ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ ЛОНГОЛИТИНА И ЕГО ПРОДУЦЕНТА-МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ARTHROBOTRYS LONGA — С АНТИТРОМБОТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТОМ ПИЯВИТОМ

Аннотация:

Цель исследования: изучение взаимодействия комплекса протеолитических ферментов препарата лонголитин из анаморфного гриба Arthrobotrys longa с антикоагулянтным и антитромботическим препаратом пиявитом. Материалы и методы. Препарат пиявит смешивали в разных разведениях с различными концентрациями лонголитина и определяли фибринолитическую активность (ФА) смеси. В другой серии опытов пиявит добавляли в погруженную культуру гриба-продуцента. По окончании эксперимента в пробах культуральной жидкости (КЖ) определяли ФА. Антикоагулянтные свойства КЖ измеряли методом рекальцификации и записи тромбоэластограммы при добавлении КЖ к плазме крови здоровых интактных крыс. Результаты. В опытах in vitro пиявит дозозависимо угнетал ФА лонголитина до полного ее подавления при концентрации 16 мг/мл. Добавление пиявита к культуре гриба-продуцента вызывало усиление биосинтеза препарата с увеличением ФА. КЖ при этом обладала высокой антикоагулянтной активностью. Время рекальцификации и показатель R тромбоэластограммы в КЖ были статистически достоверно удлинены, увеличивалась и антиполимеризационная активность КЖ. Заключение. Совместное применение двух антитромботических средства (лонголитина и пиявита) в исследовании in vitro привело к уменьшению фибринолитических, а значит, и тромболитических свойств лонголитина. Таким образом, одновременное использование этих препаратов требует осторожности. Ключевые слова: фибринолитическая активность, тромболитическая активность, лонголитин, пиявит, противотромботическое действие, Arthrobotrys longa. ВВЕДЕНИЕ. Биология и медицина особенно тесно соприкасаются в области микробиологии, поскольку многие медицинские препараты являются в основе продуктами жизнедеятельности различных микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов. Таков препарат лонголитин, представляющий прочный комплекс протеиназ, образующийся в процессе развития анаморфного гриба Arthrobotrys longa и выделяющийся в культуральную жидкость. Препарат интенсивно изучается как потенциальное тромболитическое средство на различных экспериментальных моделях тромбозов и как профилактическое средство при пероральном и ректальном использовании для повышения общего противотромботического фона крови. Важными направлениями этих исследований является, с одной стороны, изыскание способов увеличения фибринолитических и тромболитических свойств протеолитического комплекса, а с другой — стимуляция биосинтеза лонголитина в глубинной культуре Arthrobotrys longa. Ранее было показано, что активность лонголитина возрастает при невысокой концентрации гепарина и не меняется под влиянием ацетилсалициловой кислоты и различных ионов — кофакторов биохимических реакций: Са2+, Zn2+, Mg2+. Наше внимание привлек отечественный антикоагулянтный и антитромботический препарат пиявит, который используется в различных областях медицины для улучшения реологических свойств крови. Мы предположили, что совместное применение двух противотромботических средств — лонголитина и пиявита — усилит тромболитические свойства лонголитина. Цель работы: изучение взаимодействия комплекса протеолитических ферментов препарата лонголитина из анаморфного гриба Arthrobotrys longa с антикоагулянтным и антитромботическим препаратом пиявитом. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Работа проводилась in vitro. Использовали лонголитин, полученный в лаборатории биологически активных веществ биологического факультета ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова», в концентрации 1-4 мг/мл при фибринолитической активности 100-400 мм2. Фибрино-литическую активность (ФА) определяли на фибриновых пластинах, приготовленных из 0,3% раствора фибриногена (стандартные пластины), и на пластинах с инактивированным плазминогеном, вычисляя произведение двух перпендикулярных диаметров зон лизиса. Инактивацию плазминогена производили прогреванием пластин при 86°С в течение 30 минут (прогретые пластины). Функциональную активность активатора плазминогена определяли как разность ФА стандартной и прогретой пластин и выражали в процентах. Препарат пиявит для эксперимента получали, используя коммерческий препарат пиявит фирмы «ОАО Гирудин». Исходную суспензию (16 мг/мл) центрифугировали 15 минут при 2000 оборотах в минуту с последующим разведением надосадочной жидкости физиологическим раствором до необходимой концентрации. Пиявит смешивали в равных объемах разных разведений с различными концентрациями лонголитина и определяли ФА лонголитина через 5 часов инкубации при 37°С по сравнению с контролем, где вместо пиявита использовали физиологический раствор. В другой серии опытов пиявит (10 мл в концентрации 30 мг/мл) добавляли в колбу с культурой гриба Arthrobotrys longa (200 мл), где гриб выращивали в течение 5 суток. В контрольную колбу вносили 10 мл физиологического раствора. По окончании культивирования отбирали пробы культуральной жидкости и определяли в ней ФА лонголитина на стандартных и прогретых фибриновых пластинах и активность активатора плазминогена в течение 1,5-3-5 часов инкубации при 37°С, а также антикоагулянтные свойства методом рекальцификации и записи тромбоэластограммы на тромбоэластографе Hellige (Германия) при добавлении культуральной жидкости к плазме крови здоровых интактных крыс. Статистическая обработка проводилась с применением критерия Стьюдента. Для описания количественных данных использовали среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (ш). Различия считали статистически значимыми при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В опытах in vitro в пределах используемых нами концентраций препарата лонголитина (1-4 мг/мл) при активности 100-400 мм2 и применяемой максимальной дозы пиявита 16 мг/мл происходило полное (100%) торможение ФА лонголитина (рис. 1). Полученный эффект ингибирования ФА вместо ожидаемой ее активации с использованием той же направленности препарата, несомненно, представляет практический интерес. Это касается тех областей медицины, где протеолитические ферменты являются патогенетическими, лечебными средствами, например, в тромболитической терапии и энзимотерапии. Дополнительное применение пиявита для необходимого усиления противотромботического фона при тромболитической терапии и улучшения реологических свойств крови, всегда полезное при энзимотерапии, может привести к обратному эффекту — ингибированию активности протеиназ — основных лекарственных агентов, и, таким образом, к ухудшению лечения. Однако в отличие от довольно высоких доз пиявита более низкие концентрации препарата (<16 мг/мл) не ингибировали лонголитин полностью, а дозозависимо снижали его ФА (рис. 1). Меняя эти соотношения, можно контролировать в смеси преобладание либо тромболитических, либо антикоагулянтых свойств, необходимых в данной конкретной ситуации. Достоверность таких предположений требует, однако, подтверждения в экспериментах in vivo. В другой серии опытов мы изучали действие пиявита на биосинтез лонголитина мицелием Arthrobotrys longa в погруженной культуре. Мы сравнивали ФА культуральной жидкости в колбе с пиявитом (опыт) и в колбе с физиологическим раствором (контроль) в динамике на протяжении 1,5-3-5 часов (рис. 2). Во всех трех точках ФА в опыте была больше, чем в контроле; она нарастала во времени, достигая достоверной разницы через 5 часов инкубации. Таким образом, в отличие от опытов in vitro, добавление пиявита в среду для глубинного культивирования гриба стимулировало биосинтез мицелием протеолитического комплекса лонголитина. Такой эффект вполне ожидаем, учитывая биологию гриба Arthrobotrys longa. Гетеротрофный способ питания продуцента лонголитина гриба Arthrobotrys longa как почвенного сапротрофа обуславливает наличие в мицелии большого количества экзопротеиназ. Поэтому появление в среде пиявита, представляющего огромный набор ингибиторов самых разных протеиназ, может явиться тревожным сигналом разрушения привычной экосистемы, а значит стимулом к включению регуляторных адаптационных механизмов, восстанавливающих нарушенное равновесие. Одним из таких регуляторных инструментов вполне возможен усиленный запуск синтеза мицелием протеиназ, входящих в состав лонголитина, в результате чего его активность достоверно увеличивается по сравнению с культурой без пиявита. Таким образом, пиявит так изменил «биологию гриба» Arthrobotrys longa, что в культуральной жидкости стало возможным совместное существование высокой активности лонголитина и достаточной концентрации пиявита, о присутствии которого можно судить по свойственному пиявиту антикоагулянтному действию. Действительно, в культуральной жидкости регистрируется высокая антикоагулянтная активность. Культуральная жидкость обладает высокой антикоагулянтной активностью — время рекальцификации и показатель R тромбоэластограммы статистически достоверно удлинены (табл. 1). Антиполимеризационная активность, характеризующаяся параметром К тромбоэластограммы, также увеличена. Возможно, под действием пиявита на клетки мицелия гриба в культуральной жидкости остаются фракции пиявита, обладающие высокими антикоагулянтными свойствами, а другие фракции, включая ингибиторы протеиназ, адсорбируются на мицелии либо метаболизируются им, стимулируя синтез лонголитина. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Проблема взаимодействия лекарственных препаратов, особенно в такой распространенной и опасной области как сердечно-сосудистые заболевания, связанные с тромбозами, очень важна. Два антитромботических средства — разрабатываемый тромболитический комплекс лонголитин и фармакологический препарат пиявит, предполагавших усиление тромболизиса при совместном применении, в исследовании in vitro в большой зоне концентраций и активностей привели к уменьшению фибринолитических, а значит и тромболитических свойств лонголитина, и поэтому к ослаблению возможного клинического эффекта. Таким образом, они могут быть использованы одновременно с осторожностью. Нужен специальный подбор условий, при которых обе активности сосуществуют. Добавление пиявита к культуре гриба Arthrobotrys longa — продуцента лонголитина — приводило к усилению продукции препарата. Стимуляция фибринолитических свойств культурой гриба Arthrobotrys longa, скорее всего, ответная реакция мицелия на появления в среде большого количества ингибиторов протеиназ, содержащихся в пиявите. Нужны эксперименты in vivo на животных для изучения реальных взаимодействий.

Авторы:

Издание: Тромбоз гемостаз и реология
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.88-92. Библ. 10 назв.
Просмотров: 46