ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МИКРОКАПСУЛ И СОСТАВЛЯЮЩИХ ИХ ПОЛИМЕРОВ НА МАКРОФАГИ И ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

Аннотация:

Исследовано влияние различных концентраций поликатиона полиаллиламина (ПАА) и полианиона полистиролсульфоната (ПСС) и покрытых ими микрокапсул на выживаемость опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха и перитонеальных макрофагов мыши, а также на способность фагоцитов продуцировать АФК. ПАА оказывал концентрационно-зависимое негативное влияние (LD50=12-15 мкг/мл) на жизнеспособность опухолевых клеток. Возможно, данный эффект обусловлен его способностью связывать фосфаты, обедняя среду культивирования. При этом ПАА не влиял на жизнеспособность макрофагов. ПСС не оказывал цитотоксического действия на исследуемые типы клеток. Не обнаружено влияния полиэлектролитных капсул (ПАА/ПСС)3 и (ПАА/ПСС)3ПАА в исследуемом диапазоне концентраций на жизнеспособность макрофагов и опухолевых клеток. Микрокапсулы ПАА с положительно заряженной поверхностью значительно быстрее и интенсивнее активировали макрофаги. Отмечена прямая зависимость уровня хемилюминесцентного ответа от количества присутствующих капсул. Ключевые слова: микрокапсулы, опухолевые клетки, макрофаги, активные формы кислорода Задачи, связанные с созданием, изучением и использованием нано- и микроконтейнеров, актуальны для реализации ряда важных разработок в области медицины, косметологии, биотехнологии, тонкой химической технологии и т.д. Существует несколько стратегических направлений их решения, один из которых заключается в применении полиэлектролитных нано- и микрокапсул, получаемых методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидные частицы нано- и микроразмеров с последующим разрушением этих частиц. Главными достоинствами такого метода является управление физико-химическими и механическими свойствами микрокапсул на этапе их формирования посредством подбора компонентов оболочки, ядра и растворителя, а также изменения числа полиэлектролитных слоев. Функциональность полиэлектролитных капсул определяется назначением помещенного в них агента. Их используют в качестве систем доставки биологически активных соединений к клеткам и тканям, для создания пролонгированных лекарственных препаратов. Благодаря полупроницаемости оболочки микрокапсулы могут использоваться в качестве биореакторов. Использование трудно разлагаемых полиэлектролитов увеличивает продолжительность функционирования микрокапсул в организме. Данные обстоятельства позволяют использовать микрокапсулы в качестве открытых систем, оболочка которых обеспечивает контакт с окружающей средой, не препятствуя работе биомолекул и одновременно обеспечивая им защиту. Однако использование полиэлектролитных микрокапсул в качестве длительно функционирующих в организме биореакторов возможно лишь в том случае, если они не будут оказывать токсического эффекта на клетки и ткани. В литературе широко представлены исследования токсичности полиэлектролитных микрокапсул. Было исследовано влияние полиэлектролитных микрокапсул (Fe3О4/ПAA)4 на клетки линии А549; капсулы такого типа имеют низкую токсичность, и выживаемость клеток составляет примерно 87% при максимальной концентрации микрокапсул 0.12 мг/мкл. Подобные результаты были получены при изучении выживаемости мезенхимных стволовых клеток в присутствии микрокапсул с оболочкой из полиаллиламина (ПАП) и полистирол-сульфоната (ПСС), модифицированной Fe304. Эти капсулы демонстрировали незначительную цитотоксичность и влияли на клеточные функции при умеренном соотношении клетки:микрокапсулы <1:10 (выживаемость 85%). Средний процент адгезионных клеток составил 85% при соотношении клетки:микрокапсулы 1:5,64%—при 1:10 и 38% — при 1:20 по сравнению с 85% в контрольной группе. Однако при изучении токсичности полиэлектролитов ПСС, ПАА и состоящих из них капсул, модифицированных ZnO, в отношении цериодафний, личинок хирономид и аквариумных рыб, было показано, что максимальной токсичностью обладает раствор ПАА, наименьшей — ПСС, а безопасная концентрация микрокапсул с оболочкой (ПАА/ПСС)2 (ZnО/ПСС)3(ПАА/ПСС) для гидробионтов в водной среде не превышает 250 мг/л. В работе описано влияние как биодеградируемых (альгинат/по-лилизин), так и небиодеградируемых (ПАА/ПСС) микрокапсул на культуры клеток С6 и ЗТЗ. Токсический эффект микрокапсул возрастал при росте их концентрации от 103 до 107 штук/мл, в то время как природа полиэлектролитов, составляющих оболочки микрокапсул, мало влияла на их токсичность. Для понимания возможности применения небиодеградируемых микрокапсул из ПСС/ПАА в качестве инвазивных биореакторов, длительно функционирующих в организме, и средств доставки необходимо изучение влияния как самих полиэлектролитов, так и микрокапсул на клетки млекопитающих. Цель данной работы — исследование влияния полимеров и микрокапсул на продолжительность жизни перитонеальных макрофагов и опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха, а также на функциональную активность иммунокомпетентных клеток, в частности на АФК-генерирующую активность перитонеальных макрофагов. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Использовали полиэлектролиты полистиролсульфонат натрия (ПСС) и полиаллиламин гидрохлорид (ПАА) с молекулярной массой 70 кД ("Sigma"). Получение микросферолитов СаС03. К 0.33 М водному раствору CaCI2 при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли равный объем 0.33 М водного раствора Na2C03. Перемешивание продолжалось в течение 30 с, после чего прекращалось, образовавшаяся суспензия выдерживалась до полного осаждения образовавшихся частиц. Процесс "созревания" микросферолитов контролировали с помощью светового микроскопа. Затем надосадочную жидкость декантировали, осадок промывали водой и использовали для получения полиэлектролитных микрокапсул. Полученные микрочастицы имели диаметр 4±1 мкм. Количество образованных микросферолитов определялось в камере Горяева. Приготовление полиэлектролитных микрокапсул. Полиэлектролитные микрокапсулы были получены методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсную микрочастицу (микросферолит) с ее последующим растворением. Поочередную адсорбцию ПСС и ПАА на поверхности микросферолитов СаС03 проводили в растворах полиэлектролитов с концентрацией 2 мг/мл, содержавших 0.5 М раствор NaCI ("Реахим"). За каждым шагом адсорбции следовала 3-кратная промывка раствором 0.5 М NaCI, необходимая для удаления неадсорбированных молекул полимеров. Частицы отделялись от супер-натанта центрифугированием при 500д. После нанесения 6 или 7 слоев карбонатные ядра были растворены в 0.2 М растворе ЭДТА в течение 2 ч. Полученные капсулы трижды отмывали бидистиллированной водой для удаления продуктов распада ядер. Полученные микрокапсулы имели диаметр 4±1 мкм. Выделение перитонеальных макрофагов. В работе использовали перитонеальные макрофаги, выделенные из мышей линии SHK. Брюшную зону мыши обрабатывали раствором этилового спирта и внутрибрюшинно вводили стерильный физиологический раствор из расчета 1 мл на 10 г массы. В течение 5-8 мин массировали брюшную полость. Затем животное декапитировапи, экссудат собирали пастеровскими пипетками и помещали в стерильные, охлажденные до 4°С пробирки, которые центрифугировали при 400д в течение 10 мин. Полученный осадок клеток дважды промывали физиологическим раствором. Выделенные клетки ресуспензировали в полной среде RPMI-1640, содержавшей 2 мМ L-глутамина, 5% ЭТС, гентамицин, и хранили при 4°С до начала эксперимента. Выделенные клетки подсчитывали в камере Горяева. Для определения их жизнеспособности использовали 0.1% раствор витального красителя трипанового синего в соотношении 1:20. Примесь эритроцитов составляла не более 5%. Формирование экспериментальной опухоли. Для формирования опухоли использовали клетки асцитной карциномы Эрлиха, хранящиеся в криобанке. Подготовка клеток к перевивке осуществлялась следующим образом: после размораживания, 3-кратного отмывания от криопротекторов и ресуспензирования в солевом буферном растворе клетки трансплантировали в брюшную полость животного в объеме 1 мл, где они развивались, Через 10 сут из зоны роста опухоли отбирали асцитическую жидкость в объеме 1 мл с концентрацией ~10 в 7степени клеток/мл и трансплантировали в брюшную полость другой мыши линии SHK. Жизнеспособная и стабильная культура асцитной карциномы Эрлиха получается через 3 таких пассажа. Выделение опухолевых клеток из асцитической жидкости опухоленосителя. Асцитическую жидкость из брюшной полости опухоленосителя центрифугировали при 400д в течение 10 мин. Дважды отмытые 0.9% раствором NaCI опухолевые клетки наслаивали на градиент Percoll/NaCI с плотностями 1.040,1.056 и 1.078 г/дл и центрифугировали 40 мин при 4000д. Затем отбирали шприцем слой молодых опухолевых клеток (р=1.056 г/дл), промывали 2 раза в 0.9% растворе NaCI. Выделенные клетки ресуспензировали в DMEM. Клетки инкубировали в стерильном термостате при 37°С в среде DMEM с 10% ЭТС. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева с использованием 0.1% спиртового раствора витального красителя трипанового синего в соотношении 1:20. Определение цитотоксичности микрокапсул и составляющих их полимеров. Клетки высевали в 96-луночный планшет в концентрации 3x10 в 5степени мл и культивировали в объеме 200 мкп при 37°С в атмосфере 5% СО2. После 60 мин инкубации к клеткам добавляли тестируемые соединения или микрокапсулы в разных концентрациях. Затем клетки культивировали в тех же условиях в течение 24 ч. Цитотоксичность оценивали с помощью МТТ-теста в 96-луночных планшетах. После инкубации образцов в каждую лунку добавляли 20 мкл МТТ ("Sigma-Aldrich") в концентрации 5 мг/мл с последующей инкубацией при 37°С в атмосфере 5% СО2. Через 2 ч жидкую среду из планшетов удаляли и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного спектрофотометра ("Тесап Infinite 200") определяли оптическую плотность при 530 нм. Определение жизнеспособности клеток проводили без удаления микрокапсул из среды. Исследование влияния ПСС, ПАА и микрокапсул на АФК-генерирующую активность перитонеальных макрофагов. Продукцию АФК макрофагами определяли по уровню активированной хемилюминесценции (XЛ) в присутствии люминола (в качестве люминесцентного зонда). Метод основан на окислении люминола или его производных АФК. В результате реакции образуется нестабильная возбужденная форма люминола, время жизни которой мало. Переход возбужденной формы люминола в невозбужденную молекулу аминофтапевой кислоты сопряжен с испусканием квантов света в области 420 нм. В ячейки термостатируемого (37°С) 96-луночного планшета для хемилюминометра помещали 200 мкл среды регистрации (0.9% NaCI, 5 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 1 мМ CaCI2 рН 7.6), 10 мкл люминола (10 в -4 М), 10 мкл суспензии иммунокомпетентных клеток. Клетки инкубировали в течение 1 мин, затем добавляли микрокапсулы. XЛ-ответ клеток регистрировали в течение 10-20 мин. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. На первом этапе исследования изучали действие различных концентраций поликатиона ПАА и полианиона ПСС на жизнеспособность клеток опухолевых и иммунокомпетентных клеток. ПАА оказывал концентрационно-зависимое негативное влияние (LD50=12-15 мкг/мл) на жизнеспособность асцитной карциномы Эрлиха (рис. 1). Вероятно, такой эффект можно объяснить способностью ПАА в значительной мере связывать фосфаты, обедняя среду пребывания клеток. Это же свойство ПАА используется и при лечении гиперфосфатемии. Возможно, поликатион ПАА также является агрегирующим агентом для суспензиально культивируемых клеток карциномы, так как они имеют отрицательный поверхностный заряд. В то же время присутствие ПСС в среде (рис. 1) практически не влияло на жизнеспособность клеток карциномы. Различные концентрации ПАА и ПСС не оказывали значимого влияния на жизнеспособность перитонеальных макрофагов (рис. 1). Оценивая влияние микрокапсул из исследуемых полиэлектролитов на жизнеспособность опухолевых клеток и на выживаемость перитонеальных макрофагов (рис. 2), можно заключить, что в исследуемом диапазоне концентраций полиэлектролитные капсулы с внешним слоем из ПАА и ПСС не оказывают статистически достоверного влияния на жизнеспособность клеток. Тот факт, что микрокапсулы, содержащие ПАА на внешнем слое, не оказывают токсического влияния на клетки карциномы, в отличие от свободного ПАА, может быть объяснен тем, что аминогруппы ПАА в составе оболочки микрокапсулы связаны с сульфогруппами ПСС, что предотвращает их способность связывать фосфаты. Микрокапсулы могут быть подвержены фагоцитозу макрофагами, что приводит к активации в них NADPH-оксидазы, в результате чего образуется ряд АФК (супероксидный анион-радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород). Мы исследовали влияние микрокапсул с различным верхним полиэлектролитным слоем на способность макрофагов продуцировать АФК. Был проведен анализ ХЛ-ответа макрофагов в присутствии полиэлектролитных микрокапсул, содержащих на внешнем слое ПАА, либо ПСС (рис. 3). Анализируя динамику ХЛ, можно наблюдать различия в скорости воздействия разных типов капсул на АФК-генерирующую активность фагоцитов. Так, микрокапсулы ПАА с положительно заряженной поверхностью (рис. 3, а) значительно быстрее и интенсивнее влияли на активность клеток в первые секунды. Данный факт может быть связан с тем, что отрицательный заряд мембраны макрофага увеличивает его скорость сближения с микрокапсулой. В случае с микрокапсулами с отрицательно заряженной поверхностью (рис. 3, б) данный эффект был значительно снижен. Для более наглядного представления результатов была построена диаграмма светосуммы ХЛ-ответа перитонеапьных макрофагов в присутствии различных концентраций микрокапсул с верхним слоем ПАА и ПСС (рис. 3, в, г). Отличия ХЛ-ответа от контроля наблюдались в том случае, когда соотношение между капсулами и фагоцитами 1:1 и более. По-видимому, такое соотношение является пороговым для активации макрофагов. Наблюдаемая в дальнейшем прямая зависимость уровня ХЛ-ответа от количества присутствующих капсул свидетельствует об активации макрофагов этими типами капсул. Известно, что интенсивность ХЛ прямо пропорциональна количеству актов взаимодействия микрокапсул с клетками в единицу времени. Исходя из данных светосуммы, количество активирующих капсул за равное время (1000с) примерно одинаково для капсул с верхним слоем ПАА и ПСС, что свидетельствует об отсутствии влияния поверхностного заряда на продукцию АФК макрофагами. Полученные in метаданные позволяют заключить, что поликатион ПАА имеет концентрационно-зависимое негативное влияние на жизнеспособность асцитной карциномы Эрлиха (LD60=12-15 мкг/мл), тогда как полианион ПСС не влияет на выживаемость макрофагов и опухолевых клеток. На жизнеспособность исследуемых типов клеток также не влияли полиэлектролитные капсулы с архитектурой оболочки (ПАА/ПСС)3 и (ПАА/ПСС)3ПАА в исследуемом диапазоне концентраций. Микрокапсулы обоих типов способны активировать АФК-генерирующую активность перитонеальных макрофагов, при этом практически равные уровни светосуммы ХП-ответов для двух типов капсул свидетельствуют об отсутствии влияния внешнего слоя на продукцию АФК.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.77-83. Библ. 13 назв.
Просмотров: 172