ЛИМФОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНАЯ АДГЕЗИЯ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ - НОСИТЕЛЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА НЕКОТОРЫХ ТОЛЛ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Аннотация:

Цель исследования: изучить феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегационную активность тромбоцитов (спонтанную и индуцированную) у больных ишемическим инсультом (ИИ) в динамике заболевания с учетом носительства генетического полиморфизма некоторых толл-подобных рецепторов (TLRs) и генетического индекса. Материалы и методы. Обследовано 115 больных ИИ и 94 относительно здоровых резидента. Лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс оценивали как среднее арифметическое количество тромбоцитов, присоединившихся к одному лимфоциту. Материалом для молекулярно-генетического анализа TLRs служили образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови. Результаты. Выявлено, что предикторами ИИ являются аллели -753Arg TLR2, -249Pro TLR6, -1237С TLR9 и генотипы -753Arg/Arg TLR2, -299Asp/Asp TLR4, -249Pro/Pro TLR6 с относительным риском от 1,49 до 3,35. В крови больных ИИ многократно увеличено число лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов (ЛТА). Заключение. Для развития инсульта имеет значение не только качество полиморфных маркеров, но и количество предикторных аллельных вариантов. Чем выше индивидуальный генетический индекс, тем больше в острейший период острого нарушения мозгового кровообращения в кровотоке образуется ЛТА; их количество снижается до контрольных значений к 21 дню заболевания. Ключевые слова: ишемический инсульт, лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия, толл-подобные рецепторы. ВВЕДЕНИЕ. Ишемический инсульт (ИИ), имея тенденцию к увеличению, занимает второе место в структуре общей смертности и первое среди причин стойкой утраты работоспособности и инвалидизации населения многих стран. Очень велики экономические и социальные последствия заболевания, поэтому актуальность проблемы инсульта можно с полным основанием определить как чрезвычайную. В последнее время исследователи стали уделять особое внимание роли толл-подобных рецепторов (TLRs) в патогенезе многих заболеваний, и это не случайно, поскольку доказано их непосредственное участие в инициации иммунной системы не только при инфекционной патологии. Полиморфизм генов TLRs за счет специфических аллелей вносит существенный вклад в персональные особенности развития защитных реакций, а также предрасположенность к целому ряду заболеваний. Гиперактивация этих рецепторов служит важнейшим патогенетическим фактором воспалительных неинфекционных заболеваний. В настоящее время активно изучаются и межклеточные взаимодействия, регулируемые цитокинами. Доказано, что расстройства микроциркуляции являются важным фактором, приводящим к инфаркту миокарда и инсульту. В отдельных работах показано, что при атеросклерозе и ишемической болезни сердца (ИБС), являющимися факторами риска развития ИИ, значительные изменения претерпевает лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия (ЛТА). В связи с этим целью исследования явилась оценка состояния ЛТА и агрегационной активности тромбоцитов у больных ИИ при полиморфизме генов толл-подобных рецепторов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Все обследованные были разделены на 2 группы — клиническую и контрольную. В клиническую вошли 115 больных ИИ, средний возраст которых составил 60[54; 66] лет. Контрольную группу составили 94 человека, проживающих в городе Чита и считающих себя относительно здоровыми, в возрасте 51[45; 55] год. Исследование ЛТА проводили по методу Ю.А. Витковского и др. на свежей цитратной крови. Лимфоцитарно-тромбоцитарные коагрегаты подсчитывали на 100 клеток путем световой микроскопии в камере Горяева. Лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ) оценивали как среднее арифметическое количества тромбоцитов, присоединившихся к одному лимфоциту. Материалом для молекулярно-генетического анализа толл-подобных рецепторов — TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe412Leu), TLR4 (Asp299Gly), TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T-1237C) служили образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови реагентами ДНК-Экспресс-кровь (НПФ «Литех», Москва). Амплификацию фрагментов генов проводили в термоциклере «Бис-М112» (ООО «Бис-Н», Новосибирск). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем ультрафиолетовом свете. Полученные результаты трактовали согласно инструкции производителя. Отбор проб крови осуществляли в первые сутки от начала инсульта. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программ Microsoft Excel 2007, BioStat, Statistica 6,0 (StatSoft Inc., США). Кроме этого вычисляли индивидуальный генетический индекс, являющийся ранжированной величиной, характеризующей совокупный эффект носительства изучаемого генетического полиморфизма (кумулятивная полимерия) в группе, соответственно с учетом, что нормальная гомозигота — это «1», гетерозигота — «2», мутантная гомозигота — «3» для TLR6 (Ser249Pro) и TLR9 (Т-1237С); для TLR2 (Arg753Gln) и TLR4 (Asp299Gly) нормальная гомозигота принималась за «3», гетерозигота — за «2», мутантная гомозигота — за «1». Формула расчета индивидуального генетического индекса (IGI) для каждого обследованного: где А — числовое значение генотипа; HP — выявленный генотип полиморфизма определенного толл-подобного рецептора; N — количество генотипов. После унификации (когда качественные показатели переводятся в количественные, соизмеримые по значимости) и суммации баллов находили медиану (М) и сравнивали с подобными значениями здоровых пациентов с помощью критерия РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В результате исследования обнаружены все искомые аллели в гомо- и гетерозиготном состоянии. При сравнении частот аллелей и генотипов изучаемых TLRs в клинической и контрольной группах отчетливые различия наблюдались по генотипу -753Arg/Arg TLR2 с большей частотой встречаемости последнего у больных ИИ (р=0,02). Генотип -753Arg/Gln TLR2 и аллель -753Gln данного рецептора чаще встречался (р=0,02; р=0,01; соответственно) у здоровых резидентов (табл. 1). Относительный риск развития (RR) ИИ у носителей генотипа Arg/Arg составил 2,41 [CI 95%: 1,33-4,36], для обладателей генотипа Arg/Gln — 0,44 [CI 95%: 0,24-0,81], для лиц, имеющих дикий аллель — 2,21 [CI 95%: 1,29-3,78], для резидентов, несущих мутантный аллель — 0,45 [CI 95%: 0,26-0,78]. Следует отметить, что у мышей с дефектом TLR2 при ишемическом/реперфузионном повреждении отмечается существенно более слабый воспалительный ответ и меньшая инфильтрация лейкоцитами клеток канальцев почек. Было отмечено, что генотип -Arg/Arg TLR2 (Arg753Gln) при ряде заболеваний связан с возникновением воспалительной реакции. Исследование идентичного полиморфизма у китайского населения, страдающего ИБС, показало отсутствие мутантного аллеля. Согласно выводам британских ученых, экспрессия TLR2 наблюдается в атеросклеротических бляшках, что, в свою очередь, вызывает воспаление стенки сосуда и в последующем приводит к отрыву бляшек и тромбов. Учитывая данные литературы и результаты наших исследований, можно высказать предположение, что наличие дикого аллеля TLR2 (Arg753Gln), особенно в гомозиготном состоянии, должно способствовать развитию мощной воспалительной реакции в сосудистой стенке. У больных острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК) обнаружено более частое носительство нормального аллеля TLR4 (Asp299Gly) — 0,783 против 0,707 у здоровых респондентов (р< 0,0001). Генотип Gly/Gly TLR4 наблюдался чаще у больных с ОНМК. Относительный риск развития у носителей генотипа Asp/Asp составил 2,82[CI 95%: 1,59-5,02], у гетерози-гот — 0,16[CI 95%: 0,08-0,33], у мутантных гомозигот — 2,72[1,03-7,16], у носителей дикого аллеля — 1,49[CI 95%: 0,96-2,32], у носителей минорного аллеля — 0,67[CI 95%: 0,43-1,05]. В литературе имеются данные о том, что маркер -299Gly гена TLR4 ассоциирован со снижением иммунного ответа на липополисахариды (ЛПС) бактерий в результате уменьшения клеточной экспрессии и дальнейшего прекращения взаимодействия TLR4 с ЛПС. Доказано участие TLR4 в развитии экспериментального церебрального инфаркта. Более того, ряд авторов отмечает, что наличие аллеля -299Gly гена TLR4 вносит существенный вклад в процесс атерогенеза. Столь противоречивые результаты не позволяют сделать однозначных выводов, но дают возможность предположить, что носительство генотипа Asp/Asp и Asp-аллеля TLR4 (Asp299Gly) повышает риск развития атеросклероза, а впоследствии и инсульта. Гетерозиготное носительство аллелей несет на себе защитную функцию, предотвращая возникновение инсульта, либо способствуя течению ОНМК в более легкой форме. Среди больных значительно чаще встречались носители Рrо/Рrо-генотипа и Pro-аллеля TLR6 (р=0,0002), для которых степень риска развития заболевания составила 3,2 [CI95%: 1,81-5,67] и 2,14[CI 95%: 1,43-3,21], соответственно. Гетерозигот среди больных оказалось меньше, чем в группе контроля (р=0,0002); для них степень риска развития инсульта составила 0,38[CI 95%: 0,21-0,69]. Носителей дикого аллеля TLR6 (Ser249Pro) было больше среди здоровых резидентов (р=0,0002), относительный риск развития цереброваскулярной патологии составил 0,47[CI 95%: 0,31-0,7]. Подобные результаты были получены у жителей Кавказа, больных ИБС. Высказано предположение, что Ser-аллель TLR6 защищает сосуды от развития атеросклероза. Нормальный аллель TLR6 (Ser249Pro) приводит к уменьшению числа так называемых «функциональных карманов» во внеклеточной части толл-подобного рецептора, богатой лейцином (LRR), что делает белок менее доступным для связывания с лигандами. Напротив, Pro-аллель увеличивает количество «карманов». Ser/Ser генотип снижает активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB и выработку интерлейкина IL-6 и тем самым уменьшает риск развития атеросклероза. Таким образом, Рго-аллель имеет предикторную направленность к ОНМК, а Ser-аллель обладает протективными свойствами. При сравнении частот по полиморфному варианту TLR9 (Т-1237С) у лиц клинической группы отмечалось более частое носительство мутантного аллеля по отношению к обследуемым контрольной группы (р=0,03); относительный риск заболевания для больных с ОНМК оказался равным 1,93 [CI 95%: 1,06-3,5], причем данный показатель для обладателей аллеля -1237С в гомозиготном состоянии составил 3,35[CI 95%: 0,37-30,51] (табл. 1). Следовательно, носительство мутантного аллеля как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии может предрасполагать к цереброваскулярной патологии. По данным В. Beulter, С-аллель полиморфного маркера TLR9 (Т-1237С) создает повышенное сродство к NF-kB, что, в свою очередь, увеличивает транскрипционную активность генов и, как следствие, приводит к росту продукции цитокинов и хемокинов]. Следующим этапом исследования было вычисление индивидуального генетического индекса с целью оценки аддитивного влияния предиктивных аллелей на развитие заболевания. Мы отметили, что IGI в пределах 2,2-2,4 (то есть наличие в геноме более двух рисковых аллелей изучаемого полиморфизма) чаще наблюдался у больных ИИ (хи2=9,5; р=0,02), в то время как IGI=1,4—1,6 встречался реже (хи2=8,9; р=0,03), чем в контрольной группе (табл. 2). Таким образом, чем больше количество аллельных вариантов, повышающих риск возникновения ИИ, тем выше риск развития данного заболевания. Адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения с последующим развитием воспаления. В настоящее время показано, что расстройства микроциркуляции являются важным фактором, приводящим к инфаркту миокарда и инсульту. В норме 3-5% лейкоцитов периферической крови группируются в агрегаты, в то время как при ряде патологических состояний этот показатель увеличивается до 45%. Как и в предыдущих исследованиях, нами установлено значительное увеличение ЛТА и ЛТИ в остром периоде ОНМК, преимущественно на первые и десятые сутки болезни (u, р<0,001) (табл. 4). В динамике заболевания прослеживалась тенденция к постепенному снижению данных показателей к завершению острого периода до значений в контрольной группе. Также увеличение агрегатов наблюдалось и у больных с инфарктом миокарда. В то же время у пациентов со стенокардией по сравнению со здоровыми отмечалось снижение ЛТА и ЛТИ. Не исключено, что эти сдвиги связаны с гиперфункцией тромбоцитов. Нами были выявлены разнонаправленные сдвиги ЛТА и ЛТИ у носителей различных аллелей генетического полиморфизма TLRs. Определено, что в первые сутки заболевания у носителей минорного аллеля TLR9 (Т-1237С) количество адгезированных тромбоцитов на лимфоците больше (u, р <0,05), чем у обладателей дикого аллеля (табл. 3). Больные с IGI>2,4 имели большее значение ЛТА и ЛТИ в первые и десятые (u, р>0,05) сутки инсульта в отличие от больных с меньшим IGI (u, р<0,05). Отмечена следующая тенденция: чем больше предиктивных аллелей в геноме у больного ИИ, тем меньшее количество ЛТА регистрируется в кровотоке к 21 суткам заболевания (табл. 5). Можно предполагать, что носительство рисковых аллелей опосредованно через экспрессию толл-подобных рецепторов и систему цитокинов влияет на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Таким образом, носительство отдельных аллельных вариантов не оказывает влияния на феномен ЛТА, однако комплексное носительство рисковых аллелей в геноме косвенным путем ассоциировано с изменением этой функции. ВЫВОДЫ. 1. Предикторами ИИ являются аллели -753Arg TLR2, -249Pro TLR6, -1237С TLR9 и генотипы -753Arg/Arg TLR2, -299Asp/Asp TLR4, -249Pro/Pro TLR6 с относительным риском от 1,49 до 3,35. 2. Для развития инсульта имеет значение не только качество полиморфных маркеров, но и количество предикторных аллельных вариантов. 3. В крови больных ИИ многократно увеличивается число ЛТА. Чем выше индивидуальный генетический индекс, тем больше в острейший период ОНМК в кровотоке образуется ЛТА; их количество снижается до показателей контрольной группы к 21 дню заболевания.

Авторы:

Издание: Тромбоз гемостаз и реология
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.63-69. Библ. 20 назв.
Просмотров: 61