Противовоспалительный и регенеративный эффект подавления гипоксийного сигналинга на модели хронической обструктивной болезни легких

Аннотация:

Резюме: Цель. Оценка противовоспалительного и регенеративного эффекта предотвращения активации гипоксийного сигналинга на модели хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) путем ингибирования циклооксигеназы-2 (СОХ-2)-зависимого провоспалительного каскада. Материалы и методы. При помощи экспозиций диоксидом азота (N02 30—40 мг/м3) в течение 90 дней у крыс создана модель ХОБЛ. В качестве ингибитора СОХ-2 применялся целекоксиб. С 30-го дня крысам 1-й группы через пищеводный зонд вводился целекоксиб (25 мг/кг); животные 2-й группы (контроль) получали 0,9%-ный NaCl. Интактные крысы составили 3-ю группу. Животные выводились из опыта после 60 и 90 дней экспозиции N02 путем цервикальной дислокации. При этом выполнялась цитография бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), определялось содержание СОХ-2, гипоксия-индуцибельного фактора-la (HIF-1а), интерлейкина (IL)-17, сурфактантного протеина D (SP-D) методом ELISA. Выполнено гистологическое исследование легочной ткани. Результаты. Показано, что после 90-дневной экспозиции N02 в БАЛЖ контрольных особей содержание нейтрофилов в 7,7 раза превышало интактное значение. Достоверно возрастало содержание провоспалительных медиаторов СОХ-2, HIF-la, IL-17, а уровень SP-D снижался. Применение целекоксиба сопровождалось нормализацией цитологического профиля БАЛЖ и уменьшением содержания СОХ-2, HIF-1a, IL-17, что свидетельствовало о снижении активности гипоксийного сигналинга и воспалительного процесса. Значительно возрастала концентрация SP-D, что можно рассматривать как следствие восстановления морфологической структуры бронхоальвеолярного эпителия, о чем свидетельствовали данные гистологического исследования легочной ткани. Заключение. При ингибировании СОХ-2 отмечен супрессивный эффект на HIF-1a-сигналинг и уменьшение легочного воспаления. Полученные результаты подтверждают функционально-регуляторную связь HIF-1a и СОХ-2-сигнальных каскадов, которая может быть терапевтической мишенью для предотвращения прогрессирования воспаления и ремоделирования дыхательных путей при ХОБЛ. Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление, гипоксия-индуцибельный фактор-1a, циклооксигеназа-2, интерлейкин-17, сурфактантный протеин D, целекоксиб. Одним из ключевых факторов развития и прогрессирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) является гипоксия-индуцибельный фактор-1 (HIF-1 ), транскрипционная активность которого связана с экспрессией гипоксия-зависимых генов, многих провоспалительных факторов и генов, вовлеченных в ремоделирование дыхательных путей, ангиогенез и энергетический метаболизм. Повышенные уровни HIF-1a определяются в сыворотке крови и легочной ткани пациентов с ХОБЛ и курильщиков с нормальной легочной функцией. Воспаленная слизистая бронхов представляет собой гипоксическую среду, для которой характерно увеличение экспрессии HIF-1. Активация HIF-1 подавляет врожденные иммунные механизмы защиты, присущие клеткам бронхоальвеолярного эпителия, усиливает апоптоз альвеолоцитов 2-го типа, препятствуя заживлению эпителия после повреждения, изменяет профиль генной экспрессии альвеолоцитов 2-го типа и угнетает экспрессию сурфактантных протеинов. Для хронического воспаления характерно усиление экспрессии индуцибельной циклооксигеназы-2 (СОХ-2) — фермента, катализирующего превращение арахидоновой кислоты в простагландины (Pg), в частности провоспалительный PgE2. Имеется предположение о функциональной связи HIF-1a-и СОХ-2-сигнальных каскадов, обеспечивающих интеграцию воспалительных и гипоксических регуляторных механизмов в патогенезе заболеваний дыхательных путей. Целью исследования явилась оценка противовоспалительного и регенеративного эффекта предотвращения активации гипоксийного сигналинга на модели ХОБЛ путем ингибирования СОХ-2-зависимого провоспалительного каскада посредством терапии с использованием селективного блокатора СОХ-2. Материалы и методы. Опыты выполнены на крысах-самцах линии Вистар (Федеральное государственное унитарное предприятие «Питомник лабораторных животных "Рапполово"») массой 150—170 г. Исследования проводились в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.10 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики». Модель формирования ХОБЛ воспроизводилась с помощью ингаляционного воздействия 30—40 мг/м3 диоксида азота (N02). Ингаляции проводились в прерывистом режиме (3 экспозиции в день по 30 мин с интервалом 30 мин между ними) на протяжении 90 дней. После 30 дней воздействия N02 животные (n=36) были разделены случайным образом на 2 группы по 18 особей в каждой. Ежедневно в течение последующих дней (перед каждой экспозицией N02) животным 1-й группы через пищеводный зонд вводился высокоселективный ингибитор СОХ-2 целекоксиб (Celebrex, Pfizer, Германия) в дозе 25 мг/кг. Доза рассчитывалась, исходя из суточной дозы, рекомендованной для человека, с учетом межвидового пересчета. Животным 2-й (контрольной) группы аналогичным способом вводился 0,9%-ный раствор натрия хлорида. После 60 и 90 дней экспозиции N02 из каждой группы выводились из опыта по 9 особей. Интактную группу составили 11 особей. Эвтаназия осуществлялась методом цервикальной дислокации. Бронхоальвеолярный лаваж выполнялся на изолированных легких стерильным физиологическим раствором (35—37°С). Бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ) собиралась в силиконированные пробирки; после центрифугирования определялось общее и дифференциальное содержание клеток в 1,0 мл. В пробах БАЛЖ определялось содержание СОХ-2, HIF-1a, интерлейкина-17 (IL-17) и сурфактантного протеина D (SP-D) методом иммуноферментного анализа ELISA с использованием видоспецифичных коммерческих тест-систем Cusabio Biotech (Cusabio Biotech, Китай). Для гистологических исследований легкие расправлялись введением через трахею 10%-го раствора формальдегида. Материал заключался в парафин, срезы толщиной 5—7 мкм окрашивались гематоксилином-эозином и по ван Гизону. Статистическая обработка выполнялась с помощью пакета программ Statistica 6.0 (Windows) с применением критерия достоверности Стьюдента. Количественные данные представлены как среднее ± ошибка среднего (М ± т). Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Результаты и обсуждение. Вдыхание пневмотоксиканта NO2, являющегося важным компонентом сигаретного дыма, активирует эпителиальные клетки бронхов, либо непосредственно воздействуя на рецепторы распознавания, такие как Toll-подобные рецепторы, либо опосредовано — через выделение молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMP). Активированные бронхиальные эпителиоциты реализуют провоспалительные цитокины и хемокины, которые рекрутируют в бронхоальвеолярное пространство клетки воспаления. После 60-дневной экспозиции NO2 содержание нейтрофилов и лимфоцитов в БАЛЖ контрольных крыс превышало таковое в интактной группе соответственно в 4,3 и 1,8 раза (табл. 1). После 90-дневной экспозиции N02 цитограмма БАЛЖ характеризовалась еще большим сдвигом в сторону нейтрофилов, содержание которых в 7,7 раза превышало интактное значение, а содержание макрофагов снижалось в 2 раза по сравнению с нормой (см. табл. 1). Отмеченные изменения цитологического профиля БАЛЖ свидетельствовали о прогрессирующем воспалительном процессе в легочной ткани, что подтверждалось результатами морфологического исследования (рис. 1А). Под влиянием провоспалительных цитокинов и факторов роста в очаге воспаления различными типами клеток (мононуклеарными лейкоцитами, фибробластами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками сосудов) индуцируется синтез СОХ-2. После 60-дневной экспозиции NO2 содержание СОХ-2 в БАЛЖ контрольных крыс в 1,7 раза превышало значение в интактной группе (р < 0,05) и оставалось на высоком уровне при увеличении экспозиции до 90 дней (табл. 2). Содержание HIF-la в БАЛЖ крыс контрольной группы после 60 дней почти в 3 раза превышало интактное значение (см. табл. 2). При увеличении экспозиции до 90 дней наблюдалась тенденция к дальнейшему возрастанию уровня HIF-1a (см. табл. 2). Концентрация в БАЛЖ контрольных крыс провоспалительного цитокина IL-17, основным продуцентом которого являются СD4+Тh17-клетки и в меньшей степени — нейтрофилы и СD8+Тh17-клетки, в 1,5 раза превышала интактное значение при всех сроках экспозиции О2 (р < 0,05) (см. табл. 2). На фоне активации воспалительного процесса снижение в БАЛЖ содержания SP-D, являющегося компонентом врожденной эпителиальной иммунной защиты, составило в контроле около 30% от уровня интактной группы после 60 и 90 дней воздействия N02 (р<0,05) (см. табл. 2), что могло быть связано с повреждением легочного эпителия, апоптозом секретирующих SP-D альвеолоцитов 2-го типа и нецилиарных клеток бронхиол (клеток Клара) и «утечкой» SP-D в системный кровоток. В группах крыс, получавших ингибитор СОХ-2 целекоксиб, отмечалась отчетливая тенденция к нормализации цитологического профиля БАЛЖ: содержание нейтрофилов и лимфоцитов снижалось по сравнению с контролем и не отличалось от интактных значений, нормализовалось содержание альвеолярных макрофагов (см. табл. 1). В результате применения ингибитора СОХ-2 концентрации СОХ-2, HIF-1 и IL-17 в БАЛЖ к 60-му дню экспозиции N02 снижались до значений, достоверно не отличавшихся от интактной группы (см. табл. 2). Более длительное применение целекоксиба (90 дней) сопровождалось еще более выраженным снижением этих показателей (см. табл. 2). Значительно возрастало содержание SP-D в БАЛЖ, превысив примерно в 3 раза значения в контрольной группе (р<0,05) и в 2 раза — интактный уровень (р<0,05) (см. табл. 2). Таким образом, применение ингибитора СОХ-2 целекоксиба позволило предупредить прогрессирование воспалительного процесса в легких, отражением чего явилось снижение притока нейтрофилов и лимфоцитов в бронхоальвеолярное пространство и уменьшение содержания в БАЛЖ провоспалительных медиаторов (СОХ-2, IL-17, HIF-1). Значительное увеличение концентрации SP-D в БАЛЖ в условиях уменьшения воспаления и нормализации клеточно-молекулярного окружения могло свидетельствовать о восстановлении морфофункциональной целостности бронхоальвеолярного эпителия и активации секреторной деятельности альвеолоцитов 2-го типа. По результатам морфологического исследования препаратов легочной ткани крыс, получавших целекоксиб, показано восстановление структуры бронхиального эпителия и отсутствие клеточной инфильтрации межальвеолярных перегородок (рис. 1). Нейтрофильно-лимфоцитарное воспаление, развивающееся под влиянием 60- и 90-дневного воздействия диоксида азота, является характерным признаком ХОБЛ. В привлечении нейтрофилов в дыхательные пути участвует опосредованный IL-17A экстраклеточный цитокиновый сигналинг, регулирующий врожденный иммунный ответ легочных эпителиоцитов. Существенную часть клеточного инфильтрата легких при ХОБЛ составляют клетки фенотипа CD8(+)IL-17. IL-17 отводится важная роль в формировании лимфоидных фолликулов в легочной ткани, наличие которых является признаком прогрессирования воспаления и характерно для модели ХОБЛ, использованной в данной работе. Увеличение экспрессии IL-17A обнаружено в легочной паренхиме и бронхах больных со стабильным течением ХОБЛ, регулярных курильщиков, а также мышей, экспонированных сигаретным дымом. H.Yanagisawa etal. IL-17A рассматривается как патогенная изоформа семейства IL-17, а его рецептор (IL-17RA) — как релевантный рецептор воспаления и фиброза бронхов при ХОБЛ. При ингибировании IL-17A путем введения моноклональных антител снижались уровни IL-17A и IL-8 в БАЛЖ, уменьшался приток нейтрофилов и ослаблялись проявления хронического воспаления дыхательных путей, вызванного воздействием озона. Индукция СОХ-2 в легочном эпителии и паренхиме возникает не только при хроническом воспалении, но и в ответ на воздействие инфекционных факторов и респираторных токсикантов (например, сигаретного дыма и его компонентов, в частности, диоксида азота), что ведет к преобладанию деструктивных сдвигов в бронхоальвеолярном эпителии над регенеративными процессами. Существуют различные предположения относительно механизмов, регулирующих активность СОХ-2-провоспалительного сигнального каскада в легких. Так, репаративный и противовоспалительный эффект введения в эмфизематозные легкие мезенхимальных стволовых клеток связывается с уменьшением экспрессии СОХ-2 и продукции PgE2 посредством блокирования внутриклеточных киназных сигнальных путей р38 МАРК и ERK. Доказано супрессивное действие RelB, члена семейства транскрипционного ядерного фактора каппа-би (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells — NF-xB), на экспрессию СОХ-2 в структурных клетках легких, вызванную сигаретным дымом. Отмечено, что этот механизм может быть опосредован осью RelB-микроРНК- 146а, которая представляет собой новый регуляторный путь, способствующий снижению воспаления в ответ на действие пневмотоксикантов. Воспалительному процессу в бронхах всегда сопутствует гипоксическая среда, при которой возрастает экспрессия HIF-1a. При гипоксии увеличивалась экспрессия гена-мишени HIF-la на уровне мРНК и белка в культуре альвеолоцитов 2-го типа крысы и их апоптоз по сравнению с клетками, культивируемыми при нормоксии. Провоспалительные цитокины фактор некроза опухоли-a/IL-4 индуцировали экспрессию HIF-la в эпителиоцитах бронхов человека. Высокие уровни экспрессии HIF-la и NF-xB и сниженное содержание SP-D определялись в сыворотке крови пациентов с синдромом обструктивного апноэ сна. Как следует из табл. 2, повышенному содержанию HIF-la в БАЛЖ крыс контрольной группы сопутствовало увеличение концентраций провоспалительных СОХ-2 и IL-17 и снижение содержания SP-D. M.Huang et al. установлено, что HIF-1a стимулирует экспрессию фермента СОХ-2 и способствует эпителиально-мезенхимальной трансформации. Под воздействием экстракта сигаретного дыма в культуре клеток альвеолярного эпителия человека А549 и легочной ткани мышей выявлен HIF-la-зависимый характер эпителиально-мезенхимального перехода, при котором бронхиальные и альвеолярные эпителиоциты претерпевали функциональный фенотипический сдвиг с увеличением отложения коллагена, снижением межклеточной адгезии и нарушением барьерной целостности эпителия. В процессе формирования ХОБЛ аналогичные изменения наблюдались в эпителиальной выстилке тонкого кишечника, имеющей, как и легочный эпителий, энтодермальное происхождение — увеличение экспрессии HIF-1a приводило к нарушению плотных межклеточных контактов и барьерной функции эпителия. Увеличение экспрессии HIF-la могло подавлять секрецию из альвеолоцитов 2-го типа SP-D, который обеспечивает развитие адекватного иммунного ответа при действии пневмотоксикантов и патогенов, а также рассматривается как потенциальный биомаркер и регулятор локального и системного воспаления при заболеваниях легких, таких как ХОБЛ. Подавить транскрипционную активность HIF-1a удавалось путем блокирования внутриклеточных сигнальных киназных путей PI3K-mTOR и NF-xB. Критическую роль в регуляции экспрессии HIF-1a играет катализируемая СОХ-2 продукция PgE2, поэтому вполне обоснованным было предположение, что селективные ингибиторы СОХ-2 могут подавлять активность HIF-la, влиять на ядерную релокализацию и предотвращать индукцию транскрипции многочисленных HIF-1 -опосредованных генов. При воздействии селективного ингибитора СОХ-2 (NS398) снижалась экспрессия мРНК HIF-1a, уменьшались синтез HIF-1a и его транскрипционная активность по СОХ-2/PgE2-зависимому механизму, подавлялась активация внутриклеточного PI3K/АКТ/mTOR-сигнального пути. На модели эмфиземы, индуцированной у мышей 20-недельным воздействием сигаретного дыма, противовоспалительный эффект целекоксиба был опосредован его влиянием на экспрессию генов, регулируемых NF-xB-сигналингом, вследствие чего замедлялось прогрессирование эмфиземы. Возможный механизм противовоспалительного эффекта целекоксиба посредством предотвращения активации NF-xB-сигналинга и экспрессии NF-xB-peгулируемых генов, к числу которых относятся HIF-la и СОХ-2, представлен на рис. 2. Итак, целекоксиб является блокатором NF-xB-сигнального пути. В цитоплазме NF-xB находится в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком IxBa. Под влиянием воспалительного стимула происходит фосфорилирование IxBa (IxBa-p) специфической IxB-киназой с последующей деградацией ингибиторного белка убиквитин-протеасомной системой. Свободный NF-xB поступает в ядро и активирует транскрипцию контролируемых генов, в данном случае HIF-1a и СОХ-2. При ингибировании IхВ-киназы (-), опосредованном целекоксибом, блокируется транскрипционная активность NF-xB и последующая экспрессия генов, а также продукция белков HIF-1a и СОХ-2. Заключение. По результатам проведенного исследования впервые заявлено о тесной функциональной и взаимно регуляторной связи системы гипоксийного сигналинга и провоспалительного СОХ-2-опосредованно-го пути, реализующейся в процессе формирования модели ХОБЛ. Применение селективного ингибитора СОХ-2 целекоксиба сопровождалось уменьшением содержания в бронхоальвеолярном пространстве СОХ-2, HIF-1a и провоспалительного цитокина IL-17, а также нормализацией цитологического профиля БАЛЖ, что свидетельствовало о снижении активности гипоксийного сигналинга и воспалительного процесса. Нормализация уровня IL-17 в БАЛЖ крыс, получавших целекоксиб, могло способствовать восстановлению нарушенной в процессе формирования модели ХОБЛ внеклеточной IL-17-зависимой сигнализации. Значительное повышение секреции SP-D можно рассматривать как следствие восстановления морфологической структуры бронхоальвеолярного эпителия, являющейся основой его функциональной полноценности и барьерной целостности. Результаты данного исследования могут стать основой нового подхода к патогенетическому лечению ХОБЛ, при котором превентивное ингибирование транскрипционного генного регулятора гипоксийного сигналинга HIF-1a посредством блокирования СОХ-2 позволит предотвратить прогрессирование воспаления и аномальное ремоделирование дыхательных путей и легочной ткани.

Авторы:

Издание: Пульмонология
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.169-176. Библ. 31 назв.
Просмотров: 131