МАГНИЕВАЯ СОЛЬ АМИНОЭТАНСУЛЬФОНОВОИ КИСЛОТЫ ПОДАВЛЯЕТ ВХОД Са2+ ЧЕРЕЗ КАНАЛ NMDA-РЕЦЕПТОРА in vitro

Аннотация:

В опытах на нейроглиальной культуре клеток гиппокампа крыс Sprague-Dawley методом флюоресцентного имиджинга оценивали влияние бис-ацетаминоэтансульфоноата магния (лабораторный шифр ФС-ЛХТ-317), обладающего церебропротективным действием, на внутриклеточную концентрацию кальция. Вещество оказывает выраженный ингибиторный эффект, направленный на подавление активности NMDA-рецепторов в концентрациях выше 50 мкМ. Установленные эффекты являются обратимыми или частично обратимыми и регистрируются по уменьшению амплитуды Са2+-сигналов в нейронах при аппликации NMDА в безмагниевой среде, а также по ингибированию Са2+-импульсов в ответ на исключение магния (снятие магниевого блока) из среды. Ключевые слова: бисацетаминоэтансульфоноат магния, нейрон, NMDA-рецептор, культура клеток, кальций NMDA-рецепторы являются перспективной биологической мишенью для создания эффективных лекарственных препаратов для профилактики и лечения таких важнейших и социально значимых заболеваний, как ишемические нарушения мозгового кровообращения, травматическое поражение головного мозга, нейродегенеративные заболевания, а также ряда психических расстройств. Воздействие на рецепторы, направленное на снижение эксайтотоксических эффектов глутаминовой кислоты на постсинаптические нейроны, особенно находящиеся в условиях глубокой ишемии вследствие нарушения мозгового кровообращения, — ключевой механизм фармакологического действия лекарственных средств при терапии ишемического инсульта. При этом основным вектором такого воздействия является ионный канал рецептора. В ранее проведенных экспериментальных исследованиях была установлена активность некоторых соединений аминоэтансульфоновой кислоты при ишемическом поражении головного мозга, однако механизм формирования данного эффекта не изучался. Цель данной работы — исследование влияния бис-ацетаминоэтансульфоноата магния на проводимость кальциевых ионных каналов NMDA-рецепторов как одного из возможных механизмов фармакологического действия. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Смешанную нейроглиальную культуру клеток гиппокампа получали от новорожденных (Р1-3) линейных крыс Sprague-Dawley по ранее описанной методике. Эксперименты проводили на 10-дневных культурах in vitro. Концентрацию ионов кальция в цитоплазме ([Са2+];) оценивали с помощью двух-волнового зонда Fura-2. Для окрашивания клеток гиппокампа использовали эфир Fura-2 AM ("Thermo Fisher") в конечной концентрации 4 мкМ в растворе Хенкса рН 7.4, содержавшем 156 мМ NaCI, 3 мМ KCI, 1 мМ MgS04,1.25 мМ КН2Р04,2 мМ CaCI2,10 мМ глюкозу и 10 HEPES ("Fisher BioReagents"). На каждое стекло с культурой клеток добавляли 200 мкл свежеприготовленного раствора красителя и инкубировали в термостате в течение 40 мин при 37°С. После этого культуру промывали раствором Хенкса и инкубировали 10-15 мин для завершения деэтерификации красителя. Для регистрации уровня кальция в цитоплазме клеток использовали систему анализа изображений "Cell Observer" ("Carl Zeiss") на базе инвертированного микроскопа "Axiovert 200М", оснащенного монохромной CCD-камерой "AxioCam HSm" и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров "Ludl МАС5000". Использовали объектив Plan-Neofluar 10х/0.3. В качестве источника возбуждения флюоресценции использовали осветитель с ртутной лампой НВО 103W/2. Для возбуждения и регистрации флюоресценции Fura-2 использовали набор светофильтров Filter set 21 НЕ ("Carl Zeiss") с фильтрами возбуждения ВР340/30 и ВР387/15, светоделителем FT409 и фильтром эмиссии ВР510/90. Для измерения флюоресценции круглое покровное стекло с культурой клеток монтировали в специальную измерительную камеру. Объем среды в камере составлял 0.5 мл. Добавление исследуемых соединений и их отмывку проводили путем замены среды в 10-кратном объеме с помощью системы, обеспечивающей перфузию со скоростью 15 мл/мин. Измерения проводили при 28°С. Серии изображений получали с интервалом 1 кадр в 3 с. Полученные временные серии двухканальных изображений (при длинах волн возбуждающего света 340 и 380 нм) обрабатывали в программе "imageJ" с программным модулем Time series analyzer. Измеряли амплитуду кальциевых ответов одиночных клеток, выраженную как отношение сигналов флюоресценции Fura-2 при возбуждении 340 и 380 нм. Бис-ацетаминоэтансульфоноат магния (в виде субстанции с лабораторным шифром ФС-ЛХТ-317) был синтезирован в АО "ВНЦ БАВ". Для идентификации нейронов производили кратковременную (30 с) деполяризацию с помощью аппликации 35 мМ KCI. После возвращения цитозольного Са2+ к уровню покоя проводилась замена среды (HBSS+20 мМ HEPES) в ячейке на безмагниевую и аппликация 10 мкМ NMDA ("Sigma-Aldrich") в течение 30 с с последующей отмывкой полной средой. После этого следовал 10-минутный перерыв для восстановления кальциевого гомеостаза нейронов до уровня покоя. В рамках исследования было проведено 4 серии экспериментов. В I серии сравнивали эффективность ФС-ЛХТ-317 в концентрации 10 мкМ с коммерческим антагонистом NMDA-рецепторов с известной активностью D-AP5 (10 мкМ). Во II серии определяли эффективную подавляющую концентрацию ФС-ЛХТ-317. В III серии исследовали влияние времени инкубирования культуры клеток с ФС-ЛХТ-317 на амплитуду Са2+-ответов нейронов на NMDA. В IV серии изучали NMDA-рецепторопосредованный клеточный ответ на максимальные пороговые концентрации ФС-ЛХТ-317. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Первая (контрольная) аппликация 10 мкМ NMDA вызывала увеличение концентрации ионов кальция в цитозоле нейронов в безмагниевой среде с амплитудой 0.36. Добавление 10 мкМ D-AP5 на фоне второй аппликации 10 мкМ NMDA после 5 мин инкубации приводила к подавлению внутриклеточного потока кальция в среднем на 76%. При этом аппликация NMDA после отмывки от D-AP5 полностью повторяла амплитуду Са2+-сигнала на первую (контрольную) добавку агониста (амплитуда ответа 94% от исходной), что свидетельствует об обратимости действия антагониста (рисунок, а). Инкубация клеток с 10 мкМ ФС-ЛХТ-317 в течение 5 мин практически не влияла на аплитуду Са2+-сигналов нейронов при аппликации NMDA (рисунок, а). Таким образом, исследуемое соединение не является равно-эффективным (при одинаковых концентрациях) антагонистом NMDA-рецепторов по сравнению с коммерческим веществом D-AP5. Во II серии экспериментов инкубирование нейронов с 50 мкМ ФС-ЛХТ-317 в течение 5 мин приводило к подавлению амплитуды Са2+-сигналов на NMDA на 17%, увеличение концентрации субстанции вещества до 100 мкМ сопровождалось еще большим подавлением амплитуды Са2+-ответов— до 65%. Отмывка ФС-ЛХТ-317 приводила к таким же по величине, как и в контроле, Са2+-ответам нейронов на аппликацию NMDA, что свидетельствует об обратимости действия данного ингибитора (рисунок, б). Интересным являлось подавление импульсов нейронов в ответ на снятие магниевого блока при замене среды при применении ФС-ЛХТ-317, что уже говорит об эффективности соединения. Для ряда соединений, обладающих ингибиторными свойствами на каналообразующие белки, критической является зависимость от времени воздействия вещества, когда увеличение времени инкубации может повышать эффективность ингибирования. ФС-ЛХТ-317 в концентрации 50 мкМ в течение 5 мин практически не обладает ингибиторным действием на NMDA-опосредованное увеличение Са2+-сигналов. При этом увеличение времени инкубации в 2 раза (до 10 мин) также не приводило к уменьшению амплитуды Са2+-сигналов (рисунок, в). Таким образом, время инкубации с ФС-ЛХТ-317 (в пределах до 30 мин) не приводит к проявлению эффектов подавления сигналов. ВIV серии экспериментов мы установили, что увеличение концентрации ФС-ЛХТ-317до 1 мМ приводит к практически полному подавлению (на 73%) сигналов на NMDA (рисунок, г). При этом данная концентрация ФС-ЛХТ-317 (и, возможно, более высокие) может оказывать не полностью обратимые эффекты, так как после отмывки от вещества Са2+-сигналы нейпонов не восстанавливаются лп контрольного уровня, что может быть связано с эффектами высоких доз на механизмы десенситизации NMDA-рецепторов. Таким образом, исследуемое соединение бис-ацетаминоэтансульфоноат магния (ФС-ЛХТ-317) обладает выраженными ингибиторными эффектами, направленными на подавление активности NMDA-рецепторов в концентрациях выше 50 мкМ. Данные ингибиторные эффекты являются обратимыми или частично обратимыми и регистрируются по уменьшению амплитуды Са2+-сигналов в нейронах при аппликации NMDA в безмагниевой среде, а также по ингибированию Са2+-импульсов в ответ на исключение магния (снятие магниевого блока) из среды. Следовательно, в основе механизма церебропротективного эффекта вещества может лежать его способность ингибировать кальциевые каналы NMDA-рецепторов нейронов.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.46-49. Библ. 10 назв.
Просмотров: 66