![]() |
Поиск | Личный кабинет | Авторизация |
ОБРАТИМАЯ АГРЕГАЦИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ТЕЧЕНИИ КРОВИ С ВОЗРАСТАЮЩЕЙ И С УМЕНЬШАЮЩЕЙСЯ СКОРОСТЬЮ
Аннотация:
Цель исследования: изучение агрегации эритроцитов, реализующейся в сдвиговом потоке. Материалы и методы. В пробах крови здоровых добровольцев методом регистрации обратного светорассеяния с использованием коаксиально-цилиндрического агрегометра определяли стандартные гемореологические показатели, а также параметры, характеризующие «гистерезис» — разницу в суспензионном состоянии крови при данной скорости сдвига, но разной предыстории течения (его замедлении или ускорении). Результаты. Результаты позволили определить оптимальный показатель «гистерезиса» и охарактеризовать обратимую агрегацию эритроцитов в сдвиговом потоке комплексным образом. Заключение. Предложенный показатель «гистерезиса» позволяет выявлять ослабление и усиление агрегации эритроцитов в норме; однако требуется дополнительное исследование его эффективности при патологии, сопряженной с гемореологическими нарушениями. Ключевые слова: гемореология, агрегация эритроцитов, гистерезис. ВВЕДЕНИЕ. Широко известная роль обратимой агрегации эритроцитов в формировании гемореологических свойств, а также способность аномально усиленной эритроцитарной агрегации содействовать развитию целого ряда заболеваний, сопряженных с микроциркуляторной патологией, определяют интерес к показателям взаимодействия эритроцитов. Описание агрегации и дезагрегации эритроцитов получают на уровне отдельных клеток, в последнее время — с использованием прогрессивной методики лазерного пинцета, однако разброс в эритроцитарных свойствах, касающийся и агрегируемости клеток, увеличивает риск выявления при этом частных случаев вместо общих закономерностей. Взаимодействие представительной массы эритроцитов изучают как in vitro, в условиях сдвигового течения в агрегометрах или микроканалах (капиллярах), так и in situ (а в отдельных сосудистых регионах — in vivo) при рассмотрении отдельных микрососудов. Информация, получаемая в последнем случае, наиболее реалистична, однако при этом имеются методические ограничения, связанные с необходимостью четкой визуализации отдельных эритроцитов. Эксперименты, проводимые in vitro, несмотря на получение чаще косвенных характеристик, привлекательны возможностью тестировать суспензионное состояние крови при изменении скорости сдвига в широком диапазоне. В эритроагрегометрах принято исследовать так называемую спонтанную агрегацию клеток, которая реализуется в отсутствие течения (после предварительной дезагрегации эритроцитов в высокоскоростном потоке). Затем создается поток, скорость которого ступенчато увеличивается, и определяются показатели гидродинамической прочности эритроцитарных агрегатов. В результате органично связанные между собой агрегация и дезагрегация клеток исследуются по отдельности, не говоря уж о том, что отсутствие течения (при котором тестируется агрегация) не является типичным для микрососудов. Принципиально новый подход был предложен Н.Н. Фирсовым, который зарегистрировал то, что он назвал «петлей гистерезиса агрегационных свойств эритроцитов». Измеряя интенсивность обратного светорассеяния (I) от суспензии помещенных в агрегометр эритроцитов, автор наблюдал за процессом агрегации («а») клеток, последовательно развивающейся в исходно высокоскоростном потоке по мере его пошагового замедления (что уменьшало Iа), и их дезагрегации («d»), происходящей при последующем ускорении течения (что соответственно увеличивало Id). Тестирование эритроцитарной агрегации в относительно естественных условиях (при наличии течения) и возможность сопоставления Iа и Id при сходных значениях скоростей сдвига (y) позволяли надеяться на получение более реалистичных показателей суспензионного состояния крови, имеющих комплексный характер, однако последнее затрудняло интерпретацию получаемых данных. Исходно использовали усредненные параметры, характеризующие «петлю гистерезиса»: площадь между кривыми Iа(y) и d(y) и разницу между значениями I, регистрируемыми при данной в случаях замедления и ускорения течения, т.е. (Ia-Id)(y)> которую усредняли по всем y. Такого рода исследование эритроцитов больных псориатическим артритом и системной красной волчанкой в нативных и гиперосмотических условиях выявило, что показатели «петли гистерезиса» специфическим, хотя и не очень понятным образом отражают общий гемореологический статус пациента, почти не коррелируя с классическими показателями динамики спонтанной агрегации эритроцитов и их дезагрегации в сдвиговом потоке. Эти работы позволили говорить о новых показателях реологических свойств крови, но их интерпретацию и практическое использование затрудняло отсутствие оценки соотношения процессов агрегации и дезагрегации эритроцитов в случае разных гидродинамических условий. Поскольку при высоких скоростях сдвига процессы дезагрегации эритроцитов превалируют над процессами их агрегации, а при низких скоростях сдвига имеется обратная ситуация, более продуктивным представлялся не обобщенный подход, а анализ суспензионного состояния крови в зависимости от Y. Целью данной работы явилось исследование процессов агрегации-дезагрегации эритроцитов в условиях замедляющегося и ускоряющегося течения при разных скоростях сдвига, а также поиск показателей «петли гистерезиса», позволяющих охарактеризовать индивидуальный гемореологический статус. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Материалом исследования явился 101 образец стабилизированной ЭДТА (2 мг/мл) венозной крови, отобранной у клинически здоровых добровольцев: 31 женщины и 29 мужчин (32±15 лет) в первой серии опытов и 21 женщины и 20 мужчин (28±12 лет) во второй серии после получения от них информированного согласия. Протокол опытов был утвержден этической комиссией ФФМ ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова». Первая серия опытов была нацелена на поиск адекватных показателей «гистерезиса», т.е. разницы в суспензионном состоянии крови, реализующейся при данной скорости сдвига, но разной предыстории течения (его замедлении или ускорении). В связи с этим различные показатели «гистерезиса» сопоставляли со стандартными показателями «спонтанной» (происходящей в отсутствие течения) агрегации эритроцитов и гидродинамической прочности агрегатов. Во второй серии опытов оценивали эффективность выявленных показателей «гистерезиса» путем тестирования возможности определения на их основании особенностей индивидуального гемореологического статуса и его изменения со временем (в течение 2-3 недель). Гемореологические свойства исследовали с помощью коаксиально-цилиндрического эритроагрегометра LADE (реологический зазор — 0,9 мм, лямбда=650 нм; РеоМедЛаб, Москва) при гематокрите -40% и температуре 25°С методом регистрации обратного светорассеяния. Стандартные показатели кинетики агрегации-дезагрегации эритроцитов определяли в соответствии с методикой, развитой Н.Н. Фирсовым. При этом агрегация эритроцитов тестировалась в отсутствие течения, после того как кратковременный высокоскоростной поток разъединял все агрегаты клеток. Регистрация изменения интенсивности обратного светорассеяния (I) со временем (Т) позволяла охарактеризовать время протекания первой и второй фаз спонтанной агрегации эритроцитов (путем спрямления экспоненциальной зависимости I(Т) в полулогарифмических координатах и вычисления t1,2 = T/lnI) и скорость самых начальных ее моментов (когда кривая I(Т) лучше аппроксимировалась гиперболой и потому спрямлялась в полуобратных координатах с определением тангенса угла наклона этой прямой, кТb). По окончании процесса агрегации фиксировалась ее «амплитуда» (А) — разность между исходными значениями I, характеризовавшими состояние полной дезагрегации, и значениями I, имевшимися в конце процесса агрегации. Параметр А отражал степень агрегированности клеток, эффективный размер эритроцитарных агрегатов. Последующее создание пошагово ускорявшегося течения (эффективные скорости сдвига у менялись от -2,5 с-1 до -130 с-1) позволяло оценить прочность наиболее крупных агрегатов с помощью параметра I2,5. Параметр I2,5 представлял собой процент тех агрегатов, которые разъединялись при минимальной Y=2,5 с-1 (ему придавался отрицательный знак для превращения I2,5 из показателя легкости распада агрегатов клеток в показатель силы их взаимодействия). Кроме того, определение I(y) позволяло рассчитать показатель гидродинамической прочности основной массы эритроцитарных агрегатов — бета=Y/lnI. Стандартные показатели рассматривались как аномальные (свидетельствующие о наличии «гиперагрегации» или «гипоагрегации»), если они выходили за рамки интерквартильного интервала [Q25; Q75], определенного на основании данных, полученных в первой серии опытов. Оценка «гистерезиса» производилась на основании анализа зависимости I(y), которая регистрировалась сначала в условиях пошагового замедляющегося потока, а потом — при его пошаговом ускорении до исходного состояния. В первом случае происходило постепенное уменьшение I, связанное с развивающейся эритроцитарной агрегацией, которой все меньше препятствовали сдвиговые силы (Iа). Во втором случае, напротив, силы нарастали, и происходило постепенное возрастание I, отражающее увеличивающуюся дезагрегацию клеток (Id). Значения Iа и Id можно было сравнить при данной скорости сдвига. Отказавшись от предложенных ранее обобщенных показателей «гистерезиса», в качестве базовой характеристики мы определяли значения параметра L(y) = Ia(y) - Id(y) при каждой из использованных скоростей сдвига, т.е., при -80 с-1, -50 с-1, -30 с-1, -18 с-1, -11 с-1, -7 с-1 и -4 с-1 с обозначением параметра L(y), соответственно, как L(80), L(50), L(30) и т.д. Статистический анализ проводили с помощью пакета программ SPSS11.5. Распределение данных оценивали с использованием статистики Shapiro-Wilk. Разные группы данных сравнивали с помощью one way ANOVA или теста Kruskal-Wallis. Оценка изменения параметров со временем производилась с помощью парного t-критерия Стьюдента или критерия Wilcoxon. Корреляционную связь характеризовали, используя статистику Spearman. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде средних значений (М)± стандартное отклонение (SD) за исключением специально оговоренных случаев, когда при отсутствии нормального распределения представлены медиана (Me) и интерквартильный размах [Q25; Q75]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сопоставление L(y) — разницы между суспензионным состоянием крови, регистрируемым при одной и той же скорости сдвига, но при разной предыстории течения, со стандартными показателями агрегации-дезагрегации эритроцитов (кТb, tl,2, A, I2,5, бета, проведенное в первой серии опытов, выявило слабую, но значимую корреляцию между значениями L(y) и А — р изменялось от 0,29 (р<0,05) при высоких Y (для L(80)) до 0,46 (р<0,001) при низких у (для L(4)). Имелась корреляционная связь между L(80) и бета(р=0,36; р<0,01), а также между L(7) и L(4), с одной стороны, и кТb (р составляло -0,63 и -0,65, соответственно; р< 0,001), t1 (р составляло 0,48 и 0,50, соответственно; р<0,001) и бета(р составляло -0,38 и -0,41, соответственно; р<0,01), с другой. Положительная корреляционная связь между значениями L(80) и бета была вполне ожидаемой. Действительно, L=(la-Id), причем более агрегированному состоянию эритроцитов соответствует меньшее значение обратного светорассеяния I. При y~80 с-1 дезагрегация преобладает над агрегацией, и увеличение прочности агрегатов (бета), уменьшающее Id, могло увеличивать L(80). При низких скоростях сдвига (7 с-1, 4 с-1) уменьшение скорости первых моментов взаимодействия эритроцитов (кТb), как и увеличение времени всей первой фазы этого процесса т.е. возрастающее затруднение превалирующей в этом случае агрегации, могло отражаться в том, что Iа уменьшалось все в меньшей степени, увеличивая L(7) и L(4). Менее очевидными представлялись основания для обратной корреляционной связи между L(7) L(4) и бета. Увеличение бета должно было бы уменьшать Id, увеличивая L(7) и L(4); однако при малых скоростях сдвига вклад дезагрегации эритроцитов в суспензионное состояние крови мог быть пренебрежимо малым, так что увеличение бета могло сигнализировать не столько о затруднении собственно эритроцитарной дезагрегации, сколько о крене процессов агрегации-дезагрегации в сторону «гиперагрегации». Действительно, между показателями скорости агрегации и прочности агрегатов имелась положительная корреляционная связь (для кТb и бета р=0,58; р<0,001), а увеличение скорости агрегации (снижение Iа) могло уменьшать (Ia-Id), т.е., уменьшать L(7) и L(4) даже в случае связанного с возрастанием прочности агрегатов уменьшения Id, если показатель Iа изменялся в большей мере, чем Id. Проведенный анализ выявил связанные со скоростью сдвига различия в соотношении между стандартными показателями взаимодействия эритроцитов и показателями «гистерезиса» — агрегации-дезагрегации клеток, реализующейся при данной скорости сдвига, но разной предыстории течения (в случаях замедления потока или его ускорения). Результаты подтвердили правильность предпринятого нами перехода от использованных ранее обобщенных показателей «гистерезиса» к параметрам, характеризующим состояние крови в зависимости от скорости сдвига. Тем не менее параметр L(y) не проявил себя как единственный адекватный показатель «гистерезиса», в частности, из-за того, что на разность между Iа и Id влияла общая способность эритроцитов к взаимодействию. Подобно тому, как размах колебаний какого-либо параметра возрастает при увеличении усиления, значения L(y) возрастали при больших значениях общей «амплитуды» агрегации, что проявлялось в упомянутой корреляции между значениями L(y) и А. В связи с этим мы проверили, насколько информативен другой показатель — разность между значениями параметра L, полученными при двух «соседних» скоростях сдвига, т.е. (L(yi,1 )-L(уi)), приведенная к единице скорости сдвига (в дальнейшем она обозначается как дельтаI(уi,1-уi). Определение дельтаL(yi-1-уi) отражено в формуле (1). В последующих объяснениях использовалось уравнение (2), полученное в результате простого преобразования (1). где y, ступенчато изменялась от -80 с-1 до -4 с-1 (соответственно, при описании параметра дельтаI(yi-1-yi) в дальнейшем используются обозначения дельтаL(50-80),дельтаI(30-50) и т. д.) С учетом естественного допущения того, что при меньшей скорости сдвига (ум в уравнениях 1, 2) из-за большей степени агрегированномти эритроцитов Iа и Id будут меньше, чем при yi-1 очевидно, что (Iа,уi-1) - Iа(yi)<0 и (Id(yi-1 - Id(yi))<0. Из уравнения 2 видно, что если в области yi - yi-1 агрегация клеток (в процессе перехода от yi к y1-i) стимулируется в большей мере, чем их дезагрегация (в процессе перехода от уi-1 к уi), т. е. |Iа(yi-1) - Ia(yi)| > > |Id(yi-1) - Id(yi)|, то дельтаLI(yi-1-yi) < 0 и наоборот. Действительно, оказалось, что если в последовательности дельтаL(50-80), дельтаI(30-50), дельтаI(18-30), дельтаL(11-18), дельтаL(7-11), дельтаL<4-7) положительные значения дельтаL(уi-1-уi) наблюдались в случаях лишь двух первых дельтаL(уi-1-уi), а также трех первых, четырех и пяти, то в этом ряду прогрессивно нарастали признаки усиления процессов дезагрегации, выявляемые с помощью стандартных показателей (табл. 1). Тестирование соотношения процессов агрегации-дезагрегации на основании зависящего от скорости сдвига знака дельтаL(уi-1-уi) оказалось очень простым и вполне эффективным, но все-таки недостаточным, о чем свидетельствовали другие, более изощренные варианты динамики дельтаL(уi-1-уi), а также корреляционные связи между этим показателем и стандартными гемореологическими характеристиками. При понижении от -80 с-1 до -4 с-1 простой переход от положительных значений дельаL(yi-1-уi) к отрицательным наблюдался достаточно часто: в 80% случаях, т.е. в 48 пробах крови, 47 из которых описаны в таблице 1; еще в одном случае параметр дельтаL(50-80) был положительным, а остальные дельтаL(yi-1-уi)<0, и этот случай не противоречил данным таблицы 1. Тем не менее в 6 пробах не было четкого перехода от положительных дельтаL(уi-1-уi) к отрицательным; иногда дельтаL(50-80) было отрицательным, а далее положительные и отрицательные значения могли чередоваться. Кроме того, еще в 6 пробах после смены исходно положительных дельтаL(уi-1-yi) отрицательными, в последние могли вкрапливаться положительные дельтаL(уi-1-уi). Частичная разгадка этого явления обнаружилась при анализе корреляционных связей между параметром дельтаL(уi-1-yi) и стандартными показателями агрегации-дезагрегации эритроцитов (табл. 2). В области скоростей сдвига от -30 с-1 до -11 с-1 меньшим значениям параметров дельтаL(18-30) и дельтаL(11-18) соответствовали большие значения показателей скорости агрегации и прочности агрегатов. Наличие связи со стандартными параметрами, характеризующими как агрегацию эритроцитов, так и их дезагрегацию, отражало комплексный характер дельтаL(уi-1-уi) как показателя обоих процессов в целом. Это подтвердилось и при другом способе обработки данных, когда в целях сравнения разномастных показателей была проведена процедура их ранжирования: для дельтаL(уi-1-уi) — от минимальных к максимальным значениям, а для стандартных показателей — от значений, характерных для «гипоагрегации», к значениям, свойственным «гиперагрегации». При этом наибольшие коэффициенты корреляции наблюдались при сравнении рангов дельтаL(уi-1-уi) не с рангами отдельных стандартных показателей, а с усредненными рангами показателей как скорости агрегации, так и прочности агрегатов: в случае дельтаL(18-30) р=-0,721 (р<0,001); в случае дельтаL(11-18) р=-0,644 (р<0,001). Объяснение характера этой взаимосвязи кроется во влиянии увеличения скорости агрегации и прочности агрегатов на 1а(у) и Id(y), соответственно (см. уравнение 2). Нарастание скорости агрегации могло проявляться эффективнее при более благоприятных для взаимодействия клеток условиях, уменьшая Iа(y) в большей мере, чем Iа(y). Аналогичным образом проявления увеличения прочности агрегатов могли быть более значительными в условиях, которые в большей мере благоприятствовали дезагрегации, т. е. при большей, что могло выражаться в большем уменьшении Id(y) по сравнению с Id(уi-1). В обоих случаях результирующий параметр дельтаL(yi-1-уi.) мог понижаться. Более загадочной казалась корреляционная связь между дельтаL(30-50) и кТь, а также между AL(7-11) и бета. Она была отрицательной, и в этом смысле к ней было применимо только что приведенное объяснение; однако оказалось неожиданным то, что в случае высоких скоростей сдвига (препятствующих агрегации клеток) значения дельтаL(yi-1-уi) коррелировали лишь со значениями показателей скорости агрегации, а при низких скоростях сдвига (едва способных разъединять агрегаты), напротив, лишь со значениями показателей прочности агрегатов. Возможное объяснение состоит в том, что в этих областях весьма высоких или низких значений у, процессы, соответственно, дезагрегации или агрегации могли уже не вносить весомого вклада в изменение параметра дельтаL(i-1-уi), поскольку практически завершились до этого, что демаскировало действие чрезвычайно усиленных агрегации (при высоких у) и дезагрегации (при низких у). При этом увеличенная агрегация могла уменьшать дельтаL(yi-1-уi) (за счет преимущественного снижения Iа(уi-1); см. уравнение 2) вплоть до того, что с увеличением у значения этого параметра парадоксальным образом могли становиться меньше (табл. 3, случай 3), а не больше, как это должно было бы происходить при последовательном нарастании дезагрегации. Вместе с тем, если последовательное нарастание дельаL(уi-1-уi) от дельтаL(50-80) к дельаL(30-50) и далее выявлялось там, где дельтаL
Авторы:
Соколова И.А.
Издание:
Тромбоз гемостаз и реология
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.54-62. Библ. 11 назв.
Просмотров: 191