ОСОБЕННОСТИ УЧАСТИЯ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ В МЕХАНИЗМАХ СОХРАНЕНИЯ, НАРУШЕНИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПАМЯТИ УСЛОВНОЙ ПИЩЕВОЙ АВЕРСИИ

Аннотация:

Исследовали участие процессов метилирования ДНК в механизмах сохранения памяти, ее реконсолидации, индукции амнезии, а также восстановления памяти условной пищевой аверсии у виноградных улиток. Обнаружено, что инъекции ингибитора ДНК-метилтрансфераз в течение 3 сут, сочетанные с напоминанием условным пищевым стимулом, не влияли на сохранность памяти. Инъекции ингибитора ДНК-метилтрансфераз не подавляли индукцию амнезии, вызываемую применением антагониста NMDA-рецепторов/напоминания. Инъекции ингибиторов ДНК-метилтрансфераз, сочетанные с напоминанием, через 3 сут после индукции амнезии приводили к восстановлению памяти. Ингибиторы ДНК-метилтрансфераз в одних и тех же дозах не влияли на хранение и реконсолидацию памяти, а также на механизмы индукции амнезии. Вместе с тем инъекции ингибиторов приводили к восстановлению памяти, по-видимому, вследствие нарушения процессов реактивации и развития амнезии. Полагают, что в основе механизмов долговременной памяти лежат перестройки генетического аппарата нейронов. Одним из ключевых механизмов консолидации, хранения и реконсолидации памяти у млекопитающих и моллюсков, по-видимому, является метилирование ДНК, дифференциально регулирующее экспрессию генов. Однако многие вопросы, касающиеся участия процессов метилирования в механизмах памяти и развития амнезии, остаются неясными. Ранее на виноградных улитках, обученных условной пищевой аверсии, нами показано, что однократные инъекции ингибиторов ДНК-метилтрансфераз перед реактивацией памяти (напоминание условным пищевым стимулом) не влияют на ее сохранность. Однако нельзя исключить, что процессы метилирования ДНК, вовлекаемые в механизмы памяти, могут происходить в течение более продолжительного времени, чем длительность эффектов ингибиторов ДНК-метилтрансфераз после их однократных инъекций. Так, в исследованиях на крысах выявлено нарушение памяти пассивного избегания после 3-кратных инъекций ингибитора ДНК-метилтрансфераз в течение 2 сут перед тестированием. Нами также показано, что реконсолидация памяти условной пищевой аверсии нарушалась антагонистами NMDA-рецепторов глутамата, но не ингибиторами синтеза РНК. С другой стороны, ингибиторы синтеза РНК препятствовали развитию амнезии, вызванной применением антагонистов NMDA-рецепторов перед напоминанием. Таким образом, процессы транскрипции не вовлечены в механизмы реконсолидации памяти, но необходимы для механизмов индукции амнезии. Эти результаты позволяют предположить, что одним из механизмов РНК-зависимой индукции амнезии может быть устойчивое изменение процессов транскрипции, в частности, за счет метилирования/деметилирования определенных участков ДНК. Кроме того, ранее нами обнаружено, что через 3 сут после индукции амнезии инъекции улиткам ингибиторов ДНК-метилтрансфераз, сочетанные с напоминанием, приводили к восстановлению памяти. Этот факт указывает на возможность реактивации механизмов амнезии при предъявлении напоминания и их зависимость от процессов метилирования ДНК. Таким образом, участие ДНК-метилтрансфераз в механизмах сохранении памяти, ее реконсолидации, индукции амнезии и восстановления памяти может иметь ряд особенностей, которые, однако, остаются практически неизученными. Целью данного исследования являлось изучение продолжительного действия ингибиторов ДНК-метилтрансфераз (инъекции в течение 3 сут) на процессы реконсолидации и сохранности памяти условной пищевой аверсии у виноградных улиток, а также на процессы индукции амнезии, вызванной нарушением реконсолидации памяти антагонистом NMDA-рецепторов глутамата. Кроме того, мы дополнительно исследовали процессы восстановления памяти у амнезированных улиток после применения ДНК-метилтрансфераз/напоминания. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. У виноградных улиток (Helixlucorum) вырабатывали условную пищевую аверсию по ранее описанной методике. За 3 сут до обучения и перед тестированием сохранности навыка животных лишали пищи. Улиток фиксировали к кронштейну за раковину, сохраняя относительную свободу перемещения по пластиковому шару, плавающему в воде. В качестве условного стимула (УС) использовали сырую морковь, а дифференцировочного стимула (ДС) — вареную морковь. В момент первых консуматорных реакций на пищу через тело улитки пропускали электрический ток (50 Гц, 300 мс, 1.2 мА). Сочетанные предъявления пищи и электрического тока осуществляли через каждые 15-20 мин. Улиток обучали в течение 4 сут, ежедневно предъявляя по 3 раза УС и ДС. Пищу предъявляли в течение 120 с. Улитки в среднем получали 6-7 (6.6±0.2) сочетаний условного и подкрепляющего стимула. Исследовали эффекты ингибитора ДНК-метил-трансфераз RG108 (N-phthalyl-1 -tryptophan) и антагониста NMDA-рецепторов глутамата APV (DL-2-amino-5-phosphonopentanoic acid, АР-5) ("Sigma"). APV разводили в физиологическом растворе. RG108 предварительно растворяли в ДМСО, а затем разводили в физиологическом растворе. Растворы веществ (0.25 мл/улитку) вводили в полость тела с помощью шприца через кожу средней части ноги. Доза RG108 составила 10 мг/кг массы, APV — 25 мг/кг. В этих дозах вещества эффективно влияли на процессы консолидации и реконсолидации памяти, в том числе у моллюсков. При изучении влияния на механизмы сохранности и реконсолидации памяти улиткам (n=8) трижды вводили RG108 через каждые 24 ч (через 2,3 и 4 сут после обучения). После каждой инъекции предъявляли напоминание: животных помещали в контекст обучения (на пластиковые шары) и через 1 ч предъявляли 4 УС с интервалом 15 мин. В течение 120 с регистрировали латентные периоды (ЛП) консуматорных реакций. Если животные пытались поедать пищу, ее убирали. Подкрепляющие стимулы при напоминании не применяли. Контрольным животным (n=8) в те же сроки назначали раствор ДМСО/напоминание. Для изучения участия метилирования ДНК в механизмах индукции амнезии через 2 сут после обучения улиткам (n=8) инъецировали RG108, помещали их в контекст обучения, через 1 ч вводили APV и еще через 15 мин предъявляли напоминающие УС. Двум другим группам улиток назначали APV/напоминание (n=8) или ДМСО/напоминание (n=8). Для изучения участия процессов метилирования ДНК в механизмах восстановления памяти через 3 сут после индукции амнезии, вызванной назначением APV/напоминания, улиткам (n=8) вводили RG108 и предъявляли напоминание, используя описанные выше методы. Контрольные группы улиток получали RG108 без напоминания (n=8) или ДМСО/напоминание (n=8). Ответы на пищевые стимулы тестировали за 1 ч до обучения, через 1 сут после обучения, а также через различные сроки после инъекций веществ и напоминания. При тестировании улиток помещали в обстановку обучения на 30 мин, предъявляли УС и ДС с интервалом 15 мин и в течение 120 с измеряли ЛП консуматорных реакций. Если животные пытались поедать пищу, тестирование прекращали. Электрошок при тестировании не использовали. Полученные данные усредняли, вычисляли стандартную ошибку средней (±SEM). Для сравнения ЛП реакций на УС у двух разных групп животных использовали непараметрический критерий Манна—Уитни, для сравнения ЛП реакций на УС и ДС, полученных у улиток одной и той же группы — критерий Вилкоксона. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. У необученных улиток ЛП консуматорных реакций на предъявление сырой или вареной моркови составляли в среднем 20-35 с (рис. 1, тест 1). При тестировании улиток через 1 сут после обучения (рис. 1, тест 2) ЯП консуматорных реакций на УС (сырая морковь) были больше, чем ЯП ответов на ДС (вареная морковь; р<0.01), а также исходных реакций на предъявление сырой моркови перед обучением (р<0.01). Три инъекции RG108 и напоминание через каждые 24 ч не нарушали память. Через 2, 3 и 4 сут после обучения улиткам (р=8) инъецировали RG108 и предъявляли напоминание. При тестировании через 1 и 10 сут после последнего назначения RG108/напоминания выявлено (рис. 1), что ЯП реакций на УС не отличались от ЯП контрольных животных (n=8), которые через 2,3 и 4 сут после обучения получали ДМСО/напоминание (р>0.9), и были больше ЯП ответов на ДС (р<0.01). Таким образом, 3-кратное назначение ингибитра ДНК-метилтрансфераз в сочетании с напоминанием не влияло на сохранность памяти. Совместные инъекции APV и RG108 перед напоминанием не предотвращали развитие амнезии. Через 2 сут после обучения улиткам (n=8) вводили APV и предъявляли напоминание. При тестировании животных через 1 и 10 сут после назначения APV/напоминания обнаружено (рис. 2), что ЯП реакций на УС были меньше ЯП контрольных обученных улиток (n=8; р<0.001) и не отличались от ЯП ответов на ДС (р>0.2). Другим группам улиток через 2 сут после обучения инъецировали RG108 и APV (n=8) и предъявляли напоминание. Тестирование животных через 1 и 10 сут после сочетанных инъекций препаратов перед напоминанием показало (рис. 2), что ЯП реакций на УС были меньше, чем ЯП ответов у контрольных улиток (n=8), получавших ДМСО/напоминание (р<0.001), и не отличались от ЯП ответов на ДС (р>0.8). Таким образом, ингибирование NMDA-рецепторов, сочетанное с напоминанием, вызывало нарушение реконсолидации памяти и развитие амнезии, а инъекции ингибитора ДИК-метилтрансфераз не предотвращали индукцию NMDA-зависимой амнезии. Ингибирование ДНК-метилтрансфераз, сочетанное с напоминанием, через 3 сут после индукции амнезии приводило к восстановлению памяти. На 3-й сутки после действия APV/напоминания улиткам (n=8) инъецировали RG108 и предъявляли напоминание. Тестирование через 2 и 10 сут после инъекций/напоминания показало (рис. 2), что Л П реакций на УС не отличались от ЛП контрольных обученных животных (n=8; р>0.2) и были больше ЛП ответов на ДС (р<0.001). Вместе с тем изолированные инъекции RG108 улиткам (n=8) или применение ДМСО/напоминания (n=8) через 3 сут после назначения APV/напоминания не влияли на развитие амнезии: тестирование через 2 и 10 сут после инъекций показало (рис. 3), что ЛП реакций на УС были меньше ЛП контрольных обученных животных (n=8; р<0,001) и не отличались от ЛП ответов на ДС (р>0.4). Таким образом, через 3 сут после индукции амнезии, вызванной действием APV/напоминания, введения улиткам ингибитора метилирования ДНК в сочетании с напоминанием вызывали восстановление памяти. Проведенное исследование показало, что 3 инъекции через каждые 24 ч ингибиторов ДНК-метилтрансфераз перед напоминанием УС не влияют на сохранность памяти. Полученный результат согласуется с данными наших предыдущих исследований. В частности, реконсолидация памяти условной пищевой аверсии у улиток нарушалась ингибиторами синтеза белка, но не РНК. Таким образом, процессы реконсолидации памяти условной пищевой аверсии у улитки не зависели как от синтеза мРНК, так и от метилирования ДНК. Эти результаты позволяют предположить, что белки, необходимые для процессов реконсолидации памяти, транслируются с ранее синтезированной мРНК, находящейся в неактивном, "депонированном" состоянии. Однако трудно представить, что поддержание памяти не требует обмена РНК на протяжении длительного времени, особенно учитывая, что периодическая реактивация памяти при напоминании требует трансляции "запасенной" РНК. Кроме того, в ряде исследований показана необходимость синтеза РНК или метилирования ДНК для реконсолидации памяти в том числе у моллюсков. Возможны различные интерпретации противоречий полученных нами результатов и данных литературы. Во-первых, нельзя исключить, что некоторые формы памяти могут вовлекать очень медленный метаболизм РНК, существенно более медленный, чем при других формах памяти. Длительность или выраженность подавления метилирования ДНК его ингибиторами в наших опытах могла быть все еще недостаточной для нарушений функций генома, лежащих в основе поддержания памяти. В какой-то мере это предположение согласуется с тем фактом, что такие формы памяти, как условная пищевая аверсия, чрезвычайно устойчивы к модификации. Так, показано, что процедура угашения даже при ее длительном и интенсивном применении приводит лишь к частичной потере этой памяти, с последующим быстрым спонтанным ее восстановлением. Другие виды памяти, напротив, вовлекают более мобильные РНК и гены, чем память пищевой аверсии. В исследованиях на моллюске аплизии показано, что ингибиторы ДНК-метилтрансфераз в дозах, сравнимых с использованными в наших опытах, нарушали как консолидацию, так и поддержание неассоциативной памяти. Другая возможность заключается в том, что некоторые виды памяти могут иметь особый механизм формирования и поддержания. Так, у цыплят для поддержания памяти вкусовой аверсии критически необходим синтез ДНК, поскольку введение веществ, нарушающих синтез ДНК при обучении, приводило к развитию амнезии. Интересно отметить отсутствие эффектов ингибиторов синтеза ДНК в других моделях обучения (импринтинг, пассивное избегание, обучение в лабиринте), что указывает на критическую роль ДНК-метилтрансфераз в механизмах памяти таких видов обучения, как вкусовая аверсия. Отсутствие влияния ингибиторов ДНК-метилтрансфераз на сохранность и реконсолидацию памяти не исключало возможности вовлечения процессов метилирования ДНК и функций генома в механизмы индукции амнезии, вызываемой нарушением реконсолидации памяти. Как отмечено выше, ингибиторы транскрипции не влияли на реконсолидацию памяти, но подавляли развитие амнезии, вызываемое назначением антагониста NMDA-рецепторов глутамата/напоминанием. Однако в данной работе нами не обнаружено влияния ингибиторов ДНК-метилтрансфераз на индукцию амнезии, вызываемую применением APV/напоминания. Вместе с тем ДНК-метилтрансферазы вовлечены в другие механизмы развития амнезии. Нами показано, что назначение ингибиторов ДНК-метилтрансфераз/напоминания через 3 сут после индукции NMDA-зависимой амнезии приводило к восстановлению памяти. Мы предположили, что напоминание, предъявляемое во время развития амнезии, не теряет своего сигнального значения и играет сходную роль с напоминанием при реактивации памяти. В частности, оно вызывает реактивацию процессов амнезии, в том числе метилирования/деметилирования ДНК, в результате которой механизмы амнезии становятся лабильными, доступными для различных воздействий. Применение ингибиторов ДНК-метилтрансфераз в это время приводило к нарушению процессов развития амнезии и восстановлению памяти. Таким образом, ингибиторы ДНК-метилтрансфераз в одних и тех же дозах не влияют на хранение и реконсолидацию памяти, а также на механизмы индукции амнезии. Вместе с тем они вызывают восстановление памяти, по-видимому, вследствие нарушения процессов реактивации и развития амнезии. Учитывая данные литературы и полученные нами результаты, можно предположить, что процессы метилирования ДНК дифференциально вовлечены в механизмы памяти при разных формах обучения, а также в механизмы индукции и развития амнезии.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.4-9. Библ. 15 назв.
Просмотров: 33