинк-этанол-формальдегидом (Коржевский, Гиляров, 2006) с последовательной заливкой парафином. Полученные препараты мозга, печени, почек и селезенки окрашивали гематоксилином и эозином, эозином (на эозинофильные гра-нулоциты), толуидиновым синим, по Перлсу на железо (III). Верификацию присутствия в составе пигментных отложений серебра проводили при помощи последовательной обработки срезов растворами йода и тиосульфата натрия. Определение лейкоцитарной формулы крови крыс. Для определения лейкоцитарной формулы на предметное стекло наносили мазки крови из хвоста животных, высушивали их на воздухе и маркировали. Для фиксации мазков использовали раствор эозин-метиленового синего по Маю—Грюнвальду. Фиксированные мазки высушивали и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Количество форменных элементов подсчитывали в иммерсионной системе с использованием механического счетчика (Меньшиков, 1987). Измерение концентрации гемоглобина в крови крыс. Концентрацию гемоглобина измеряли с помощью коммерческого набора Hemoglobin (ELI Tech Group, Франция) в соответствии с протоколом производителя. Свежую цельную кровь с ЭДТА добавляли к реактиву Драбкина (0.6 мМ калия феррицианид, 0.76 мМ калия цианид, 1 мМ монофосфат калия), входящему в состав набора, в соотношении 1:250. В ходе двух последовательных реакций гемоглобин превращался в метге-моглобин, а затем в цианометгемоглобин. Оптическую плотность, характеризующую концентрацию цианометгемоглобина, определяли при длине волны 540 нм, концентрацию гемоглобина вычисляли по калибровочному графику стандартов цианометгемоглобина. Измерение концентрации металлов. Концентрацию металлов измеряли методом атомно-абсорб-ционной спектрометрии с электротермической атомизацией и Зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре "ZEEnit 650Р" (Analytik Jena, Германия). Образцы тканей взвешивали и растворяли в концентрированной HN03. Все образцы были приготовлены на деио-низованой воде, обработанной смолой Chelex-100. Статистическая обработка данных. Для обработки результатов исследования использовали статистический пакет SPSS9.0 (IBM, США). На столбчатых диаграммах данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием дисперсионного анализа с последующим применением posthoc критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони для сравнения трех, и более экспериментальных групп, и t-критерия Стьюдента для сравнения двух групп. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением теста Краскалла-Уоллиса. Значимыми принимали значения при /?<0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ. Эффекты хронической Ag-диеты в онтогенезе крыс. Исследовали 5-дневных (эмбриональный тип метаболизма меди), 20-, 40- и 180-дневных (взрослый тип метаболизма меди) контрольных и Ag-крыс. В ходе постнатального развития крысы обеих групп существенно не отличаются по весу (табл. 2), а также по показателям физического развития. У контрольных крыс к 40-му дню жизни концентрация меди в сыворотке крови достигает значений, характерных для взрослых (180-днев-ных) животных, что примерно в 2,5 раза превышает аналогичные показатели у 5- и 20-дневных крыс (табл. 2). При этом в течение всего эксперимента в сыворотке крови Ag-крыс растет концентрация серебра (табл. 2). У экспериментальных новорожденных крыс, как и у взрослых (Клотченко и др., 2008), серебро аккумулируется преимущественно в печени и в незначительных количествах обнаруживается в мозге (табл. 2). При этом существенных изменений в концентрации меди в органах Ag-крыс не выявлено. В течение первых дней развития, когда метаболизм меди характеризуется как эмбриональный, в печени как контрольных, так и Ag-крыс, концентрация меди растет и после перехода на взрослый тип метаболизма меди резко падает. В мозге концентрация меди растет примерно до половозрелого возраста и одинакова у животных обеих групп. Накопление серебра не приводит к дефициту меди в печени и мозге. В то же время, в сыворотке крови Ag-крыс к сороковому дню жизни происходит видимое снижение, по отношению к соответствующим значениям у контрольных животных, окси-дазной и ферроксидазной активностей (табл. 2). Оксидазная активность, важный показатель статуса меди, у 5- и 20-дневных контрольных и Ag-крыс не изменяется, у 40-дневных контрольных крыс в 1,5 раза выше, чем у их ровесников, содержащихся на Ag-диете а у 180-дневных контрольных животных — в 2 раза выше. Концентрация меди у Ag-180 крыс практически не отличается от таковой у контрольных животных (рис. 2а). Самая высокая концентрация меди найдена в печени, почках и сердце. В остальных взятых в рассмотрение органах концентрация меди ниже. Распределение серебра по органам у Ag-180 крыс неоднородно (рис. 26). Наибольшие количества серебра были обнаружены в клетках кишечника, которые в экспериментах действуют в качестве барьера между Ag-пищей, и внутренней средой организма. Заметное количество серебра накапливается в печени, селезенке и легких, а в мышечной и жировой (внутренний и подкожный жир) тканях накопление серебра незначительно. Эффект длительности Ag-диеты на метаболизм меди у взрослых крыс. Данные, полученные на крысах, которые получали с пищей серебро в течение полугода (Ag-180 крысы), на крысах, получавших Ag-корм в течение 30 дней с 5-го по 6-й месяцы жизни (Ag-A30 крысы) и контрольных животных приведены в таблице 3. Содержание меди в сыворотке крыс обеих экспериментальных групп по сравнению с контрольными животными снизилось, у Ag-A30 почти в 10 раз, а у Ag-180 в 1.3 раза. Концентрация серебра в крови крыс группы Ag-180 почти в 2 раза превышает ее значение у Ag-A30 животных. По данным иммуноэлектрфореза уровень иммунореактивных полипептидов ЦП в крови контрольных и обеих экспериментальных группах животных, Ag-A30 и Ag-180, не изменяется (табл. 3). В то же время, показатели оксидазной и ферроксидазной активностей ЦП в сыворотке крови Ag-180 крыс в два раза ниже, чем у контрольных, а у Ag-A30 крыс обе активности практически исчезают (табл. 3). Репродуктивная функция у Ag-180 крыс проявляется в том же возрасте, что и в контрольной группе животных (60—70 дней жизни). Они производят жизнеспособное потомство. Крысы группы Ag-A30 потомства не дают. Количество новорожденных в помете у Ag-180 крыс снижено, по сравнению с контрольной группой, почти в 2 раза, однако, их потомство проявило высокую жизнеспособность (табл. 3) и, находясь на Ag-диете во втором поколении, оставалось репродуктивным (данные не приводятся). Сравнительный анализ гистологических срезов головного мозга, печени, почек и селезенки выявил дополнительные различия между Ag-A30 и Ag-180. Головной мозг по структурной организации и развитию серого и белого вещества не отличается от нормы. Почки также не отличаются и не имеют морфологических признаков патологии (данные не приводятся). В печени Ag-A30 животных патологических изменений не зарегистрировано (рис. За). В то же время в печени Ag-180 крыс наблюдается выраженная пигментация стенки вен, проходящих в междольковой соединительной ткани (ветви воротной вены) и очаговые скопления черных гранул в макрофагах междольковой соединительной ткани (рис. 36 и Зв). После последовательной обработки срезов растворами йода и тиосульфата натрия обнаруженная пигментация исчезала, что свидетельствует о вероятном присутствии в стенке воротной вены преципитатов солей серебра и/или металлического серебра (рис. Зг). В междольковой соединительной ткани печени Ag-180 животных часто обнаруживались эозинофильные гранулоциты, что не типично для контроля. Гистологические срезы селезенки Ag-A30 крыс (рис. Зд) не отличались от контрольных срезов (данные не приводятся). В красной пульпе определялось небольшое количество коричневого пигмента. Среди клеток встречались одиночные эозинофильные гранулоциты (как правило, на границе с белой пульпой) (рис. Зж). При окраске по Перлсу в красной пульпе определялись многочисленные очаговые скопления железа. У Ag-180 животных при сохранении больших скоплений железа увеличен объем белой пульпы, больше эозинофильных гранулоцитов и черно-ко-ричневого пигмента по сравнению с контрольными животными (рис. Зе и Зз1». Очаговые скопления темного инфильтрата выявлены под кожей Ag-180-крыс (рис. Зи и Зк). Содержание гемоглобина в крови у Ag-180 крыс и животных контрольной группы одинаково: 128— 192 г/л, то есть колеблется в пределах нормальных значений (Sharp, LaRegina, 1998). Профиль лейкограммы крови показал, что у Ag-180 крыс по сравнению с животными контрольной группы достоверно повышается количество эозинофилов: 6.7 ± 2.5 и 3.4 ± 1.5 (р<0,05) соответственно, что согласуется сданными гистологического анализа. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, у Ag-крыс Белки МСМ печени крысы, гены которых взяты в рассмотрение. 1. Купроэнзимы. ЦП (ген Ср № 2387) — ферро-ксидаза, контролирует транспорт железа, и одновременно служит донором меди для клеток негепа-тоцитарных рядов: Ср (ЦП) и GPI-Cp (ГФИ-ЦП), секреторный и связанный с плазматическими мембранами посредством гликозилфосфатидилинози-толового якоря соответственно (Prohaska, 2011). Супероксиддисмутазы: Cu/Zn-SODI (ген Sodl № 3731) — ключевой фермент антиоксидантной системы клетки; Mn-SOD2 (ген Sod2 № 3732) — осуществляет антиоксидантную функцию в митохондриях (Zelko et al., 2002). Цитохром-с-оксида-за — СОХ (ген Cox4il № 683741) изоформа 1 субъединицы IV комплекса цитохром-с-оксидазы 1, необходимая для сборки функциональной структуры фермента (Richter, Ludwig, 2003). 2. Транспортеры меди. Высоко аффинный транспортер Cu(I) клеточной мембраны CTR1 (ген Slc31al № 620059) (Wang et al., 2011; Скворцов и др., 2012). Внутриклеточный низко аффинный транспортер меди CTR2 (ген Slc31a2 № 1307963 (Berghe et al., 2007). Медьтранспортные АТФ-азы PI типа: АТР7А (ген Atp7a № 2179), АТФ-аза Мен-кеса, обеспечивает встраивание меди в активные центры секреторных купроэнзимов; АТР7В (ген Atp7b № 2180), АТФ-аза Вильсона, обеспечивает экскрецию меди из клеток (Lutsenko et al., 2008). Си(1)-шаперон CCS (ген Ccs № 84485), доставляющий медь к SOD1 (Caruano-Yzermans et al., 2006). 3. Белки, поддерживающие гомеостаз меди в ци-тозоле. Металлотионеин, Mtla (ген Mtla № 3117), обогащенный цистеином белок, выступающий в роли донора и акцептора Cu(I)/Cu(II) (Nielsen et al., 2007). Белок цитозоля COMMD1 (ген Commdl № 1311771, контролирующий уровень меди внутри клетки путем ее экскреции (Fieten et al., 2012).В печени 5- и 20-дневных Ag-крыс транскрипционная активность исследуемых генов по сравнению с контролем не меняется (данные не приводятся). В печени 40-дневных Ag-крыс происходит достоверное снижение уровня мРНК, кодирующих Atp7b и Ccs (рис. 4а). К 40-му дню жизни у Ag-крыс не изменяется содержание иммуноре-активных полипептидов SOD1 и МТ1А (рис. 46). При этом снижается содержание белков COMMD1 и СОХ в цитозоле и митохондриях, соответственно. Содержание ЦП в крови повышается примерно в 2 раза. Анализ ферментативной активности купроэнзимов показал, что в сыворотке крови Ag-животных к 40-му дню жизни в два раза снижаются оксидазная и ферроксидазная активности ЦП (рис. 4в - а, б). Ферментативная активность SOD1 не меняется (рис. 4в - в). В печени Ag-180 крыс снижается уровень мРНК, программирующих синтез полипептидов Ctrl, Ctr2, Mtla, Commdl и Cox4il (рис. 5a). Уровень экспрессии других генов, взятых в рассмотрение, достоверно не изменяется. Эти данные согласуются с данными по выявлению соответствующих иммунореактивных полипептидов методом иммуноблотинга (рис. 56). Видно, что у Ag-180 содержание полипептидов ЦП, SOD1 и МТ не изменяется. Уровень COMMD1 и СОХ IV снижается. Уровень ферментативной активности SOD1 в цитозоле печени и мозга, а также в митохондриях печени практически одинаков (рис. 5в). Активность SOD3 в сыворотке крови Ag-180-крыс в два раза выше, чем у контрольных (155 ± 55 е.а./л и 68 ± 19 е.а./л соответственно). ОБСУЖДЕНИЕ В работе приведены данные, демонстрирующие динамику влияния хронической Ag-диеты на он-тогенез-опосредованное переключение эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый. Исследование выполнено на крысах с измененным статусом меди, которое достигалось благодаря развитию искусственного дефицита меди, вызванного Ag-диетой. С момента рождения в течение шести месяцев жизни Ag-крысы получали ионы серебра и не проявляли признаков токсикоза. Этот длительный эксперимент позволил сравнить эффекты воздействия поступающего с пищей серебра на различных этапах онтогенеза лабораторных крыс без полного или частичного блокирования поступления меди с пищей, а также сравнить эффекты продолжительности Ag-диеты на исследуемые параметры метаболизма меди у взрослых Ag-крыс: Ag-A30 и Ag-180. У крыс, получающих ионы Ag в составе ЦП молока (Ag-5 и Ag-20, эмбриональный и ранний период взрослого типа метаболизма меди соответственно) серебро снижает статус меди (табл. 2), но не влияет на метаболизм меди в печени и смену эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый. Содержание серебра в сыворотке крови соответствует уровню ЦП, в который включены атомы серебра. В течение первых дней развития в печени крыс всех групп концентрация меди растет и после перехода на взрослый тип метаболизма меди резко падает, как и у контрольных крыс. Перенос серебра в организме новорожденных происходит по тем же путям, которые использует медь. Накопление серебра не приводит к дефициту меди в печени и мозге Ag-животных. После 20-го дня жизни крысы наряду с молоком матери начинают потреблять и твердый корм с AgCl. С переходом на смешанное питание, а затем полностью на твердый корм, к 40-му дню жизни в сыворотке крови Ag-крыс, по сравнению с контрольной группой, происходят следующие изменения: снижение статуса меди в два раза (табл. 2), снижение активности генов медь транспортных и медь связывающих белков, участвующих в метаболизме меди {Atp7b, Ccs) (рис. 4а и 46). При этом ферментативная активность Sodl в цитозоле клеток печени этих животных остается неизменной (рис. 4в — в). Выявленные отличия некоторых параметров метаболизма меди у Ag-40 крыс по отношению к соответствующим показателям 5- и 20-дневных Ag крыс не влияли на их развитие. У Ag-180 крыс на фоне равномерного незначительного снижения содержания меди во всех взятых в рассмотрение органах увеличение содержания серебра произошло неравномерно (табл. 2, рис. 2). Содержание серебра в органах Ag-крыс, получающих серебро в течение длительного времени, значительно ниже, чем у взрослых крыс, подвергшихся воздействию Ag-диеты всего на протяжении 30 дней. Этот эффект может быть следствием экскреции серебра и образованием инертных Ag(0) гранул во внеклеточных пространствах, например, в коже (рис. Зк), что похоже на осаждение избытка меди в качестве Cu(0), характерное для болезни Вильсона (Ferenci, 1998). Анализ гистологических срезов печени и селезенки Ag животных выявил отличия от контрольных только у Ag-180 крыс (рис. 3). Статус меди у этой группы животных по отношению к их ровесникам из контрольной группы снизился в 2 раза. Следует отметить, что снижение статуса меди в 2 раза было отмечено нами и у Ag-крыс в возрасте 3 месяца (данные не приводятся). Содержание животных на Ag-диете до 6-ти месячного возраста (Ag-180 крысы) позволило сравнить эффекты длительного поступления серебра на метаболизм меди во взрослом состоянии с эффектами поступления серебра с пищей в течение 30 дней, которые выявляются у животных, получающих такую диету уже во взрослом состоянии (Ag-A30). У Ag-А30 крыс после месяца содержания на Ag-диете в сыворотке крови развивается недостаточность меди, ассоциированной с ЦП (Клотченко и др., 2008; Zatulovskiy et al., 2012; Ильичева и др., 2012; Ilyechova et al., 2014). В сыворотке крови этих животных отсутствуют оксидазная и ферроксидазная активности (табл. 3). Эти животные теряют способность давать жизнеспособное потомство (Shavlovski et al., 1995). Ферментативная активность SOD1 и SOD3 (Zatulovskiy et al., 2012) не изменялись. У крыс Ag-180 оксидазная и ферроксидазная активности ЦП были снижены только в 2 раза по отношению к контрольной группе животных (табл. 3). Они давали жизнеспособное потомство. Исходя из этого, можно сделать следующие заключения. Во-первых, ЦП сыворотки крови является важным источником меди для развивающихся эмбрионов. Этот вывод согласуется с данными, полученными на мышах с генотипом Ср~/_. ЦП-дефицитные мыши дают потомство в 2 раза меньшее, чем контрольные животные, хотя в печени новорожденных крыс из пометов медь-дефицитных самок содержание меди было в пределах нормы (Chu et al., 2012). Во-вторых, накопление меди в печени во время эмбрионального и раннего постнатального развития является важным процессом, который, вероятно, регулирует баланс меди в условиях ее экологически обусловленного дефицита. Этот процесс может включать в себя индукцию альтернативных транспортных путей меди. Одним из доказательств существования такой альтернативы можно рассматривать сохранение у Ag-180 крыс 50% физиологической активности холо-ЦП, несмотря на высокий уровень серебра. Кроме того, в печени животных этой группы уже в возрасте сорока дней жизни изменяется профиль экспрессии генов белков, входящих в метаболическую систему меди (рис. 4). Об изменении транскрипционной активности генов белков, обеспечивающих ключевые клеточные процессы (хемотаксис, сигналинг, мембранный транспорт, состояние окислительно-восстановительной системы клетки, регуляцию транскрипции и активность рибосом) в клетках Pseudomonas fluoresce ns, свидетельствуют данные, полученные при воздействии разных концентраций смесей ионов металлов в течение разного по длительности времени обработки (Gomez-Sagasti et al., 2015). Транскрипционная активность генов, которые у млекопитающих кодируют белки канонического пути метаболизма меди: транспорт, распределение и выведение ионов меди (CTR1, CTR2, COMMD1, МТи CCS), в печени Ag-180 снижается достоверно (рис. 5). Тем не менее, относительное содержание иммунореактивных полипептидов белков МТ не уменьшилось. Возможно, что снижение транскрипции генов этих многофункциональных белков, участвующих и в других, кроме метаболизма меди, биологических процессах (Takahashi, 2012), было компенсировано увеличением периода полураспада молекулы белка. Эти факты свидетельствуют в пользу того, что у Ag-180 крыс в сыворотке обнаруживается изоформа ЦП, которая синтезирована в другом органе, а не в печени. Ранее нами показано, что у Ag-180 крыс в крови циркулируют 2 изоформы ЦП: обладающая оксидазной актиьностью, которая секретиру-ется в кровоток раньше, чем не обладающая этой активностью печеночная (Ilyechova et al., 2014). Мы предположили, что у крыс, получавших серебро с первого дня жизни индуцируются внепеченоч-ный синтез и секреция ЦП, который обеспечивает потребности растущего организма в меди. Это, по-видимому, и объясняет сохранение репродуктивной функции. Возможно, дефицит ЦП-связан-ной меди индуцирует компенсаторный внепече-ночный синтез ЦП, который обеспечивает медью растущий организм. Таким органом, или одним из таких органов, может быть жировая клетчатка, как недавно показано нами (Ilyechova et al., 2017).

Авторы:

Издание: Онтогенез
Год издания: 2018
Объем: 13с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.189-201. Библ. 47 назв.
Просмотров: 54