Дальневосточный государственный медицинский университет Поиск | Личный кабинет | Авторизация
Поиск статьи по названию
Поиск книги по названию
Каталог рубрик
в коллекциюДобавить в коллекцию

ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗЕ И ДОИМПЛАНТАЦИОННОМ РАЗВИТИИ МЫШИ


Аннотация:

Среди функций серотонина - регуляция процессов роста и развития женских половых клеток, а также раннего эмбрионального развития. Чтобы раскрыть конкретные механизмы этих функций, был проведен ОТ-ПЦР анализ экспрессии мРНК генов ферментов синтеза и деградации, транспортеров и рецепторов серотонина в ходе фолликулогенеза и доимплантационного развития мыши. В клетках гранулезы выявляется мРНК ферментов триптофангидроксилазы tphl и моноаминоксидазы таоа, мембранного транспортера sert и везикулярного транспортера vmat2, а также рецепторов серотонина htrlb, htrld, htr2a, htr5b и htr7. В желтом теле дополнительно появляется экспрессия мРНК фермента декарбоксилазы ароматических аминокислот ddc и рецептора htr2b. В ходе доимплантационного развития наблюдается экспрессия мРНК генов ферментов tph2, ddc и таоа, транспортеров serf, vmatl и vmat2, а также целого ряда рецепторов, причем экспрессия большинства из них носит транзитор-ный характер. Наличие экспрессии всех компонентов и ее динамика позволяют предположить, что серотонинергическая сигнальная система функционально активна в фолликулогенезе и доимпланта-ционном развитии мыши. Ключевые слова: фолликулогенез, гранулеза, кумулюс, желтое тело, доимплантационное развитие, мышь, ОТ-ПЦР, серотонин, синтез, деградация, транспорт, рецептор ВВЕДЕНИЕ. Моноаминергические трансмиттеры являются универсальными сигнальными молекулами, контролирующими процессы развития (Бузников, 1967, 2007). Серотонин обладает наибольшим числом описанных функций вне нервной системы, как в эмбриональном развитии, так и во взрослых организмах. Среди них регуляция делений дробления (Buznikov et al., 1970, 2005), межбластомер-ных взаимодействий (Шмуклер, 1981; Shmukler et al., 2008), морфогенетических движений (Shuey et al., 1993), установления лево-правой асимметрии тела (Levin et al., 2006), а так же процессов клеточной дифференцировки и пролиферации (Azmitia, 2001). Участие серотонина в регуляции процессов роста и созревания женских половых клеток показано для широкого ряда животных — двустворчатых (Krantic et al., 1991; Wang, He, 2014) и головоногих моллюсков (Zatylny et al., 2000), ракообразных (Tinikul et al., 2008), немертин (Strieker, Smythe, 2001), иглокожих (Buznikov et al., 1993), рыб (Cerda et al., 1998; Lister et al., 2009), амфибий (Buznikov et al., 1993; Sheng et al., 2005) и млекопитающих (Terranova et al., 1990; Tanaka et al., 1993; Sheng et al., 2005). Сходная роль серотонина как регулятора процесса оогенеза у таких эволюционно далеких групп указывает на консервативность данного сигнального механизма. Серотонин и другие моноаминергические трансмиттеры (дофамин и норадреналин) определяются в физиологических концентрациях в яичниках млекопитающих, в частности, в ооцитах, клетках кумулюса (Amireault, Dube, 2005b), в фолликулярной жидкости (Bodis et al., 1992). Известно, что основным источником катехоламинов в яичнике являются терминали иннервирующих его вегетативных ганглиев (Mayerhofer et al., 1998), тогда как источником серотонина предполагается прежде всего кровь, а также синтез в самом яичнике (Dube, Amireault, 2007). На различных моделях показано, что серотонин обладает стимулирующим действием на функцию фолликулярных клеток. У хомячков и крыс серотонин стимулирует синтез эстрадиола в преовуляторных фолликулах, культивируемых in vitro, а специфические антагонисты серотониновых рецепторов устраняют этот эффект (Terranova et al., 1990; Tanaka et al., 1993). Сходные результаты получены и на других модельных объектах, например, у самок костистой рыбы Danio rerio ингибитор обратного захвата серотонина флуоксетин приводит к уменьшению количества икры и содержания эстрадиола в яичниках, а также к снижению уровня экспрессии мРНК овари-альной ароматазы и рецепторов к гонадотропным гормонам (Lister et al., 2009). Особый интерес представляет то, что данный стимулирующий эффект серотонина наблюдается на клетках гранулезы человека (Koppan et al., 2004; Graveleau et al., 2000), моноаминергическая регуляция которых играет роль в возникновении патологических процессов, в частности синдрома поликистозных яичников (Lara et al., 1993). Однако предполагать конкретные механизмы этого эффекта представляется затруднительным в связи с разнородностью экспериментальных моделей и использованием фармакологических агентов ограниченной специфичности. Наряду с непосредственным влиянием овари-ального серотонина на функцию фолликулярных клеток и процесс созревания ооцита, существуют его отложенные эффекты, проявляющиеся в дальнейшем эмбриональном и постэмбриональном развитии. На антральных фолликулах человека, полученных при применении вспомогательных репродуктивных технологий, показано, что содержание моноаминов в фолликулярной жидкости коррелирует как с морфологическими показателями созревания ооцита, так и с успешностью последующей процедуры оплодотворения in vitro (Bodis et al., 1993). Мыши, нокаутные по ферменту синтеза серотонина tphl, остаются фертильными, но в их потомстве наблюдаются отставание в развитии и морфологические нарушения (Cote et al., 2007). Употребление ингибитора обратного захвата серотонина флуоксетина беременными самками крыс приводит к нарушениям репродуктивного цикла, изменениям фолликулярного пула, в том числе увеличению овариального апоптоза, а также к количественным изменениям экспрессии генов, регулирующих серотониновую сигнализацию и биологические ритмы у их потомства (Moore et al., 2015). Установление конкретных молекулярных механизмов влияния серотонина на фолликулоге-нез является крайне важным для оценки его роли как регулятора репродуктивной функции. Серотонинергическая сигнальная система как в компонентах овариальных фолликулов, так и в ходе доимплантационного развития млекопитающих, описана в литературе далеко не полно. В ряде работ показана экспрессия отдельных компонентов серотонинергической системы в доим-плантационном развитии (Vesela et al., 2003; Illcova et al., 2004; Amireault, Dube, 2005a, b; Hinckley et al., 2005; Basu et al., 2008). В совокупности с результатами, полученными на амфибиях (Nikishin et al., 2012) и птицах (St^pinska et al., 2015), об одновременной экспрессии сразу нескольких типов серотониновых рецепторов в период раннего развития представляла интерес аналогичная ситуация в эмбриогенезе млекопитающих. В то же время, данных о серотонинергической системе в развивающемся овариальном фолликуле фактически нет, так как большая часть работ выполнена на ооцит-ку-мулюсных комплексах (Amireault, Dube, 2005а, b). С целью решения этих вопросов и для устранения имеющихся пробелов, нами был выполнен полный обзор экспрессии мРНК всех компонентов серотонинергической системы в фолликулярных клетках гранулезы, кумулюса и желтого тела, а также ооци-тах, дробящихся эмбрионах и бластоцистах мыши. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали мышей-гибридов F1 линий C57BL/6J и CBA/J. Получение материала проводили с использованием стандартных методик (Дыбан и др., 1975) и с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. Яичники с яйцеводами выделяли из умерщвленных методом дислокации шейных позвонков самок и препарировали в среде L-15 (Sigma-Aldrich, США) под контролем стерео-микроскопа. Клетки гранулезы получали из стенки антральных фолликулов посредством пункции тонкой иглой. Клетки желтого тела изолировали микрохирургически из яичников беременных самок (12,5 сут). Ооцит-кумулюсные комплексы выделяли из ампул яйцеводов через 0,5 сут после спаривания с вазэктомированными самцами и обрабатывали раствором гиалуронидазы (Sigma-Aldrich, США), после чего отбирали зрелые МП ооциты, а клетки кумулюса осаждали центрифугированием. Дробящиеся эмбрионы на стадии 4—8 клеток получали через 2—2,5 сут после спаривания путем диссекции яйцеводов. Бластоцисты вымывали из рогов матки через 4,5 сут после спаривания. Полученные пробы лизировали в TRI Reagent (Sigma, США), после чего хранили в —80 °С до выделения тотальной РНК. После обработки ДН-Казой I (Fermentas, США) 1 мкг РНК из клеток гранулезы, кумулюса и желтого тела, а также из яичников и 18-дневных зародышей использовали для синтеза кДНК с помощью набора реактивов "MMLV RT kit" (Евроген, Россия). Тотальную РНК из 150 ооцитов или доимплантационных эмбрионов использовали для синтеза и амплификации кДНК с помощью набора реактивов "Mint" (Евроген, Россия) согласно протоколу производителя, для амплификации кДНК потребовалось 19 циклов. ПЦР проводили на амплификаторе Т100 (BIO RAD, США) с использованем готовой смеси для ПЦР "ScreenMix-HS" (Евроген, Россия). В ходе первого раунда гнездовой ПЦР проводили 24 цикла амплификации, в ходе второго раунда использовали 0,1 мкл ПЦР-смеси и проводили 30 циклов амплификации. Анализ продуктов проводили с помощью агарозного гель-электрофореза и системы видеорегистрации "Взгляд" (Хеликон, Россия). Для исключения ложноположительного результата проводили отрицательные контроли — ПЦР без матрицы и ПЦР без обратной транскрипции. Специфические олигонуклеотиды для проведения двух раундов "гнездовой" ПЦР (табл. 1) подбирали с помощью сервиса NCBI Primer-BLAST с учетом экзон-интронной структуры генов. Исследовали экспрессию ферментов синтеза серотонина триптофангидроксилазы tphl и tph2, де-карбоксилазы ароматических аминокислот ddc, везикулярных транспортеров моноаминов vmatl, и vmat2, транспортера серотонина sert, фермента деградации серотонина моноаминоксидазы А таоа и серотониновых рецепторов htrla, htrlb, htrld, htrlf, htr2a, htr2b, htr2c, htr3a, htr4, htr5a, htr5b, htr6 и htr7. В качестве контрольного гена использовали hprt. Каждый эксперимент проведен в трех повторностях. РЕЗУЛЬТАТЫ В ходе работы было проведено ОТ-ПЦР исследование экспрессии всех основных компонентов серотонинергической сигнальной системы в фолликулярных клетках, полученных на разных стадиях фолликулогенеза (гранулеза стенки антрально-го фолликула, клетки постовуляторного кумулю-са и желтое тело), а также в зрелых МП ооцитах и преимплантационных эмбрионах (дробление и бластоциста) мыши. Результаты ПЦР-скрининга представлены на рисунке. Экспрессия контрольного гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтранс-феразы hprt выявляется во всех пробах. В контрольной пробе, полученной из 18-дневного зародыша, выявляется экспрессия всех исследуемых генов, а в яичнике — за исключением tph2, htrla, htr2c, htr3a, htr4, htr5a и htr6. Экспрессия мРНК генов ферментов триптофангидроксилазы tphl и моноаминоксидазы таоа, транспортеров vmat2 и sert, рецепторов htrlb, htrld, htr2a и htr5b выявляется как в клетках гранулезы и кумулюса, так и в желтом теле. Транскрипты генов фермента синтеза декарбоксилазы ароматических аминокислот ddc, везикулярного транспортера vmatl и рецептора htr2b не выявляются в клетках гранулезы и кумулюса, но появляются в желтом теле. Рецептор htr7 экспрессируется в клетках гранулезы, но не выявляется в кумулюсе и желтом теле. Гены tph2, htrla, htrlf, htr2c, htr3a, htr4, htr5a и htr6 не экспрессируются в исследуемых пробах фолликулярных клеток. Экспрессия таоа, везикулярного транспортера vmat2, рецептора htr5b выявляется как в ооцитах, так и в дробящихся эмбрионах и бластоцистах, а транспортера sert - только в ооцитах и дробящихся эмбрионах. Везикулярный транспортер vmatl отсутствует в ооцитах, но экспрессируется в доимплантационных эмбрионах. Фермент синтеза tph2 и рецепторы htr3a и htr7 экспрессируются только в ооцитах, а рецепторы htrla, htrld, htr2a, htr2b и htr6 - только в дробящихся эмбрионах. Экспрессия фермента синтеза серотонина ddc выявляется только на стадии бластоцисты. Гены tphl, htrlb,преимплантационного развития мыши синтез серотонина становится возможен только к стадии бластоцисты, при условии сохранения активности ТРН2 или ее продукта на этой стадии. Стоит отметить, что tph2, которая долгое время считалась ней-ральной формой фермента, может служить маркером половой линии в яичнике, так как не экспрессируется в окружающих ооцит фолликулярных клетках. Мембранный транспортер серотонина sert экспрессируется в ооцитах и дробящихся эмбрионах, но исчезает к стадии бластоцисты. В литературе имеются данные об экспрессии мРНК sert на всех стадиях доимплантационного развития, а также о наличии белка и его функциональной активности в доимплантационных эмбрионах (Amireault, Dube, 2005b; Basu et al., 2008). Отсутствие экспрессии мРНК sert в бластоцисте может быть связано с используемым нами методическим подходом. Эффективность синтеза первой цепи кДНК сильно звисит от состояния исходной мРНК, в частности, от длины поли(А)-хвоста. Последующая процедура амплификации кДНК, необходимая ввиду малого количества исходного материала, способна усугубить количественные различия экспрессии между пробами. По всей вероятности, экспрессия транспортера серотонина несколько снижается к концу доимплантационного развития, на что косвенно указывает также продемонстрированное французскими коллегами уменьшение интенсивности иммуноокрашивания SERT в бластоцистах, по сравнению с дроблением (Amireault, Dub?, 2005b). Наряду с мембранным транспортером серотонина, в ходе доимплантационного развития выявляется экспрессия везикулярных транспортеров моноаминов, необходимых для осуществления межклеточной сигнальной функции, а также основного фермента деградации серотонина таоа. В ооцитах выявляется экспрессия мРНК трех серотониновых рецепторов, причем htr7 и канальный htr3a исчезают к дроблению, тогда как htr5b экспрессируется в течение всего доимплантационного развития. Стоит отметить совпадение времени транзиторной экспрессии редко встречающегося в оогенезе и раннем эмбриогенезе рецептора серотонина 3 типа в ооцитах и перепелки (St^pinska et al., 2015) и мыши, постоянная экспрессия которого у обоих видов затем наблюдается значительно позже. Интересно, что на стадии делений дробления наблюдается транзиторная экспрессия мРНК шести других рецепторов серотонина. Стоит отметить, что из выявленной экспрессии мРНК не следует экспрессия на уровне белка, и вопрос о функциональной активности этих рецепторов требует дальнейшего исследования. Однако полученный результат является хорошей иллюстрацией периода вариабельности, наблюдающегося вдоимплан-тационном развитии млекопитающих и характеризующегося временной избыточной и стохастической экспрессией разных генов в различных клетках раннего эмбриона (Dietrich, Hiiragi, 2007). Полученные результаты имеют некоторые расхождения с литературными данными. Так, в клетках кумулюса нам не удалось выявить описанную в литературе экспрессию рецепторов htr2b и htr7 (Amireault, Dube, 2005а). При этом нами обнаружена экспрессия рецептора htr2a на стадии дробления, хотя в литературе есть данные об отсутствии мРНК этого гена в доимплантационном развитии (Amireault, Dub6, 2005а). В то же время, экспрессия рецептора htr7не выявлена нами в дробящихся эмбрионах и бластоцистах, тогда как в литературе есть данные об экспрессии этого гена до стадии 8 клеток (Amireault, Dub6, 2005а). Такие расхождения могут объясняться использованием разных линий мышей, и разных праймеров, а также, как и в случае sert (см. выше), могут быть связаны с особенностями используемых методических подходов. Тем не менее, данные об одновременной экспрессии мРНК серотониновых рецепторов нескольких типов в фолликулогенезе и раннем эмбриогенезе млекопитающих, показанной в данной работе, и аналогичные данные на зародышах амфибий и птиц (Nikishin et al., 2012; Sttjpiriska et al., 2015) позволяют предположить существование нетривиального механизма, при котором к одному и тому же трансмиттеру в клетке, присутствуют рецепторы более чем одного типа, способные одновременно активировать разные сигнальные пути и, таким образом, реализовывать различные функции. Так, например, в бластомерах морских ежей серотонин одновременно вовлечен в регуляцию клеточного цикла (Бузников, 1987), жесткости кортикального цитоскелета (Григорьев, 1988), адгезии бластоме-ров (Бузников, Шмуклер, 1978) и прямых межклеточных взаимодействий (Шмуклер, 1981). Кроме того, серотонин, вероятно, может служить субстратом для синтеза мелатонина. Экспрессия ферментов синтеза мелатонина и его функциональная активность показана в ооцитах и преимплантаци-онных эмбрионах крыс и свиней (Sakaguchi et al., 2013; Chen et al., 2017). Таким образом, представленные в данной работе результаты показывают, что серотонинерги-ческая система постоянно в той или иной форме присутствует на всех стадиях фолликулогенеза, оогенеза и последующего эмбриогенеза, выполняя одновременно и (или) последовательно целый ряд функций, конкретные детали реализации которых требуют дальнейшего глубокого изучения.

Авторы:

Никишин Д.А.
Храмова Ю.В.
Багаева Т.С.
Семенова М.Л.
Шмуклер Ю.Б.

Издание: Онтогенез
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.208-216. Библ. 55 назв.
Просмотров: 78

Рубрики
Ключевые слова
18
bioVISION
f1
htr2a
in
l1
st
vitro
агароза
агенты
адгезия
активированный
активность
активные
аминокислоты
амплификация
ампулы
амфибия
анализ
аналоги
антагонисты
антральный
апоптоз
ароматаза
ароматические
асимметрия
белковая
беременных
биологический
бластомеры
бластоциста
болеющие
большая
бытовые
вазэктомия
вариабельность
введен
вегетативному
везикулярного
вероятности
вероятность
взаимодействие
взрослые
видео
видовая
влияние
возникновения
вопрос
временная
временных
время
вспомогательные
встречный
второй
выделение
выполнение
выявленный
ганглии
гель
гена
генов
гены
гиалуронидаза
гипоксантин
глубокая
гнезда
голова
гонадотропный
гормон
готовность
гранулез
григорьев
групп
даль
дальний
данные
данных
движение
двустворчатый
деградации
деградация
действие
декарбоксилазы
деление
детям
динамика
дислокация
диссекция
дифференцировки
длина
дополнительные
дофамин
дробления
другого
евра
желтая
желтое
женские
жесткость
животного
жидкостей
зародыш
захвата
иглой
иглокожие
игровая
избыточная
изменение
изучение
иллюстрация
иммунизация
ингибитор
интенсивность
иска
исключение
использование
использованием
исследование
исследований
источник
исход
канальный
катехоламины
качества
клетка
клетки
клеток
клеточная
ключ
количественная
количество
комплекс
компонент
конкретный
консервативная
контролирующая
контроль
контрольные
концентрация
корреляты
кортикальная
косая
кости
крайний
кровь
крыса
культивируемые
кумулюсные
левого
линии
литература
ложноположительные
малого
маркер
материал
матка
матрицы
межклеточная
мелатонин
мембранная
метод
методика
методические
механизм
микрохирургическая
млекопитающие
модели
молекула
молекулярная
моллюск
моллюски
моноаминергический
моноаминоксидаза
моноамины
морская
морфогенетические
морфологическая
мышей
мыши
набор
наибольшая
наличия
нарушения
нейральная
немая
непосредственные
нервная
нескольким
нокаутные
норадреналин
обзор
обнаружение
обработка
образ
обратная
объект
овариальная
ограниченные
одновременная
одного
окружающая
олигонуклеотиды
оогенез
ооцит
ооциты
оплодотворение
организм
оса
основной
особенности
особый
осуществление
от-пцр
отдельные
отрицательное
отсутствие
оценка
патологическая
первая
перепел
период
повторная
подход
поза
позвонков
показатели
пола
поликистозная
полная
полового
получение
помощи
после
послед
постовая
постоянная
потомство
правила
праймер
преимплантационная
применение
проба
пробы
проведение
проведения
продуктов
пролиферация
протоколы
процедура
процесс
проявления
прямая
птиц
пула
пункции
путем
пути
пцр
работа
развивающиеся
развитие
различие
различный
ракообразные
раннего
раствор
расхождение
реактивы
реализация
регулирующая
регуляторы
регуляции
редкие
результата
репродуктивная
рецептор
решения
рисунок
ритмы
роговой
роли
роль
россии
роста
рыб
ряда
самки
самцов
свиней
связей
сервис
серотонин
серотонина
серотонинергические
серотониновые
сигнализация
сигнальная
силлард
синдромы
синтез
систем
ситуации
след
слова
случаев
смеси
снижение
совокупность
содержание
созревание
состояние
сохранение
спаривание
специфическая
специфичность
способность
сравнение
среда
стадии
стандартные
стенка
стерео
стимулирующее
стимулирующие
стохастический
структур
субстратов
сша
тела
тело
терминали
технология
течения
типа
типов
тонкой
тотальное
транзиторная
транс
транскрипции
транскрипция
трансмиттеры
транспорт
триптофангидроксилаза
увеличение
указ
уменьшение
универсальное
употребление
уровни
условия
участие
учет
фаза
фактически
фармакологическая
фермент
фертильность
физиологическая
флуоксетин
фолликул
фолликулогенез
фолликулярная
французская
функции
функциональная
характер
хвост
хомячки
хороший
целью
целях
центрифугирование
цепи
цикла
циклов
цитоскелет
частная
часть
человек
число
шейная
шесть
широкая
эволюционная
экзоны
эксперимент
экспериментальная
экспериментальные
экспрессия
эмбриогенез
эмбрион
эмбриональное
эстрадиол
эффект
эффективность
яичник
яичниковый
яйцеводы
Ваш уровень доступа: Посетитель (IP-адрес: 18.118.144.109)
Яндекс.Метрика