СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ TLR2 НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМИ МАКРОФАГАМИ МЫШЕЙ

Аннотация:

Методом люминолзависимой хемилюминесценции исследовали ТLR2-опосредованную продукцию АФК перитонеальными макрофагами мышей при стимуляции клеток зимозаном (лигандом TLR2/6) и пептидогликаном (лигандом TLR2/1). Установлено, что при совместном действии зимозана и пептидогликана на макрофаги продукция АФК зависит от соотношения концентраций лигандов. Выявлены три эффекта: аддитивность стимулирующего действия используемых лигандов, конкурентное связывание лигандов и эффект прайминга макрофагов пептидогликаном при стимуляции клеток зимозаном. Обсуждаются механизмы, лежащие в основе этих эффектов. Ключевые слова: макрофаги, Тоll-подобный рецептор 2, лиганды TLR2, активные формы кислорода, хемилюминесценция То11-подобные рецепторы (Toll-like receptors—TLRs) относятся к ключевым рецепторам врожденного иммунитета. Основная функция TLRs заключается в распознавании высококонсервативных структур патогенных микроорганизмов, так называемых патогенассоциированных молекулярных паттернов. У млекопитающих выявлены 13 типов TLRs, при этом TLR1-9 обнаружены как у людей, так и у мышей, TLR11-13 имеются только у мышей, a TLR10 — только у человека. Среди представителей семейства TLRs особое место занимает TLR2. Этот рецептор экспрессируется на клетках миелоидного ряда и вовлечен в распознавание разнообразных структурных компонентов бактерий, паразитов, грибов, вирусов. К числу лигандов TLR2 относятся липопептиды различных патогенов, пептидогликан (ПГ) и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, липоарабиноманнан микобактерий, зимозан грибов, поверхностные гликопротеины вирусов и пр. TLR2 распознают эти лиганды посредством образования гетеродимерных комплексов с TLR1 (TLR2/1) или с TLR6 (TLR2/6). Кроме того, корецепторами TLR2 могут выступать дектин-1 и CD14. Каждая гетеродимерная пара различает свой набор лигандов. Так, TLR2/1 распознают триацилированные липопептиды и ПГ грамположительных бактерий, TLR2/6 — диацилированные липопептиды, липотейхоевые кислоты и зимозан. При взаимодействии TLRs фагоцитов с лигандами происходит активация внутриклеточных сигнальных путей, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов, интерферонов I типа, противомикробных пептидов, АФК. Последние обладают цитотоксическим действием и являются важной преградой на пути развития инфекции и новообразований. TLR2-опосредованная продукция АФК фагоцитами изучалась в ряде работ. При этом клетки активировали только одним стимулом—зимозаном, ПГ или липотейхоевой кислотой. Однако в организме фагоциты могут взаимодействовать одновременно с несколькими лигандами, что, безусловно, должно найти отражение в продукции АФК активированными клетками. Эффекты действия на фагоциты двух и более лигандов ранее не рассматривались. Цель данной работы является изучение совместного действия лигандов TLR2 (зимозана и ПГ) на продукцию АФК перитонеальными макрофагами мышей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовали раствор Хенкса без фенолового красного ("БиолоТ"), гепарин (Московский эндокринный завод), люминол ("Fluka"), ДМСО, неорганические соли ("Sigma-Aldrich"). Исследования проводили на мышах-самцах линии BALB/c (n=50) в возрасте 2-3 мес. Для получения макрофагов использовали методику выделения резидентных перитонеальных макрофагов. Мышей выводили из эксперимента цервикальной дислокацией. В брюшную полость вводили 5-6 мл охлажденной среды RPMI-1640 ("Sigma-Aldrich"), содержащей гепарин (10 ЕД/мл). После инъекции брюшную полость массировали в течение 60 с. Перитонеальную жидкость отбирали шприцем и собирали в охлажденные культуральные полистироловые пробирки ("Coming"). Клетки осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 200g и 4°С на центрифуге "Eppendorf 5702R", затем отмывали средой RPMI-1640. Выделенные клетки ресуспензировали в 1 мл раствора Хенкса рН 7.4 и держали при 4°С не более 4 ч. Жизнеспособность макрофагов составляла не менее 96%. Через 4 ч количество живых макрофагов составляло 92-94%. В качестве лигандов TLR2 были выбраны зимозан (Saccharomyces cerevisiae, "InvivoGen") и ПГ (Staphylococcus aureus, "InvivoGen"), которые являются лигандами TLR2/6 и TLR2/1 соответственно. Для оценки продукции АФК перитонеальными макрофагами мышей при их стимуляции лигандами TLR2 был использован метод люминолзависимой хемилюминесценции (XЛ). Известно, что люминолзависимая ХЛ активированных фагоцитов обусловлена продукцией ими различных АФК — Н202, гидроксильного радикала, хлорноватистой кислоты, частично представленной в форме гипохлорит-аниона, а также супероксидного анион-радикала (О2), который является предшественником других перечисленных выше АФК. Перитонеальные клетки представлены макрофагами (30-40%), лимфоцитами (60-70%), гранулоцитами (0-1%). В экспериментах мы исходили из того, что измеряемая ХЛ отражает продукцию АФК макрофагами, в то время как вклад лимфоцитов в общую продукцию АФК перитонеальными клетками является незначительным. Для регистрации ХЛ макрофагов в исследуемые пробы вносили такое количество перитонеальных клеток, чтобы содержание макрофагов было одинаковым. Исследуемые пробы общим объемом 1 мл содержали 2x10 в 5 степени макрофагов, 100 мкМ люминол в растворе Хенкса рН 7.4. Раствор люминола (20 мМ) готовили на ДМСО и хранили в замороженном состоянии при -30°С до проведения эксперимента. ХЛ макрофагов регистрировали при 37°С в полистироловой кювете при постоянном перемешивании. В течение 2-3 мин измеряли уровень спонтанного свечения клеток. Затем к суспензии клеток добавляли стимулирующие агенты (зимозан, ПГ или смесь этих лигандов) и регистрировали интенсивность ХЛ в течение 45 мин. Для определения интенсивности стимулированной ХЛ рассчитывали разность между максимальной интенсивностью свечения, регистрируемой в наблюдаемый период времени, и интенсивностью спонтанного свечения. Измерения выполняли на хемилюминометре "Lum-5773" ("ДиСофт") с программным обеспечением "PowerGraph 3.3 Professional". При изучении праймирующего влияния ПГ на кислородный метаболизм макрофагов клетки (2x10 в 5степени на 1 мл) инкубировали в присутствии ПГ (0.5 мкг/мл) в течение 1 ч в среде RPMI-1640, содержавшей 100 мкг/мл гентамицина сульфата ("Дальхимфарм") и 2 мМ глутамин ("Sigma-Aldrich"), в СО2-инкубаторе "Galaxy CО-170R" ("New Brunswick Scientific") при 37°C в атмосфере 5% СО2. Контролем служили макрофаги, инкубируемые без ПГ. После инкубации клетки отмывали средой RPMI-1640, ресуспензировали их в растворе Хенкса рН 7.4 и держали при 4°С, как описано выше. Статистическую обработку количественных данных проводили в программе "Microsoft Excel 2010". Результаты представлены в виде средних значений и стандартных ошибок средних по данным не менее 3 независимых экспериментов. Оценку достоверности различий между сравниваемыми показателями проводили с помощью t критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0.05, РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Зависимости интенсивности ХЛ перитонеальных макрофагов от концентрации добавляемых к ним зимозана или ПГ представляли собой кривые насыщения (рис. 1, а, 6). С повышением концентрации лигандов происходило постепенное увеличение интенсивности свечения, которая достигала постоянного уровня при концентрации зимозана 100 мкг/мл, ПГ—50 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации лигандов (зимозана — до 200 мкг/мл, ПГ — до 100 мкг/мл) к существенным изменениям ХЛ не приводило, что, по-видимому, обусловлено отсутствием на клетках свободных рецепторов в условиях избытка лиганда. При этом значения интенсивности ХЛ макрофагов на участках кривых, соответствующих максимальной стимуляции клеток, для зимозана и ПГ практически не различались. Таким образом, каждый из лигандов TLR2, зимозан и ПГ, стимулирует продукцию АФК фагоцитами, что согласуется с данными других исследователей. Исследовалось совместное влияние зимозана и ПГ на продукцию АФК перитонеальными макрофагами мышей. На первом этапе были выбраны концентрации лигандов, существенно меньше насыщающих (тех, при которых наблюдали максимальное свечение). В таких условиях совместное добавление лигандов к клеткам должно привести к увеличению интенсивности ХЛ по сравнению с действием лигандов при раздельном введении. В наших экспериментах использовались концентрации зимозана (10 мкг/мл) и ПГ (2.5 мкг/мл), которые были меньше насыщающих концентраций в 10 и 20 раз соответственно (рис. 1, а, б). В этом случае оба лиганда занимают доступные места связывания, а часть экспрессированных TLR2 остается свободной. При совместном действии этих лигандов интенсивность ХЛ макрофагов была достоверно выше, чем интенсивность свечения клеток, стимулированных каждым лигандом в отдельности, и не отличалась от их суммы (рис. 2, а, б). По нашему мнению, наблюдаемый эффект аддитивности при одновременном действии на клетки зимозана и ПГ обусловлен отсутствием конкуренции лигандов за общие места связывания — TLR2. В следующей серии экспериментов для одновременной стимуляции макрофагов зимозаном и ПГ было взято другое соотношение их концентраций. Концентрация зимозана (200 мкг/мл) соответствовала участку насыщения на концентрационной кривой (рис. 1, а), а концентрация ПГ (2.5 мкг/мл) — начальному участку (рис. 1, б). Установлено, что регистрируемая в этом случае интенсивность ХЛ макрофагов достоверно не отличалась от значения, полученного при стимуляции клеток только зимозаном, но была выше интенсивности свечения клеток при их стимуляции только ПГ (рис. 2, в, г). Полученный результат можно объяснить с позиции конкуренции между исследуемыми лигандами за общие TLR2. Если предположить, что зимозан и ПГ обладают близким сродством к TLR2, или у зимозана оно выше, чем у ПГ, то в условиях избытка зимозана последний связывается со всеми доступными ему рецепторами, что препятствует взаимодействию с ними ПГ. Тогда конечный результат их совместного действия на макрофаги не должен отличаться от действия одного зимозана. Если сродство к TLR2 у ПГ выше, чем у зимозана, ПГ первым связывается с этими рецепторами, а оставшиеся центры связывания занимает зимозан. В этом случае регистрируемая ХЛ будет определяться суммарным вкладом обоих лигандов. Известно, что одним из важных этапов активации фагоцитов является праймирование, или предстимуляция. Эффект предстимуляции заключается в том, что предварительная обработка фагоцитов небольшим количеством какого-либо стимула, который не вызывает немедленного проявления активации клетки, приводит к усилению ответа (в том числе респираторного взрыва) на последующую стимуляцию другим агентом или тем же стимулом в большей концентрации. Нами было изучено праймирующее действие ПГ на перитонеальные макрофаги, при этом в качестве стимулирующего агента выступал зимозан. Инкубация макрофагов в течение 1 ч с ПГ (0.5 мкг/мл) не приводила к их активации: интенсивность ХЛ клеток не отличалась от интенсивности свечения контрольных макрофагов, инкубируемых без ПГ (рис. 3, а). Если фагоциты инкубировали в течение 1 ч без ПГ, а затем добавляли зимозан (10 мкг/мл), то наблюдалась их активация, которая сопровождалась развитием ХЛ. При этом интенсивность регистрируемой ХП совпадала с таковой свежевыделенных клеток, стимулированных зимозаном в той же концентрации. Это свидетельствует о том, что процедура инкубации не повлияла на способность макрофагов продуцировать АФК в ответ на стимул. Вместе с тем добавление зимозана к клеткам, предварительно подвергнутым воздействию ПГ, сопровождалось увеличением интенсивности ХЛ в 1.9 раза по сравнению с аналогичным показателем клеток, инкубируемых без ПГ (рис. 3, а, б). Последний результат можно объяснить эффектом предстимуляции клеток под влиянием ПГ. Взаимодействие фагоцитов с зимозаном или ПГ, сопровождающееся продукцией АФК, было изучено в ряде работ. Было показано, что при стимуляции нейтрофилов человека зимозаном происходит генерация АФК, которую регистрировали методом люминолзависимой ХП. При использовании этого стимула ключевыми событиями для активации NADPH-оксидазы являются фосфорилирование ее цитозольного компонента p47phox и активация компонента Rac2. Особенности кислородного взрыва у фагоцитов человека под влиянием ПГ (нативного или модифицированного с помощью обработки ультразвуком и некоторыми ферментами) изучены с использованием методов люминол- и люцигенин-зависимой ХЛ. Предобработка нейтрофилов человека гранулоцитарно-макрофагапьным КСФ приводила к увеличению генерации О2- при стимуляции клеток зимозаном или ПГ. Однако совместное действие зимозана и ПГ на выработку АФК фагоцитами не исследовалось. Поскольку зимозан и ПГ являются агонистами TLR2, то при совместном действии этих лигандов конечный эффект будет зависеть, в частности, от количества доступных TLR2. С этих позиций наблюдаемые нами эффекты аддитивности и конкуренции можно объяснить следующим образом. Если зимозан и ПГ добавляли к клеткам в малых концентрациях, т.е. оставляли часть TLR2 свободными, то стимулирующие эффекты лигандов складывались (рис. 2, а, б). Когда концентрация одного из лигандов (зимозана) соответствовала насыщающей, а концентрация второго лиганда (ПГ) была той же, что и в первом случае, мы наблюдали действие только зимозана, который, по-видимому, имел преимущества перед ПГ в конкуренции за TLR2 (рис. 2, в, г). Известно, что лиганды TLR2 способны оказывать праймирующее действие на фагоциты. Так, обнаружено, что предварительная обработка нейтрофилов человека липотейхоевой кислотой, компонентом клеточной мембраны грамположительных бактерий, приводила к усилению продукции АФК при последующей стимуляции клеток N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином. В работе оценивали продукцию О2-нейтрофилами человека, стимулированными этим же пептидом, по восстановлению цитохрома С. Показано, что клетки, предстимулированные агонистами TLR2 — зимозаном и синтетическим триацилированным липопептидом Pam3CSK4—продуцировали большее количество О2- по сравнению с клетками, не обработанными агонистами TLR2. Поскольку триацилированные липопептиды и ПГ распознаются одними и теми же рецепторами — TLR2/1, можно предположить, что ПГ также способен проявлять праймирующие свойства в отношении продукции АФК, однако конкретных данных об этом в литературе не обнаружено. Нами установлено, что предобработка ПГ перитонеапьных макрофагов мышей вызывает усиление ХЛ при последующей стимуляции клеток зимозаном (рис. 3, а, б). По последним представлениям в основе эффекта прайминга фагоцитов, приводящего к увеличению продукции АФК, лежит экспрессия рецепторного аппарата, а также фосфорилирование отдельных субъединиц NADPH-оксидазы и/или транслокация субъединиц фермента (включая gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox, p40phox, Rac2) из цитозоля к плазматической мембране или мембране специфических гранул. При этом полной сборки фермента, которая требуется для продукции О2- и характерна для стадии активации клетки, не происходит. Таким образом, продукция АФК перитонеальными макрофагами мышей при совместном воздействии на них лигандов TLR2 зимозана и ПГ зависит от соотношения концентраций лигандов. При этом выявлены три эффекта: аддитивность стимулирующего действия используемых лигандов, конкурентное связывание лигандов и эффект предстимуляции макрофагов ПГ, Аналогичные эффекты могут иметь место в организме, где фагоциты подвергаются одновременному влиянию различных лигандов TLRs.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.30-35. Библ. 15 назв.
Просмотров: 112