АКТИВНОСТЬ Na+,K+ -АТФАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ПРОЗЕРИНА И ЭЗЕРИНА

Аннотация:

Исследовали активность Na+,K-АТФазы различных отделов головного мозга крыс после внутримышечного введения прозерина и эзерина. Оба препарата приводили к быстрому и существенному снижению активности холинэстераз как в периферических тканях, так и в ЦНС на 30-50%. Также развитие интоксикации не сопровождалось изменениями маркерных для стресс-реакции показателей. Выявлены разнонаправленные изменения активности Na+,K+ -АТФазы (активация эзерином и снижение прозерином) в коре больших полушарий головного мозга крыс. Также под действием прозерина отмечено снижение активности фермента в мозжечке крыс. При этом изменений активности фермента в полосатом теле не выявлено. Полученные данные поддерживают точку зрения о наличии функциональной взаимосвязи между Nа+,К+-АТФазой и никотиновыми холинорецепторами в коре больших полушарий головного мозга крыс. Ключевые слова: Na+,K+-A ТФаза, эзерин, прозерин, холинорецептор. Прозерин и эзерин широко используются в молекулярно-биологических исследованиях в основном как средство для ингибирования активности фермента ацетилхолинэстеразы. Обладая выраженной способностью к подавлению холинэстеразной активности, эти соединения существенно различаются по физико-химическим и фармакологическим свойствам. В частности, по способности модулировать состояние холинорецепторов (ХР). Результатом этого может быть различное влияние указанных антихолинэстеразных препаратов на ферментные и сигнальные системы, регулируемые компонентами холинреактивных структур. Для оценки специфического действия антихолинэстеразных препаратов наиболее эффективным представляется их введение животным в дозах, вызывающих выраженный гиперхолинергический сдвиг, сопровождающийся существенной коррекцией холинергической нейропередачи и, как следствие, снижением роли отдельных холинреактивных структур в развитии стресс-реакции. Это может способствовать отслеживанию эффектов антихолинэстеразных препаратов на регулируемые холинреактивными компонентами ферментные системы. В литературе имеются многочисленные данные, указывающие на возможную холинергическую регуляцию активности Nа+,К+-АТФазы, а исследования последних десятилетий позволяют говорить о возможной тесной регуляторно-функциональной взаимосвязи между Nа+,К+-АТФазой и холинреактивными структурами. Предположительно эта взаимосвязь реализуется в ряде случаев за счет взаимодействия между Na+,K+-АТФазой и ХР. Показана возможность регуляции активности №+,К+-АТФазы ацетилхолином, выражающаяся в гиперполяризации мембран мышечных волокон, а также его участие в выработке эндогенных уабаинподобных факторов адренокортикальными клетками. Таким образом, использование антихолинэстеразных препаратов с различной способностью ингибировать холинэстеразы центральных и периферических холинреактивных структур позволит оценить их участие в регуляции активности Na+,К+-АТФазы. Целью данной работы являлось исследование активности Na+,К+-АТФазы различных отделов головного мозга крыс после введения in vivo npoзерина и эзерина в дозах, обеспечивающих быстрое подавление активности холинэстераз как в периферических тканях, так и в ЦНС. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования проводились на крысах-самцах Вистар массой 120-150 г, которые были разделены натри группы: 1-я — контроль (0.2 мл физиологического раствора внутримышечно), 2-я и 3-я группы — внутримышечно водные растворы эзерина ((3aR,8aS)-1,3а,8-триметил-1Н,2Н,3Н,3аН,8Н,8аН-пирроло[2,3-b]индол-5-ил-N-метилкарбамата) и прозерина (N-(мета-диметилкарбамоил-оксифенил)-триметиламмония бромида) в концентрации 1 мг/мл из расчета 1.5 мг/кг массы тела животного (0.18-0.23 мл). Животных декапитировали через 5 мин после инъекции с выраженными симптомами острой интоксикации антихолинэстеразными препаратами. Головной мозг быстро извлекали и все операции проводили на холоде (4°С). Из мозга выделяли кору больших полушарий (КБП), серое вещество мозжечка и полосатое тело (ПТ). Ткани разрушали в гомогенизаторе Поттера—Эльвейема в 9-кратном объеме 0.25 М раствора сахарозы на 0.02 М трис-HCI-буфере (рН 7.6 при 20°С). Полученные гомогенаты центрифугировали для удаления ядер и неразрушенных клеток при 1000д. Надосадочную жидкость, представляющую собой неочищенную мембранную фракцию, отбирали и сразу использовали для определения активности холинэстераз и транспортных АТФаз. Активность холинэстераз определяли методом Эллмана, в качестве субстрата использовали ацетилтиохолина йодид. Активность транспортных АТФаз определяли по приросту неорганического фосфата. При этом активность Na+,К+-АТФазы рассчитывали как разницу между общей АТФазной активностью и активностью Мg2+-АТФазы, определяемой в присутствии уабаина. Количество неорганического фосфата определяли по реакции с молибдатом аммония и хлоридом олова в присутствии аскорбиновой кислоты. Концентрацию белка в ферментных препаратах определяли методом Лоури. Определение концентрации аскорбиновой кислоты и ее фракций проводили методом Roe, Kuethler. Для статистической обработки полученных результатов использовали программное обеспечение "Microsoft Excel 2007" и "Statistica 6.0". Данные представлены в виде среднего арифметического, рассчитанного поданным 8 экспериментов со стандартной ошибкой среднего арифметического (М±т). Достоверность различий оценивали по t критерию Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Оба препарата оказали существенное влияние на активность как холинэстераз ЦНС, так и фермента периферических тканей (табл. 1). При этом в целом можно отметить более выраженный ингибирующий эффект прозерина по сравнению с эзерином. Это согласуется с данными работы, показывающей, что IC50 для прозерина по отношению к холинэстеразам крови крыс на порядок меньше. Действительно, мы не наблюдали достоверных изменений холинэстеразной активности в эритроцитах животных, обработанных эзерином, в то время как введение прозерина сопровождалось снижением активности фермента более чем на 30%. При исследовании активности холинэстераз различных отделов головного мозга крыс также можно отметить более выраженный ингибирующий эффект прозерина, особенно проявляющийся в случае ферментных препаратов, полученных из мозжечка крыс. Только в случае ПТ нами отмечена более низкая эффективность прозерина по сравнению с эзерином. И наконец, нельзя не обратить внимание на существенное подавление холинэстеразной активности в надпочечниках животных, также более выраженное при использовании прозерина. Это отчасти объясняет результаты, полученные при определении концентрации аскорбиновой кислоты и ее фракций в надпочечниках животных контрольной и опытных групп (табл. 2). Данный показатель часто используется в качестве маркера стресс-реакции. Мы не наблюдали снижения концентрации аскорбиновой кислоты в гомогенатах надпочечников животных обеих опытных групп по сравнению с контрольной. Это может быть обусловлено нарушением холинергической стимуляции, которая, по мнению ряда авторов, имеет существенное значение в выделении катехоламинов. Также нами не отмечено увеличения количества эритроцитов в крови животных, обработанных обоими антихолинэстеразными препаратами. Таким образом, полученные данные (табл. 1, 2) дают основания полагать, что в использованных дозах применяемые антихолинэстеразные вещества обусловливают существенную коррекцию холинергической нейропередачи, что сопровождается снижением отдельных компонентов ответа целостного организма на действие стрессовых факторов. Опираясь на изложенные в литературе общие закономерности действия ксенобиотиков, можно считать, что именно в условиях быстрого внезапного снижения холинэстеразной активности на начальных этапах развития интоксикации наиболее ярко проявляются специфические компоненты действия антихолинзстеразных веществ, в том числе связанные с их способностью к регуляции активности ферментов посредством модуляции состояния ХР. Исследование активности Nа+,К+-АТФазы в различных отделах головного мозга крыс, обработанных эзерином, выявило увеличение активности фермента в гомогенатах КБП и мозжечка по сравнению с контрольной группой (табл. 3). В то же время введение прозерина способствовало снижению активности исследуемого фермента в КБП на сходные величины. При исследовании активности фермента в ПТ головного мозга крыс обеих опытных групп достоверных различий по сравнению с контролем не отмечено. Полученные данные могут быть рассмотрены в нескольких основных аспектах, первый их которых — это направленность изменений. Анализ литературы по вопросу активности Na+,К+-АТФазы в условиях ингибирования холинэстераз in vivo у млекопитающих показывает, что большинство работ в этой области связано с использованием фосфорорганических соединений. При этом обнаруженные при их действии изменения сводятся в основном к снижению активности фермента, что объясняется во многих случаях изменениями, возникающими в составе мембран. На наш взгляд, в условиях острых отравлений, сопровождающихся быстрым развитием клинической картины и значительным подавлением активности холинэстераз, регуляция активности Na+,К+-АТФазы в большей степени может быть обусловлена увеличением концентрации эндогенного ацетилхолина и его влиянием на состояние ХР. На возможную функциональную взаимосвязь фермента с никотиновыми ХР указывается в работах. В этом отношении также интересными являются данные показывающие возможность аллостерической модуляции никотиновых ХР в результате связывания эзерина. Исходя из этого можно предположить, что снижение активности Na+,К+-АТФазы в результате действия прозерина связано с ингибированием холинэстеразной активности и может быть обусловлено вторичными эффектами избыточных концентраций ацетилхолина. В свою очередь, увеличение активности фермента после введения эзерина позволяет допустить наличие регуляторной взаимосвязи между Na+,К+-АТФазой и никотиновыми ХР, для которых данное соединение является специфическим лигандом. На активацию фермента неконкурентными блокаторами никотиновых ХР указывается в работе. И наконец, представляется интересным по какой причине влияние антихолинзстеразных препаратов на активность Na+,К+-АТФазы убывает в ряду КБП>мозжечок>ПТ. Возможным объяснением этого может быть более слабая представленность в ПТ уабаинчувствительных регуляторных изоформ Nа+,К+-АТФазы, а также ее более слабое взаимодействие с компонентами холинреактивных структур. По данным работы, в этом отделе головного мозга преобладающее влияние на активность фермента оказывают дофаминовые рецепторы. Таким образом, оба антихолинэстеразных препарата in vivo при использовании в дозах, обусловливающих существенное торможение холинэстеразной активности и сопровождающихся ослаблением отдельных компонентов стресс-реакции, вызывали разнонаправленные изменения активности Na+,К+-АТФазы в неочищенной мембранной фракции КБП головного мозга крыс. Полученные результаты могут служить подтверждением точки зрения о возможной регуляторной взаимосвязи между ферментом и никотиновыми ХР в этом отделе головного мозга.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.58-61. Библ. 15 назв.
Просмотров: 112