НОВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ О ВЛИЯНИИ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА НА МОРФОЛОГИЮ И БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ОПУХОЛИ толстой кишки

Аннотация:

Общегистологическими и иммунобиохимическими методами с использованием моноклональных и поликлональных антител к Ki-67, Bcl-2, р53 и VEGF исследовали новообразования толстой кишки белых нелинейных крыс через 5 мес после введения канцерогена на фоне вторичной иммунной недостаточности. Установлено, что при изолированном введении канцерогена в толстой кишке формируются аденокарциномы с высокой и умеренной степенью клеточной дифференцировки, а при введении канцерогена на фоне имеющегося иммунодефицитного состояния процент развития аденокарцином с GRADE 2 и GRADE 3 достоверно увеличивается в 1.5 раза. Кроме того, это проявляется более агрессивным морфологическим фенотипом опухолей и появлением отдаленных метастазов. Ключевые слова: канцерогенез, толстая кишка, аденокарцинома, иммунодефицит Поданным Федеральной службы государственной статистики за 2016 г. злокачественные новообразования — одна из основных причин смертности среди взрослого населения и занимают второе место после болезней сердечно-сосудистой системы. В России ежегодно выявляются более 560 тыс. новых случаев злокачественных новообразований. Совокупный показатель распространенности опухолей — 388 на 100 тыс. населения. Доля злокачественных новообразований органов пищеварения у женщин составляет 23.9%, у мужчин — 31.7%, в том числе ободочной кишки — 7 и 5.8% соответственно. Абсолютное число впервые в жизни установленных диагнозов злокачественных образований ободочной и прямой кишки превысило 28 тыс. и уступает по количеству лишь опухолям кожи, молочной железы, органов дыхания и желудка. Несмотря на все усилия врачей-онкологов, направленные на снижение распространенности опухоли толстой кишки, проблемы ее ранней диагностики и своевременного лечения остаются весьма актуальными. Основными факторами, определяющими прогноз в онкологии, являются распространенность и степень дифференцировки опухоли. Однако агрессивность опухолевого процесса оценивается не только этими характеристиками. Клиническая значимость молекулярно-биологических опухолевых маркеров, как правило, определяется иммуногистохимическими методами. Молекулярно-биологи-ческие маркеры считаются специфическими показателями высокого риска опухолевой прогрессии и достоверно коррелируют с прогнозом жизни пациентов. За последние 15 лет достигнуты успехи в исследовании иммунологии и иммунотерапии рака. Получены данные о том, что опухоль толстой кишки развивается на основе выраженных нарушений иммунной системы, возникающих уже при предопухолевых заболеваниях, определяются распространенностью опухолевого процесса и усугубляются применяемым лечебным воздействием (операцией, облучением, химиотерапией, гормонотерапией). Эти данные и сведения о более благоприятном течении заболевания при сохраненном иммунитете побуждают многих исследователей к дальнейшему изучению состояния иммунной системы и разработке на этой основе более эффективных схем лечения с включением иммунотерапии. Все методы иммунотерапии направлены на восстановление нарушенных функций иммунной системы. Так, известно, что рак толстой кишки приводит к развитию иммунодефицитного состояния. При метастазировании опухоли отмечается прогрессирование иммунодефицитного состояния — возникает формирование более выраженной иммуносупрессии по Т- и В-системам лимфоцитов. При этом количество CD3+- и СD4+-лимфоцитов, концентрация IgG, IgA и IgM снижается, одновременно значительно падает и уровень NK-клеток. Таким образом, можно заключить, что развитие опухолевого процесса не возникает как следствие простого мутационного события. Канцерогенез имеет "многошаговый" и "многофакторный" характер. В то же время очевидно, что развитие онкоген-ной трансформации еще не означает формирование опухолевого процесса и тем более заболевания. В патогенезе рака толстой кишки важная роль должна отводиться факторам, способствующим опухолевой прогрессии (параонкогенные факторы). В этой связи особое значение и актуальность для практической и фундаментальной медицины имеет установление антигенного фенотипа, степени агрессивности и закономерности роста опухоли толстой кишки в условиях действия параонкогенных факторов для патогенетического обоснования новых принципов терапии онкологических заболеваний. Цель данного исследования — изучить морфологическую и иммуногистохимическую характеристику опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), индуцированных 1,2-диметилгидразином, в условиях вторичного иммунодефицита. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на белых нелинейных крысах-самцах (п=100) массой 180-220 г. Животные содержались в виварии, уход за ними осуществляли в соответствии с "Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных" (1985), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.) и законом "О защите животных от жестокого обращения" (гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999 г.). В процессе эксперимента изучали общее состояние крыс, а также показатели иммунной системы животных. Животные были разделены на 4 группы: интактную (n=20), контрольную (после удаления селезенки; n=20), 1-ю опытную (крысы с внутрибрюшинным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 нед; p=30), 2-ю опытную (спленэктомированные крысы, которым через 30 сут после операции вводили канцероген аналогично крысам 1-й группы; n=30). Спленэктомия выполнялась под местной анестезией с соблюдением всех правил асептики и антисептики через разрез по белой линии живота. Животных обеих опытных групп выводили из эксперимента через 5 мес после окончания курса введения канцерогена передозировкой эфира. При аутопсии проводилась ревизия органов брюшной полости с вскрытием толстой кишки. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация. Животные, у которых не произошло формирования опухоли, в исследовании не учитывались. Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартным протоколам. Тканевые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные 0.1% раствором poly-L-lysine в течение 5 мин, высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Окрашивание проводилось ручным и аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров Autostainer-360 ("Thermo") и "Leica BOND-MAX" с применением систем визуализации "Envision" ("Dako") и "NovoLink polymer" ("NovoCastra"). Использовали моноклонапьные и поликлонапьные антитела "Santa Cruze" и "NovoCastra": Ki-67 — маркер пролиферативной активности; Bcl-2 — маркер апоптоза; р53—супрессор опухолевого роста; VEGF — маркер ангиогенеза. Для проведения морфометрических измерений новообразований ЖКТ использовали окрашивание гематоксилином и эозином. Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, промывали проточной водой, затем выполняли стандартную проводку на тканевом гистопроцессоре "Leica ASP 200". После проводки кусочки органов ЖКТ с новообразованиями заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм наносили на отрицательно заряженные стекла "Mentzel Glasses Super Frost" и проводили окрашивание по стандартной методике. Цифровые снимки микропрепаратов получали с применением системы архивирования на базе микроскопа "Leica" DM4000B с использованием цветной фотокамеры "Leica" DFC 425 и лицензионной программы "Leica Application Sute 3.6.0". Линейные морфометринеские измерения выполнены с использованием лицензионной программы "Leica Application Sute 3.6.0". Количественные морфометринеские измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций проводили в программах "Микро-Анализ" и "Sigma Scan Pro". Интенсивность мембранной и цитоплазматической иммуногистохимической реакции оценивали методом автоматического выделения и подсчета площади интересующего цветового спектра (окрашенного DAB) по отношению к площади снимка. Затем числовые значения площади позитивной иммуногистохимической реакции переводились в процентное отношение к общей площади снимка. Для каждого среза измерения выполнены не менее чем в 10 презентативных полях зрения при увеличении 400. Статистическую значимость полученных данных определяли по t критерию Стьюдента. Данные представляли в виде средней арифметической величины (М) и ее средней ошибки (т). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В обеих опытных группах в 52-58% случаев в толстой кишке на фоне предопухолевых изменений в виде пролиферации крипт и клеточной дисплазии различной степени формируется одна, реже—две опухоли, имеющие морфологию аденокарциномы in situ или высокодифференцированной аденокарциномы (рис. 1). Чаще опухоли имеют эндофитный или циркулярный тип роста и глубокую инвазию в кишечную стенку с переходом на серозную оболочку и околокишечную жировую клетчатку. Размеры опухоли вариабельны, но не превышают 1 см. У 38% крыс помимо опухолей толстой кишки отмечалось формирование множественных изъязвлений слизистой оболочки дистального отдела пищевода. При микроскопическом исследовании в них выявлялись признаки лейкоплакии с папилломатозом и акантозом, а также дисплазии многослойного плоского неороговевающего эпителия. У 24% крыс эти изменения соответствовали внутриэпителиальному плоскоклеточному раку с очагами микроинвазии. Специфическая дифференцировка опухолевых клеток может быть выражена в различной степени. В настоящее время принята классификация по степени GRADE (ВОЗ 2000), основанная на способности опухоли образовывать тубулярные структуры (для аденокарцином): GRADE 1 — высокая (95% и более), GRADE 2 —средняя (50-94%), GRADE 3 — низкая (5-50%), GRADE 4 — недифференцированная (менее 5%). По степени клеточной дифференцировки на долю высокодифференцированных форм (GRADE 1) приходилось 64% от общего числа опухолей у крыс в 1-й опытной группе и лишь 44% опухолей — во 2-й группе. Умеренно дифференцированные аденокарциномы (GRADE 2) составляли в 1-й опытной группе 36%, во 2-й — 47%. Низкодифференцированные формы (включая солидную и слизистую аденокарциному) (GRADE 3) встречались только во 2-й опытной группе в 9% случаев (таблица). У крыс 1-й опытной группы метастатические очаги выявлялись в регионарных лимфатических узлах в 37% случаев, при этом печень оставалась незатронутой. Во 2-й группе регионарные метастазы в лимфатических узлах выявлялись уже у 58% крыс с отдаленными метастазами в печень в 17% случаев. В первичном опухолевом очаге наблюдалась умеренная дифференцировка клеток. Значения ангиогенеза в метастазах находятся в прямой зависимости от степени клеточной дифференцировки и увеличиваются прямо пропорционально росту анаплазии опухолевых клеток. Высокая интенсивность клеточной пролиферации Ki-67 у крыс 1-й опытной группы выявлена в 19% опухолей с GRADE 1 и в 59% — с GRADE 2 (рис. 2). Во 2-й опытной группе высокая пролиферация клеток отмечалась в 17% опухолей с GRADE 1, в 75% — с GRADE 2 (рис. 3) и в 100% — с GRADE 3. Экспрессия Bcl-2 в 1-й опытной группе отмечалась в 13% опухолей с высокой степенью дифференцировки и в 26% опухолей с умеренной дифференцировкой клеток. Во 2-й опытной группе позитивную реакцию давали 16% клеток высокодифференцированных опухолей, 33% клеток умеренно дифференцированных опухолей и 19% клеток опухолей с низкой степенью дифференцировки. Следует отметить, что позитивная реакция на Bcl-2 отмечалась не только в цитоплазме опухолевых клеток, но и в многочисленных клетках лимфоцитарной инфильтрации (таблица). В высокодифференцированных опухолях у крыс 1 -й опытной группы экспрессия белка-супрессора р53 выявлялась в 14%, в умеренно дифференцированных — в 33% (рис. 2). У крыс 2-й опытной группы гиперэкспрессия р53 выявлялся в 21% опухолей с GRADE 1, в 67% — с GRADE 2 (рис. 3) и в 100% — с GRADE 3 (таблица). Позитивная реакция с VEGF в 1-й опытной группе отмечалась в 12% опухолей с GRADE 1 и в 25% — с GRADE 2, причем в зоне инвазивного роста и на границе здоровых тканей экспрессия VEGF была выше, чем в других слоях опухоли. Опухоли у крыс 2-й опытной группы характеризовались достоверно более высокой экспрессией маркеров ангиогенеза. Реакция к VEGF выявлялась и в строме опухоли, и в опухолевых клетках. Позитивную реакцию давали 11% клеток в опухолях с GRADE 1 и 37% — с GRADE 2. В низкодифференцированных клетках реакция с VEGF была достоверно более интенсивная и составляла 58% (таблица). Таким образом, при изолированном введении канцерогена в толстой кишке формируются аденокарциномы с высокой и умеренной клеточной дифференцировкой. При введении канцерогена на фоне имеющегося иммунодефицитного состояния процент развития аденокарцином с GRADE 2 и GRADE 3 увеличивается в 1.5 раза (р<0.001). Кроме того, это проявляется более агрессивным морфологическим фенотипом опухолей и появлением отдаленных метастазов. В злокачественных опухолях с низкой клеточной дифференцировкой отмечается значимое увеличение экспрессии Ki-67, Bcl-2 и р53 (р<0.001), что, безусловно, является важным прогностическим фактором. Гиперэкспрессия белка р53 и высокий уровень Ki-67 имеют потенциально неблагоприятный прогноз, связанный с высоким риском развития рецидивов, низкой выживаемостью, а также наличием метастазов. Кроме того, животные, у которых выявляется коэкспрессия мутантного р53 и маркера апоптоза Вс1-2, имеют более агрессивные и метастазирующие опухоли. В наших предыдущих исследованиях было показано, что индуцирование опухоли толстой кишки сопровождается выраженной атрофией вилочковой железы с дезорганизацией эпителиальных клеток, структур нетимопоэтического окружения коркового и мозгового вещества, а также угнетением тимопоэза. В связи с развитием постспленэктомического гипоспленизма и значительным дисбалансом иммунной и эндокринной системы развивающаяся опухоль быстро ускользает от иммунного надзора за счет факторов иммунорезистентности (выделение растворимых опухолевых антигенов, приобретение устойчивости к апоптозу клеток за счет потери рецептора к ФИО, продукция в большом количестве ИЛ-6 и ИЛ-10), становится более агрессивной с развитием ранних отдаленных метастазов.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.84-89. Библ. 13 назв.
Просмотров: 67