ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗА-СОДЕРЖАЩИЕ КЛЕТКИ СПИННОМОЗГОВОГО ГАНГЛИЯ КРЫСЫ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА

Аннотация:

В настоящей работе изучены формирование, локализация и морфологические особенности глута-минсинтетаза-иммунопозитивных клеток спинномозгового ганглия крыс на разных этапах прена-тального и постнатального развития. Показано, что уже на 18 сут пренатального развития в спинномозговом ганглии (СМГ) крысы мелкие дифференцирующиеся клетки-сателлиты, расположенные в непосредственной близости от чувствительных нейронов, содержат глутаминсинтетазу. На 19-сут развития формирующиеся иммунопозитивные глиоциты СМГ занимают свое положение вокруг формирующихся нейронов, приобретая топографию, характерную для ганглиев новорожденных и взрослых животных. В работе был проведен морфометрический анализ среднего числа клеток-сателлитов на чувствительный нейрон у половозрелых и стареющих крыс. Установлено, что этот показатель не меняется с возрастом. Ключевые слова: клетки-сателлиты, спинномозговой ганглий, глутаминсинтетаза, онтогенез ВВЕДЕНИЕ. Основными структурными элементами спинномозгового ганглия (СМГ) являются чувствительные нейроны и клетки макроглии, к которой относят нейролеммоциты (шванновские клетки), и клет-ки-сателлиты. Среди глиальных клеток периферической нервной системы наименее исследованными являются именно клетки-сателлиты. Они происходят в эмбриогенезе из нервного гребня, наряду с периферическими нейронами, нейролеммоцита-ми, нейроэндокринными клетками надпочечников и рядом других структур (Ноздрачев, Чумасов, 1999; Costa, Moreira Neto, 2015). В чувствительном ганглии клетки сателлитной глии локализуются вокруг клеточных тел сенсорных нейронов, причем такая оболочка может содержать различное количество клеток (Pannese, 1960, 1964, 1981; Hanani, 2005). Глиоциты периферической нервной системы выполняют широкий ряд функций и являются необходимыми для развития и функционирования нейронов. Функция клеток-сателлитов заключается в регулировании ионной концентрации пери-нейронального пространства и обеспечении рециркуляции нейромедиаторов (Costa, Moreira Neto, 2015). Так, высказываются предположения о том, что клетки-сателлиты чувствительных ганглиев играют значительную роль в поддержании гомео-стаза глутамата, участвуя в процессах переработки перинейронального нейротрансмиттера (Ohara et al., 2009). В этом процессе участвует комплекс ферментов, экспедируемых клеткам и-сателлитами, одним из которых является глутаминсинтетаза (GS). Работы по выявлению глутаминсин-тетаза-иммунопозитивных клеток спинномозгового ганглия немногочисленны (Miller et al.,2002; Ohara et al., 2009; Saitoh, Araki, 2010), а исследования таких клеток в пренатальном периоде не проводились. Целью настоящей работы явилось иммуноги-стохимическое выявление глутаминсинтетаза-со-держащих клеток спинномозгового ганглия крыс в эмбриогенезе, после рождения и на разных этапах постнатального развития, а также определение их локализации и морфологических особенностей. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовались эмбрионы крыс Вистар 12—19 сут развития (п=20), новорожденные (п=5), половозрелые крысы (п=5) и крысы в возрасте 18 мес (п=5). Самок крыс с датированным сроком беременности получали по общепринятому методу.Первым днем беременности считался день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке после подсадки самцов к самкам. Содержание и умерщвление животных осуществляли с учетом "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных" и международных правил Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. Материалом для исследования являлись спинномозговые ганглии шейного отдела спинного мозга крыс на уровне 3-5 сегмента. Выделенные фрагменты спинного мозга (СМ) эмбрионов, новорожденных и взрослых животных фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида, обезвоживали и заливали в парафин (Коржевский и др., 2014). Серийные срезы толщиной 5 мкм подготавливали к иммуногистохимическим исследованиям по общепринятой методике. Для иммуно-цитохимического выявления глутаминсинтетазы были использованы мышиные моноклональные антитела (клон GS-6, разведение 1:400, Chemicon, США). В качестве вторичных реагентов использовали набор EnVision+ SystemLabelledPolymer-HRP Anti-Mouse (Dako, Дания). Визуализацию прореагировавших антител проводили с применением диаминобензидина (DAB+ Dako, Дания). Исследование и фотографирование полученных препаратов, заключенных в среду Cytoseal 60 (Германия), производили при помощи микроскопа LeicaDM750 и фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Производили подсчет среднего числа сателлитов на один чувствительный нейрон половозрелых и 18-месяч-ных животных (Cecchini et al., 1999), а также определяли среднее количество групп мелких GS-им-мунопозитивных клеток в спинномозговом ганглии половозрелых и 18-месячных крыс на единицу площади препарата (0,32 мм2). Для этого производили фотосъемку областей, представляющих интерес, расположенных близко друг к другу, но без перекрывания. Было получено не менее четырех изображений на каждое животное при увеличении 400х. Анализ изображений проводили с применением программы ImageJ (NIH, США). РЕЗУЛЬТАТЫ На 12-13-е сут эмбрионального развития формирующиеся спинномозговые ганглии крысы представляют собой скопления мелких клеток с округлыми ядрами и тонким ободком цитоплазмы, расположенные рядом с формирующимся спинным мозгом. К 14-17 сут эмбрионального развития число клеток в формирующемся ганглии увеличивается. При иммуногистохимической реакции на глутаминсинтетазу, иммунопозитивные клетки в этот срок (12-17 сут) не идентифицируются. У эмбрионов крыс 18-19-х сут развития в спинномозговом ганглии можно дифференцировать нейробласты и мелкие презумптивные клет-ки-сателлиты. У эмбрионов 18 сут развития фермент выявляется лишь в перинуклеарной области формирующихся мелких клеток-сателлитов, расположенных в непосредственной близости от чувствительных нейронов. У плодов 19-х сут развития клетки-сателлиты ганглия приобретают топографию, сходную с ганглием взрослой крысы. В этот срок GS присутствует в цитоплазме молодых клеток-сателлитов, занимающих свое положение вокруг формирующихся нейронов СМГ. Глутаминсинтетаза обнаруживается в цитоплазме большинства развивающихся сателлитов, в то время как в нейробластах она не экспрессируется (рисунок а). Большая часть нейролеммоцитов на 18-19 сутки эмбрионального развития оказались GS-иммунонегативными. Лишь отдельные формирующиеся шванновские клетки заднего корешка содержали GS. У новорожденных крыс структура ганглия имеет сходство с ганглием половозрелых крыс. Нейро-нальные элементы представлены развивающимися чувствительными нейронами в большинстве случаев округлой формы, их отростки концентрируются в центре узла. Клетки-сателлиты, содержащие GS, располагаются вокруг дифференцирующихся нейронов, тесно прилегая к их перикарионам (рисунок б). Единичные нейролеммоциты также содержат глутаминсинтетазу. При иммуногистохимической окраске на GS в спинномозговом ганглии половозрелых и 18-месячных крыс интенсивно окрашиваются клетки-сателлиты, располагающиеся вокруг нейронов, тесно контактируя с ними (рисунок в). Причем среднее число сателлитов на один чувствительный нейрон половозрелых и 18-месячных существенно не отличается. Так, у половозрелых животных этот показатель составляет 3,12 ± 0,24; а у 18-месячных животных - 3,38 ± 0,13 (р>0,05). У новорожденных, половозрелых и стареющих (18 мес) животных GS идентифицируется в большинстве клеток-сателлитов, окружающих иммуно-негативные нейроны. Однако были выявлены единичные клетки, не содержащие фермент. В толще ганглия нередко идентифицируются отдельные группы иммунопозитивных близкорасположенных друг к другу мелких клеток, визуально не связанные с телами нейронов. Ядра этих клеток округлой или овальной формы имеют различные размеры. Количество таких групп у 18-месячных крыс более чем в два раза превышает количество групп в спинномозговом ганглии взрослых животных. У половозрелых крыс этот показатель составил 6,25 ± 1,25; у стареющих животных (18 мес) -17,00 ± 0,82 (р<0,05).ОБСУЖДЕНИЕ. В современных исследованиях, посвященных развитию чувствительных ганглиев, анализируется, в основном, нейроногенез, при этом мало внимания уделяется сателлитной глии. Однако известно, что функционирование нейронов спинномозгового ганглия зависит от состава и функционального статуса окружающих их глиальных клеток. Во взрослом организме клетки-сателлиты имеют специфические морфологические характеристики и локализацию, однако в процессе развития, на разных стадиях формирования, они трудно отличимы от клеток-предшественников, ранних нейробластов и нейролеммоцитов, присутствующих в развивающемся ганглии. В настоящее время для выявления клеток-сателлитов применяется широкий ряд иммуногистохимических маркеров: глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), белок S100, виментин и фермент глутаминсинтетаза (Рагинов и др., 2002; Архипова и др., 2009; Costa, Moreira Neto, 2015). Однако большинство этих маркеров не обладают достаточной специфичностью. Так, белок S100 идентифицируется в шванновских клетках (нейролеммоцитах) и отдельных чувствительных нейронах (Hanani, 2005; Колос, 2013). Глиальный фибриллярный кислый белок при отсутствии повреждения аксонов нейронов экспрес-сируется в клетках сателлитах в очень низких концентрациях. В периферической нервной системе GFAP обычно используется в качестве маркера активации сателлитной глии (Nascimento et al., 2008). Виментин на ранних (Е12-Е17) сроках пренатального развития выявляется не только в формирующихся сателлитах, но и в клетках-предшественниках, присутствующих в эмбриональных закладках ганглия. Причем иммунопозитивность проявляют предшественники как чувствительных нейронов, так и сателлитной глии, а также нейролеммоцитов. И лишь на поздних сроках эмбриогенеза виментин идентифицируется только в клетках-сателлитах (Колос, Коржевский, 2013). В последние годы для избирательного выявления зрелых клеток-сателлитов в спинномозговом ганглии взрослых лабораторных животных часто применяют иммуно-гистохимическую реакцию на глутаминсинтетазу. Глутаминсинтетаза — представляет собой фермент, который играет существенную роль в метаболизме азота, катализируя взаимодействие глутамата и аммиака с образованием глутамина (Miller et al.,2002). Данный фермент присутствует как в клетках периферической, так и центральной нервной системы. Поскольку глутамат является основным возбуждающим нейротрансмиттером ЦНС, глутаматный обмен в головном и спинном мозге достаточно хорошо изучен (МсКеппа, 2007). Для функционирования глутаматергических нейронов необходимо постоянное пополнение глута-матного пула в нервных окончаниях. Основным предшественником в синтезе глутамата в ЦНС является глутамин, который синтезируется в основном в цитоплазме астроцитов. При помощи сложной системы транспортеров и фермента глутамин-синтетазы клетки астроглии поглощают глутамат из синаптической щели, переводят его в глутамин и выводят его во внеклеточное пространство. Глутамин захватывается близлежащими нейронами, в цитоплазме которых происходит ресинтез глутамата. Общепринятым является мнение, что в ЦНС глутаминсинтетаза экспрессируется исключительно в астроцитах (Schousboe et al., 2014), однако многие исследования демонстрируют присутствие данного фермента также в цитоплазме олигоден-дроцитов (DAmelio et al., 1990; Benton et al., 2000;Liu et al., 2013). Функциональное значение присутствия глутаминсинтетазы в этих клетках не ясно. В единичных исследованиях предполагается, что GS является не только метаболически значимым ферментом, но также регулирует дифференцировку шванновских клеток и способствует миелиниза-ции путем регулирования концентрации глутамата (Saitoh, Araki, 2010). Многие белки, необходимые для функционирования глутамат-глутаминового цикла, присутствуют в нейронах и глиальных клетках спинномозгового ганглия (Hoffman et al., 2016). Глутамат является основным нейротрансмиттером, используемым сенсорными нейронами и высвобождается преимущественно в задних рогах спинного мозга. Однако существует гипотеза о паракринном высвобождении глутамата в пределах спинномозгового ганглия (Jasmin et al., 2010). Известно, что чувствительные нейроны экспрессируют фермент синтеза глутамата — глутаминазу и глутаматные рецепторы, которые обеспечивают регуляцию передачи сигналов между сенсорными нейронами и их клетками-мишенями в спинном мозге (Huettner et al., 2002; Koeppen et al., 2016). Кроме того, присутствие везикулярных глутаматных транспортеров в нейронах СМ Г, а также присутствие глутаматных транспортеров и глутаминсинтетезы в клетках-сателлитах (Carozzi et al., 2008; Kung et al., 2013) свидетельствуют о том, что рециркуляция глутамата в СМ Г происходит посредством трансмембранного обмена между нейронами и клетками-сателлитами. Альтернативные глиальные глютаминовые циклы в ПНС могут быть использованы для продуцирования глутамина, используемого нейронами в синтезе глутамата для синаптической передачи. Показано, что блокирование поглощения глутамата клетками-сателлитами СМ Г может изменить возбудимость сенсорных нейронов (Jasmin et al., 2010). В настоящем исследовании установлено, что фермент глутаминсинтетаза обнаруживается в формирующихся клетках-сателлитах спинномозгового ганглия крысы, начиная с 18-х суток эмбрионального развития. Известно, что первые аффе-ренты чувствительных нейронов достигают спинного мозга к 15—16 суткам эмбриогенеза, ветвление аксонов и активное формирование синапсов, в том числе глутаматергических, на нейронах спинного мозга начинается с 18 суток развития (Donkelaar, 2000; Miranda-Contreras et al., 2002). Таким образом, очевидно, что процессы синтеза фермента, обеспечивающего рециркуляцию глутамата в пределах СМ Г, запускаются в цитоплазме клеток-сателлитов в период формирования контактов нейронов с клетками-мишенями спинного мозга. До настоящего момента остается нерешенным вопрос о способности сателлитных клеток чувствительного ганглия к пролиферации в постнатальном периоде развития. Считается, что в постнатальном онтогенезе структура и распределение клеток-сателлитов в спинномозговом ганглии крыс не изменяются, а ультраструктурные характеристики сателлитов старых животных соответствуют особенностям молодых животных (Vega et al., 1993). Однако ряд работ описывает увеличение количества и плотности щелевых контактов в процессе постнатального развития, а также уменьшение объема митохондрий (Martinelli et al., 2003). В настоящем исследовании было установлено, что среднее число сателлитов СМГ на один чувствительный нейрон в изученные сроки постнатального развития не изменяется. Выявленные с помощью иммуногистохимической реакции па GS скопления мелких иммунопо-зитивных клеток с различными по форме и размеру ядрами свидетельствуют о том, что эти клетки могут функционально различаться. В настоящем исследовании показано, что количество групп мелких иммунопозитивных клеток с возрастом увеличивается. Подобные группы мелких клеток также обнаруживаются при иммуногистохимической окраске чувствительного ганглия на нестин (Петрова, Колос, 2016). Вопрос о том, какие именно клетки ганглия содержат нестин и какова их функция требует дополнительных исследований. Несмотря на то, что GS считается селективным маркером клеток-сателлитов, некоторые исследователи отмечают экспрессию фермента в зрелых шванновских клетках нерва, образованного отростками нейронов СМГ (Miller et al.,2002; Saitoh, Araki, 2010). В ходе настоящего исследования не было выявлено присутствия данного фермента в шванновских клетках взрослых крыс, а у эмбрионов 18—19 сут развития и новорожденных животных в составе СМГ присутствуют отдельные им-мунопозитивные нейролеммоциты. Известно, что фермент глутаминсинтетаза присутствует преимущественно в немиелинизирующих шванновских клетках (Hanani, Spray, 2013). Считается, что глу-таматергическая ноцицептивная передача нервных импульсов на периферии обеспечивается немиели-низированнными нервными волокнами (Gong et al., 2014). Вероятно, выявленные в настоящем исследовании отдельные иммунопозитивные нейролеммоциты, находятся в тесных взаимоотношениях с волокнами, обеспечивающими эту функцию. По нашему мнению, глутаминсинтетаза является более избирательным маркером для клеток-сателлитов СМГ по сравнению с S100 и виментином. В настоящей работе показано, что данный маркер обладает высокой селективностью как в эмбриональном периоде развития СМГ, так и после рождения. В ходе настоящего исследования в зрелом СМГ были идентифицированы единичные сателлиты, не содержащие глутаминсинтетазу, что может свидетельствовать о гетерогенности этой глиальной популяции клеток. Однако данный вопрос требует дополнительных исследований, так как расположение, количество и толщина слоя сателлитов вокруг нейрона может варьировать. В некоторых местах данная оболочка может иметь толщину лишь несколько десятков нанометров и, следовательно, с применением светового микроскопа данная структура не может быть изучена в полной мере. Таким образом, в ходе настоящего исследования получены приоритетные данные по распределению изучаемого фермента в клетках СМГ крыс на разных этапах онтогенеза. В работе установлено, что уже на 18 сут пренатального развития в спинномозговом ганглии крысы дифференцирующиеся глиальные клетки-сателлиты содержат глутаминсинтетазу. Глутаминсинтетаза является селективным маркером этих клеток и позволяет отличить их от развивающихся нейролеммоцитов и нейробластов. На 19-сут развития формирующиеся глиоциты СМГ крыс приобретают локализацию, характерную для ганглиев взрослых животных: они располагаются вокруг нейрональ-ных элементов, тесно контактируя с ними. Установлено, что среднее число клеток-сателлитов на один чувствительный нейрон в спинномозговом ганглии молодых животных и крыс в возрасте 18 месяцев значимо не отличается. У половозрелых животных описаны скопления мелких иммунопо-зитивных клеток. Число таких групп увеличивается с возрастом.

Авторы:

Издание: Онтогенез
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.202-207. Библ. 65 назв.
Просмотров: 178