ВЛИЯНИЕ РЕЦЕПТОРОВ КЛЕТКИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ОНКОЛИТИЧЕСКИМ ЭНТЕРОВИРУСАМ

Аннотация:

Определена репликативная способность 5 штаммов онколитических энтеровирусов на панели из 18 нормальных и опухолевых клеток человека. Способность каждой линии клеток реплицировать энтеровирусные штаммы заметно различалась. Линии клеток, слабо реплицирующие отдельные вирусы, могли быть высокочувствительными к другому вирусному штамму. Различия в уровнях экспрессии клеточного рецептора CXADR не коррелировали со способностью к заражению и репликации вируса из группы Коксаки В, хотя полная инактивация гена CXADR, а также гена полиовирусного рецептора (PVR) приводила к потере чувствительности к вирусам Коксаки В5 и полиовирусу соответственно. Для установления причин дифференциальной чувствительности опухолевых клеток к вирусам требуется выявление дополнительных экспрессионных маркеров. Ключевые слова: онколитические вирусы, энтеровирусы, вирусные рецепторы проникновения, вирусный онколиз, избирательная чувствительность Онколитические вирусы представляют новый класс противоопухолевых препаратов. Это природные слабо- или непатогенные вирусы и их производные, модифицированные путем генной инженерии или биоселекции для повышения безопасности и усиления онколитических свойств. Действие онколитических вирусов основано на их способности избирательно уничтожать опухолевые клетки, не оказывая негативного воздействия на нормальные ткани и органы. Избирательная чувствительность опухолевых клеток к вирусам объясняется нарушениями тканевой архитектуры внутри опухоли, дефектами межклеточных контактов, повышенной проницаемостью опухолевых кровеносных сосудов, а также частыми нарушениями в системах индукции интерферонов и реакции клеток на обработку интерфероном 1-го типа. Многие вирусные семейства обладают онколитическими свойствами и рассматриваются в качестве платформ для создания онколитических препаратов. Перспективны в этом качестве и энтеровирусы — обширное семейство мелких вирусов, содержащих одноцепочечный РНК-геном положительной полярности. Хотя некоторые штаммы энтеровирусов являются возбудителями болезней, многие из них обитают в кишечнике здоровых людей и не обладают патогенными свойствами. На основе таких штаммов были созданы живые энтеровирусные вакцины (ЖЭВ), использовавшиеся для неспецифической профилактики сезонных вирусных инфекций. Испытания препаратов ЖЭВ продемонстрировали в ряде случаев онколитическое действие, приводившее к регрессии злокачественных опухолей и их метастазов, наряду с размножением вирусов в опухолевой ткани и стимулированием противоопухолевого иммунитета. Однако действие энтеровирусов на опухоли было непредсказуемым и распространялось лишь на небольшую часть пациентов, что затруднило их практическое использование. Цель данного исследования — установить, насколько колебания в уровнях экспрессии рецепторов проникновения могут влиять на чувствительность к вирусам опухолевых клеток человека. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Для тестирования способности энтеровирусных штаммов реплицироваться в нормальных и опухолевых клетках человека использовали панель, содержащую следующие линии клеток: трансформированные клетки почки эмбриона человека (НЕК293Т), диплоидные легочные фибробласты (ЛЭЧ4), клетки моноцитарной (гистиоцитарной) лимфомы (U937), миелоидной лейкемии (К562), эпителиоидной карциномы (А431), рабдомиосаркомы (RD), рака шейки матки (СЗЗА), рака предстательной железы (DU145), две первичные линии клеток рака предстательной железы (PRC3 и PRC6), клетки рака поджелудочной железы (AsPC-1), 7 линий клеток рака толстого кишечника (RKO, НСТ116, LIM1215, SW480, НСТ15, НТ-29 и СаСо2). Непатогенные штаммы энтеровирусов: штамм вакцины полиовируса 1-го типа Сэбина (PVS1), штамм ЖЭВ14 вируса Коксаки В5, штамм ЖЭВ15 вируса Коксаки В6, штамм ЖЭВ8 вируса Коксаки А7, штамм ЖЭВ7 Эховируса 12, Вирусы нарабатывали на клетках рабдомиосаркомы RD, вирусный титр в единицах ТСЮ50/мл определяли по методу Рида и Менча. После отжига клонирование олигонуклеотидов в плазмиду pCas-Guide-2A-RFP проводили по сайтам BamHI-HF и BsmBI. Последовательности олигонуклеотидов для нокаутирования: hCXADRID — 5'-GATCGTACGCTTAGTCCCGAAGACCG; hCXADRI R— 5-AAAACGGTCUCGGGACTAAGCGTAC; PVR1D— 5-GATCGCGGGATGCCCAATACGAGCCG; PVR1R— 5'-ААААС6ССТС6ТАТТСС6САТССС6С.Трансфекцию плазмид в клетки проводили с помощью реагента Lipofectamine LTX Plus ("Invitrogen"). Полученные моноклональные линии тестировали вестерн-блоттингом с антителами к соответствующим белковым продуктам. РНК из культур клеток выделяли с помощью набора "GeneJET RNA Purification Kit" ("Thermo Scientific"). На матрице РНК проводили синтез «ДНК с помощью набора Mint ("Евроген"). Для ПЦР в реальном времени использовали смесь qPCRmix-HS SYBR ("Евроген") и специфические праймеры. Прай-меры для гена CXADR: прямой — 5'-AGAGCCGCC TACCTGCAGCC, обратный — 5'-TGGCGAAATCCA CTACTCCGCACA. Для нормализации использовали праймеры для генов р-актина и GAPDH. Амплификацию проводили на амплификаторе CFX96 Touch ("Bio-Rad") в режиме: денатурация — 90 с, 95°С, 40 циклов по 15 с, 94°С; 15 с, 62°С; 15 с, 72°С. Для анализа результатов использовали сравнительный, или дельтадельтаCt-метод. Вестерн-блоттинг проводили по протоколу с использованием первичных антител к рецепторам Anti-CXADR (ab82726; "Abeam") и Anti-PVR (аЫ 23252; "Abeam"). Анализ жизнеспособности клеток проводили через 72 ч после заражения серийными разведениями вирусов с помощью МТТ-теста. Значение ТCID50 (дозу вируса, вызывающую гибель 50% клеток) определяли по стандартному методу. Оценку репродукции вируса проводили титрованием среды на чувствительных клетках RD через 72 ч после заражения с MOI=1. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью t критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Линии клеток опухолей человека существенно различаются по способности реплицировать онколитические штаммы энтеровирусов. Онколитическое действие вирусов в значительной степени определяется их способностью избирательно заражать и размножаться в опухолевых клетках. Отсутствие клинического эффекта при введении вируса может объясняться низкой чувствительностью опухолевых клеток пациента к данному вирусному штамму. Для определения различий в чувствительности 18 линий клеток к энтеровирусным штаммам мы параллельно заражали клетки 5 штаммами энтеровирусов при множественности одна инфекционная единица на клетку (МOI=1). Репродукцию вирусов определяли титрованием через 72 ч, когда культуры демонстрировали выраженные цитолитические проявления. Выявлены существенные различия в способности вирусов ЖЭВ14 и ЖЭВ8 реплицироваться на исследуемых линиях клеток (рис. 1). Репликационные свойства вирусов ЖЭВ7, ЖЭВ15 и PV1S (данные не представлены) также существенно варьировали в различных линиях клеток. Наименее выраженной была репликация каждого вируса в культурах U937, ЛЭЧ-4 и К-562. При разнице репликации каждого штамма в панели клеток было отмечено, что линии клеток, плохо реплицирующие один вирусный штамм, могли демонстрировать хорошую репликацию другого штамма. Это указывает на индивидуальный характер чувствительности каждой культуры к различным вирусным штаммам. Наиболее широким тропизмом в отношении линий опухолевых клеток обладали полиовирус PV1S и штамм ЖЭВ14 вируса Коксаки В5. В отношении чувствительности к ЖЭВ14 клетки подразделялись на высокочувствительные, дающие урожай более 100 инфекционных единиц вируса на клетку (НЕК293Т, А431, RKO, НСТ-116, НСТ15, Сасо-2), умеренные — 10-100 инфекционных единиц на клетку (DU145, AsPC-1, СЗЗА, RD, А431, SW480, PRC3, PRC6) и низкочувствительные —1-10 инфекционных единиц на клетку (LIM1215, НСТ-29, К562). Нечувствительными к вирусу ЖЭВ14 были нормальные легочные фибробласты (ЛЭЧ4), а также моноцитарные клетки (U937). Влияние различий в уровне экспрессии рецепторного белка CXADR на чувствительность опухолевых клеток к штамму ЖЭВ14. Энтеровирусы, входящие в исследуемую панель, используют различные рецепторы для проникновения в клетку, уровни экспрессии которых могут различаться в индивидуальных опухолях. Это могло бы объяснить различия в спектрах их действия на опухолевые клетки. Так, штаммы ЖЭВ14 (Коксаки В5) и ЖЭВ15 (Коксаки В6) используют в качестве рецепторов белки CXADR и CD55; штамм ЖЭВ7 (Эховирус 12) не использует белок CXADR, но для заражения этим вирусом важен белок CD55; штамм ЖЭВ8 (Коксаки А7) использует в качестве рецептора белок SCARB2; вакцинный штамм полиовируса 1-го типа (PV1S), как и все полиовирусы, использует в качестве рецептора белок CD155. Для установления взаимосвязи чувствительности опухолевых клеток к ЖЭВ14 и уровня CXADR методом ПЦР в реальном времени был исследован уровень экспрессии этого гена в каждой линии клеток использованной панели. Линия клеток U937 практически не экспрессирует ген CXADR (рис. 2), что может объяснять отсутствие у нее чувствительности к штамму ЖЭВ14. В то же время нечувствительная к тому же штамму линия клеток ЛЭЧ4 экспрессировапа ген CXADR на более высоком уровне, чем высокочувствительная к вирусу линия клеток А431. Из представленных результатов следует, что хотя экспрессия гена CXADR и является необходимым для эффективного заражения клеток, уровень его экспрессии не определяет наблюдаемые различия в способности клеток реплицировать штамм ЖЭВ14. Влияние поверхностных рецепторов PVR и CXADR на способность клеток заражаться вирусами PV1S и ЖЭВ14. Для определения взаимосвязи между наличием на поверхности клеток рецепторов, ответственных за проникновение вирусов в клетку, и онколитических свойств энтеровирусов с помощью технологии CRISPR/Cas9 были получены нокаутные сублинии клеток НЕК293Т с нарушениями экспрессии генов PVR и CXADR. Клетки НЕК239Т исходно чувствительны ко всем исследуемым вирусным штаммам. Результаты вестерн-блоттинга с антителами к белкам PVR и CXADR приведены на рисунке 3 (фрагменты а, б). Присутствие коротких делеций внутри обеих аллелей было также подтверждено секвенированием геномной ДНК (данные не представлены). При заражении 4 клонов клеток НЕК2ЭЗТ с делециями гена PVR и контрольной культуры клеток НЕК293Т полиовирусом PV1S при МOI=1 в контрольной культуре клеток наблюдалась гибель монослоя в течение 12-15 ч, в то время как нокаутные клоны были полностью устойчивы к заражению полиовирусом и не демонстрировали признаков цитопатического действия и через 72 ч. Не было отмечено и репликации полиовируса (рис. 3, в). Таким образом, для заражения клеток полиовирусом или штаммом ЖЭВ14 присутствие соответствующего рецептора является обязательным. Линия клеток с нокаутом по гену CXADR была также проверена на способность реплицировать каждый из 5 исследуемых вирусных штаммов по сравнению с контрольной линией НЕК293Т (данные не представлены). Было установлено, что нарушения экспрессии гена CXADR не влияют на уровни репликации ЖЭВ7 Эховируса 12, ЖЭВ8 Коксаки А7 и PV1S. При исследовании сублинии с делецией гена CXADR динамика заражения и гибели под действием Эховируса 12, CVA7 и PV1S не отличалась от таковой контрольной культуры НЕК293Т. Нарушение экспрессии гена CXADR приводило к практически полной утрате чувствительности к ЖЭВ15/Коксаки В6 и значительному снижению чувствительности к ЖЭВ14/Коксаки В5. Интересно, что низкая продукция вируса ЖЭВ14 нокаутными клетками не сопровождалась видимыми цитопатическими проявлениями, а в культуре наблюдалась персистирующая инфекция на протяжении по крайней мере 6 пассажей. Это свидетельствует о возможности низкозффективного заражения клеток по альтернативному пути, минуя рецептор CXADR. Таким образом, различия в чувствительности опухолевых клеток человека к цитолитическому действию энтеровирусов не могут быть в полной мере объяснены вариациями экспрессии клеточных рецепторов, используемых для проникновения в клетку, что ставит задачу по выявлению дополнительных факторов, определяющих дифференциальную чувствительность опухолей к онколитическому действию вирусов.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.66-70. Библ. 9 назв.
Просмотров: 165