НЕИНВАЗИВНАЯ ОЦЕНКА РАЗВИТИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ЭПИТЕЛИЯ КИШЕЧНИКА

Аннотация:

Дифференцировка клеток линии колоректального рака Сасо-2 оценивалась с помощью микрочипов "Affymetrix Human Gene 1.0 ST", а также по основным электрическим параметрам, измеренным методом биоимпедансной спектроскопии. Трансэпителиальное сопротивление (TEER) было максимальным на 7-е сутки, затем снижалось к 11-м суткам и сохранялось стабильным. Фоновое сопротивление было максимальным на 4-е сутки, минимальным — к 7-м суткам, однако затем постепенно повышалось в течение 2 нед, что может объясняться образованием компонентов базальной мембраны или апикального слизистого слоя. Клетки Сасо-2 экспрессируют компоненты ламинина-111 и ламинина-511. Обнаружено синхронное повышение экспрессии мРНК муцина 3 (MUC3A/MUC3B) и муцина 17 (MUC17) и снижение экспрессии микроРНК miR-21 и miR-622. Обсуждается возможное использование описанного подхода для изучения формирования внеклеточного матрикса. Ключевые слова: импедансная спектроскопия, барьерные ткани, TEER, Сасо-2, внеклеточный матрикс. Оценка биодоступности потенциальных лекарственных веществ для перорального приема на доклинической стадии является важным этапом отбора и изучения препаратов-кандидатов. Для изучения барьерной функции кишечника человека могут использоваться клеточные модели, среди которых наиболее популярна клеточная линия колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2, которая способна дифференцироваться в условиях длительного культивирования с образованием полноценного эпителиального барьера. Эпителиальные клетки кишечника располагаются на поверхности базальной мембраны — специализированной структуры, состоящей из компонентов внеклеточного матрикса, отделяющей клетки от подлежащих тканей и способной определять форму, адгезию, пролиферацию, миграцию, апоптоз и экспрессию генов в эпителиальных клетках. Базальная мембрана кишечника включает в качестве основных компонентов белки ламинины, контактирующие непосредственно с клетками, например ламинин-1 (а1бета1y1) и ламинин-5 (а3бета3y2), экспрессируемые в основании клеток ворсинок кишечника, и ламинин-2 (a2бета1y1), чаще всего обнаруживаемый в криптах кишечника. Среди других компонентов базальной мембраны можно выделить подлежащий под ламининами слой коллагенов (преимущественно коллаген IV), фибронектин и такие компоненты, как кальцийсвязывающие белки фибулины и фибулинподобные белки. Основным источником синтеза данных компонентов служат мезенхимные клетки, однако сами эпителиальные клетки также могут участвовать в данном процессе. В процессе дифференцировки эпителиальные клетки способны образовывать плотные контакты, которые разделяют мембрану клеток на апикальную и базолатеральную часть и препятствуют пассивной диффузии через монослой клеток. Это создает условия для возможности оценки целостности монослоя эпителиальных клеток по трансэпителиальному электрическому сопротивлению (Transepithelial Electric Resistance, TEER). Для оценки TEER непосредственно монослоя клеток из результатов измерения выметается фоновое сопротивление культуральной среды и мембраны, на которой выращивается монослой. Модель кишечного барьера на основе клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2, как правило, не включает в себя внеклеточный матрикс, клетки располагаются непосредственно на мембране из культурального пластика. Однако известно, что клетки колоректальной аденокарциномы Сасо-2 способны самостоятельно экспрессировать некоторые компоненты, необходимые для синтеза базальной мембраны. При этом рост клеток Сасо-2 на искусственно подготовленном внеклеточном матриксе изменяет TEER и барьерные свойства клеток. Вместе с тем остается неизвестным, можно ли обнаружить образование компонентов базальной мембраны культурой клеток Сасо-2 с помощью измерения основных электрических параметров монослоя. Косвенная оценка данного процесса возможна при оценке транскриптома клеток в процессе дифференцировки. Целью данной работы являлось изучение с помощью импедансной спектроскопии основных электрических параметров (TEER, электрическая емкость, фоновое сопротивление), а также молекулярно-генетических свойств монослоя колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 в процессе роста и дифференцировки на проницаемых культуральных вставках Transwell. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование клеток Сасо-2 проводили в полной питательной среде: MEM ("Gibco"), 20% ЭТС ("Gibco"), 2 мМ L-глутамин ("ПанЭко"), 1 мМ пирувата натрия ("Gibco"), 1% раствор заменимых аминокислот ("Gibco"), раствор антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; "Gibco"). Культивирование проводилось на проницаемых мембранных вставках Transwell ("Corning") с диаметром пор 1 мкм в клеточном инкубаторе при 5% СО2 и 37°С, как описано ранее. Клетки высевали на мембрану в 50 мкл среды в концентрации 112 000 клеток/мл, в нижнюю камеру под вставкой добавляли 235 мкл полной питательной среды. После этого клетки культивировали до образования конфлюэнтного монослоя и затем в течение 3 нед для достижения состояния дифференцированного монослоя; питательную среду меняли каждые 2-3 сут. В процессе культивирования клеток при комнатной температуре периодически измеряли импедансные спектры с использованием электрода STX100С96 ("World Precision Instruments") и измерителя импеданса LCR-76100 ("GW Instek") в диапазоне частот от 100 до 1000 Гц с шагом 10 Гц. Измерение проводилось в 12 независимых вставках Transwell с усреднением значений основных электрических параметров (TEER, электрическая емкость С, фоновое сопротивление RJ. Основное внимание уделяли изучению TEER и RM, расчет данных значений проводили с использованием упрощенной эквивалентной схемы и нелинейной аппроксимации соответствующего годографа импеданса (рис. 1). Также измерение импедансных спектров проводили для вставок Transwell, покрытых ламининами. Для покрытия использовали ламинин-111 и ламинин-511 ("BioLamina"), в мембранную вставку Transwell добавлялось 25 мкл раствора ламинина с концентрацией 10 мкг/мл, после чего проводили инкубацию при 4°С в течение ночи. После инкубации раствор ламининов удаляли, вставку промывали раствором ФСБ и заполняли 50 мкл полной питательной среды, а в нижнюю камеру добавляли 235 мкл среды, после чего осуществляли измерение импедансных спектров. Зависимость основных электрических параметров от времени проверяли с помощью линейного регрессионного анализа (функция lm() базового пакета языка программирования R), отличие коэффициентов линейной модели от нуля оценивали с помощью t критерия Стьюдента с пороговым уровнем значимости 0.05. Значимость различий отдельных измерений оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Тьюки. Результаты измерения представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего. Для анализа транскриптома недифференцированные клетки Сасо-2 и клетки, прошедшие дифференцировку в течение 3 нед, лизировали с помощью 500 мкл "Qiazol Lysis Reagent" ("Qiagen") в 3 независимых биологических экспериментах, после чего выделяли тотальную РНК с помощью набора "miRNeasy Mini Kit" ("Qiagen"). Концентрацию и качество РНК оценивали с помощью спектрофотометра "NanoDrop 10ОО" ("Thermo Fisher Scientific") и системы для электрофореза "Experion" ("Bio-Rad"), как описано ранее. Для анализа транскриптома клеток использовали по 500 нг каждого образца РНК, который готовили по описанному ранее протоколу для чипов "GeneChip Human Genome 1.0 ST' ("Affymetrix"). Математическую обработку полученных CEL-файлов с данными экспрессии проводили в программе "Transcriptome Analysis Console 4.0.0.25" ("Thermo Fisher Scientific") с использованием однофакторного дисперсионного анализа по методу eBayes, достоверность изменения экспрессии генов оценивали с поправкой Бенджамини—Хохберга. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Значение TEER увеличивалось вплоть до 7-х суток, затем несколько снижалось к 11-м суткам и значимо не менялось до конца эксперимента (р-0.98). Зависимости основных электрических параметров монослоя клеток Сасо-2 от времени культивирования, начиная с 11-х суток, представлены на рисунке 2. Вероятно, полученные данные объясняются формированием плотных контактов между клетками монослоя к 7-м суткам и стабилизацией их структуры к 11-м суткам. Значение RM снижалось на 7-е сутки по сравнению с 4-ми сутками (р<0.001) и затем медленно повышалось менее чем на 3 Ом в сутки (р=0.03). Таким образом, значения RM могут зависеть от времени. Следует отметить, что среднее значение RM после 7 сут культивирования клеток (325±7 Ом) существенно выше, чем значение RM в мембранных вставках без клеток (190±3 Ом). Следовательно, можно сделать вывод, что присутствие клеток повышает RM более чем на 100 Ом, и использование мембранных вставок без клеток для определения фонового значения сопротивления является некорректным. Исходя из упрощенной эквивалентной электрической схемы (рис. 1, a), TEER и RM соединены последовательно, поэтому можно предположить, что повышение фонового сопротивления в присутствии клеток обусловлено формированием базальной мембраны на пористой культуральной подложке или формированием апикального слизистого слоя из муцинов и других компонентов. Проанализировав транскриптомные профили недифференцированных и дифференцированных клеток Сасо-2, мы не обнаружили достоверных различий в экспрессии генов ламининов, коллагена IV, фибронектина, фибулинов и фибулиноподобных белков. Однако среди генов ламининов стабильно высоким уровнем сигнала на чипах обладали гены LAMA1, LAMA5, LAMB1 и LAMC1. Такая картина позволила предположить, что клетки Сасо-2 могут на стабильном уровне экспрессировать ламинин-1 (ламинин-111) и ламинин-10 (ламинин-511). Данные ламинины играют важную роль в адгезии и дифференцировке кишечного эпителия и клеток линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2. Было проведено измерение сопротивления для вставок Transwell без внеклеточного матрикса и с нанесенным на поверхность пластика ламинином-111 и ламинином-511. Сопротивление вставок Transwell, покрытых ламининами, достоверно не отличалось от сопротивления вставки без внеклеточного матрикса (р=0.342). Таким образом, использование мембранных вставок без клеток, как без внеклеточного матрикса, так и искусственно покрытых ламининами, для определения фонового значения сопротивления является некорректным, что еще раз подчеркивает преимущество метода измерения импедансных спектров, позволяющего оценить вклад фонового сопротивления RM. Также было определено, что использованные вставки Transwell с диаметром пор 1 мкм имеют собственное сопротивление около 140 Ом. Поскольку еще одним источником увеличения фонового сопротивления RM может являться апикальная поверхность клеток Сасо-2, мы проанализировали уровень экспрессии различных муцинов, являющихся основными трансмембранными и секреторными компонентами барьерного слоя на поверхности энтероцитов. В дифференцированных клетках Сасо-2 было обнаружено повышение в 1.5 раза экспрессии генов MUC3A/MUC3B (р=0.005) и MUC17 (р=0.04) относительно недифференцированных. В целом на стабильно высоком уровне в клетках Сасо-2 экспрессировались также гены MUC12 и MUC13, хотя их экспрессия в дифференцированных и недифференцированных клетках Сасо-2 не различалась. Все упомянутые муцины являются трансмембранными белками и основными компонентами гликокаликса кишечных клеток, за счет которых на апикальной поверхности может формироваться слой из секреторных муцинов и других компонентов. Регуляция экспрессии генов в клетках может осуществляться с помощью микроРНК. Для проверки гипотезы о том, что повышенный уровень экспрессии генов муцинов в дифференцированных клетках Сасо-2 может быть связан со снижением экспрессии регулирующих их микроРНК, был проведен дополнительный анализ транскриптомных данных. При дифференцировке в клетках Сасо-2 снижалась экспрессия генов MIR21 (в 3.5 раза, р=0.009) и MIR622 (в 2 раза, р=0.005). В данных генах закодированы пре-микроРНК для зрелых микроРНК hsa-miR-21-5р, hsa-miR-21 -Зр и hsa-miR-622. Анализ вероятных мишеней данных микроРНК с помощью открытой базы данных miRWalk 2.0 позволил показать, что hsa-miR-622, hsa-miR-21-5р и hsa-miR-21-3р могут регулировать экспрессию генов MUC3A/MUC3B и MUC17. Установленная связь может объяснять один из возможных механизмов нарастания экспрессии муцинов в дифференцированных клетках Сасо-2. Таким образом, показана возможность использования импедансной спектроскопии для неинвазивной оценки формирования внеклеточного матрикса по нарастанию фонового сопротивления в процессе дифференцировки клеток Сасо-2, которое может объясняться формированием компонентов базальной мембраны или апикального слизистого слоя. Клетки Сасо-2 экспрессируют компоненты ламинина 111 и 511, муцины 3,12,13 и 17. Повышение экспрессии муцина 3 и 17 при дифференцировке может быть связано со снижением экспрессии генов микроРНК miR-21 и miR-622.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.41-45. Библ. 15 назв.
Просмотров: 97