Дальневосточный государственный медицинский университет Поиск | Личный кабинет | Авторизация
Поиск статьи по названию
Поиск книги по названию
Каталог рубрик
в коллекциюДобавить в коллекцию

НОВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ О ВЛИЯНИИ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА НА МОРФОЛОГИЮ И БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ОПУХОЛИ толстой кишки


Аннотация:

Общегистологическими и иммунобиохимическими методами с использованием моноклональных и поликлональных антител к Ki-67, Bcl-2, р53 и VEGF исследовали новообразования толстой кишки белых нелинейных крыс через 5 мес после введения канцерогена на фоне вторичной иммунной недостаточности. Установлено, что при изолированном введении канцерогена в толстой кишке формируются аденокарциномы с высокой и умеренной степенью клеточной дифференцировки, а при введении канцерогена на фоне имеющегося иммунодефицитного состояния процент развития аденокарцином с GRADE 2 и GRADE 3 достоверно увеличивается в 1.5 раза. Кроме того, это проявляется более агрессивным морфологическим фенотипом опухолей и появлением отдаленных метастазов. Ключевые слова: канцерогенез, толстая кишка, аденокарцинома, иммунодефицит Поданным Федеральной службы государственной статистики за 2016 г. злокачественные новообразования — одна из основных причин смертности среди взрослого населения и занимают второе место после болезней сердечно-сосудистой системы. В России ежегодно выявляются более 560 тыс. новых случаев злокачественных новообразований. Совокупный показатель распространенности опухолей — 388 на 100 тыс. населения. Доля злокачественных новообразований органов пищеварения у женщин составляет 23.9%, у мужчин — 31.7%, в том числе ободочной кишки — 7 и 5.8% соответственно. Абсолютное число впервые в жизни установленных диагнозов злокачественных образований ободочной и прямой кишки превысило 28 тыс. и уступает по количеству лишь опухолям кожи, молочной железы, органов дыхания и желудка. Несмотря на все усилия врачей-онкологов, направленные на снижение распространенности опухоли толстой кишки, проблемы ее ранней диагностики и своевременного лечения остаются весьма актуальными. Основными факторами, определяющими прогноз в онкологии, являются распространенность и степень дифференцировки опухоли. Однако агрессивность опухолевого процесса оценивается не только этими характеристиками. Клиническая значимость молекулярно-биологических опухолевых маркеров, как правило, определяется иммуногистохимическими методами. Молекулярно-биологи-ческие маркеры считаются специфическими показателями высокого риска опухолевой прогрессии и достоверно коррелируют с прогнозом жизни пациентов. За последние 15 лет достигнуты успехи в исследовании иммунологии и иммунотерапии рака. Получены данные о том, что опухоль толстой кишки развивается на основе выраженных нарушений иммунной системы, возникающих уже при предопухолевых заболеваниях, определяются распространенностью опухолевого процесса и усугубляются применяемым лечебным воздействием (операцией, облучением, химиотерапией, гормонотерапией). Эти данные и сведения о более благоприятном течении заболевания при сохраненном иммунитете побуждают многих исследователей к дальнейшему изучению состояния иммунной системы и разработке на этой основе более эффективных схем лечения с включением иммунотерапии. Все методы иммунотерапии направлены на восстановление нарушенных функций иммунной системы. Так, известно, что рак толстой кишки приводит к развитию иммунодефицитного состояния. При метастазировании опухоли отмечается прогрессирование иммунодефицитного состояния — возникает формирование более выраженной иммуносупрессии по Т- и В-системам лимфоцитов. При этом количество CD3+- и СD4+-лимфоцитов, концентрация IgG, IgA и IgM снижается, одновременно значительно падает и уровень NK-клеток. Таким образом, можно заключить, что развитие опухолевого процесса не возникает как следствие простого мутационного события. Канцерогенез имеет "многошаговый" и "многофакторный" характер. В то же время очевидно, что развитие онкоген-ной трансформации еще не означает формирование опухолевого процесса и тем более заболевания. В патогенезе рака толстой кишки важная роль должна отводиться факторам, способствующим опухолевой прогрессии (параонкогенные факторы). В этой связи особое значение и актуальность для практической и фундаментальной медицины имеет установление антигенного фенотипа, степени агрессивности и закономерности роста опухоли толстой кишки в условиях действия параонкогенных факторов для патогенетического обоснования новых принципов терапии онкологических заболеваний. Цель данного исследования — изучить морфологическую и иммуногистохимическую характеристику опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), индуцированных 1,2-диметилгидразином, в условиях вторичного иммунодефицита. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на белых нелинейных крысах-самцах (п=100) массой 180-220 г. Животные содержались в виварии, уход за ними осуществляли в соответствии с "Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных" (1985), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.) и законом "О защите животных от жестокого обращения" (гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999 г.). В процессе эксперимента изучали общее состояние крыс, а также показатели иммунной системы животных. Животные были разделены на 4 группы: интактную (n=20), контрольную (после удаления селезенки; n=20), 1-ю опытную (крысы с внутрибрюшинным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 нед; p=30), 2-ю опытную (спленэктомированные крысы, которым через 30 сут после операции вводили канцероген аналогично крысам 1-й группы; n=30). Спленэктомия выполнялась под местной анестезией с соблюдением всех правил асептики и антисептики через разрез по белой линии живота. Животных обеих опытных групп выводили из эксперимента через 5 мес после окончания курса введения канцерогена передозировкой эфира. При аутопсии проводилась ревизия органов брюшной полости с вскрытием толстой кишки. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация. Животные, у которых не произошло формирования опухоли, в исследовании не учитывались. Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартным протоколам. Тканевые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные 0.1% раствором poly-L-lysine в течение 5 мин, высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Окрашивание проводилось ручным и аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров Autostainer-360 ("Thermo") и "Leica BOND-MAX" с применением систем визуализации "Envision" ("Dako") и "NovoLink polymer" ("NovoCastra"). Использовали моноклонапьные и поликлонапьные антитела "Santa Cruze" и "NovoCastra": Ki-67 — маркер пролиферативной активности; Bcl-2 — маркер апоптоза; р53—супрессор опухолевого роста; VEGF — маркер ангиогенеза. Для проведения морфометрических измерений новообразований ЖКТ использовали окрашивание гематоксилином и эозином. Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, промывали проточной водой, затем выполняли стандартную проводку на тканевом гистопроцессоре "Leica ASP 200". После проводки кусочки органов ЖКТ с новообразованиями заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм наносили на отрицательно заряженные стекла "Mentzel Glasses Super Frost" и проводили окрашивание по стандартной методике. Цифровые снимки микропрепаратов получали с применением системы архивирования на базе микроскопа "Leica" DM4000B с использованием цветной фотокамеры "Leica" DFC 425 и лицензионной программы "Leica Application Sute 3.6.0". Линейные морфометринеские измерения выполнены с использованием лицензионной программы "Leica Application Sute 3.6.0". Количественные морфометринеские измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций проводили в программах "Микро-Анализ" и "Sigma Scan Pro". Интенсивность мембранной и цитоплазматической иммуногистохимической реакции оценивали методом автоматического выделения и подсчета площади интересующего цветового спектра (окрашенного DAB) по отношению к площади снимка. Затем числовые значения площади позитивной иммуногистохимической реакции переводились в процентное отношение к общей площади снимка. Для каждого среза измерения выполнены не менее чем в 10 презентативных полях зрения при увеличении 400. Статистическую значимость полученных данных определяли по t критерию Стьюдента. Данные представляли в виде средней арифметической величины (М) и ее средней ошибки (т). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В обеих опытных группах в 52-58% случаев в толстой кишке на фоне предопухолевых изменений в виде пролиферации крипт и клеточной дисплазии различной степени формируется одна, реже—две опухоли, имеющие морфологию аденокарциномы in situ или высокодифференцированной аденокарциномы (рис. 1). Чаще опухоли имеют эндофитный или циркулярный тип роста и глубокую инвазию в кишечную стенку с переходом на серозную оболочку и околокишечную жировую клетчатку. Размеры опухоли вариабельны, но не превышают 1 см. У 38% крыс помимо опухолей толстой кишки отмечалось формирование множественных изъязвлений слизистой оболочки дистального отдела пищевода. При микроскопическом исследовании в них выявлялись признаки лейкоплакии с папилломатозом и акантозом, а также дисплазии многослойного плоского неороговевающего эпителия. У 24% крыс эти изменения соответствовали внутриэпителиальному плоскоклеточному раку с очагами микроинвазии. Специфическая дифференцировка опухолевых клеток может быть выражена в различной степени. В настоящее время принята классификация по степени GRADE (ВОЗ 2000), основанная на способности опухоли образовывать тубулярные структуры (для аденокарцином): GRADE 1 — высокая (95% и более), GRADE 2 —средняя (50-94%), GRADE 3 — низкая (5-50%), GRADE 4 — недифференцированная (менее 5%). По степени клеточной дифференцировки на долю высокодифференцированных форм (GRADE 1) приходилось 64% от общего числа опухолей у крыс в 1-й опытной группе и лишь 44% опухолей — во 2-й группе. Умеренно дифференцированные аденокарциномы (GRADE 2) составляли в 1-й опытной группе 36%, во 2-й — 47%. Низкодифференцированные формы (включая солидную и слизистую аденокарциному) (GRADE 3) встречались только во 2-й опытной группе в 9% случаев (таблица). У крыс 1-й опытной группы метастатические очаги выявлялись в регионарных лимфатических узлах в 37% случаев, при этом печень оставалась незатронутой. Во 2-й группе регионарные метастазы в лимфатических узлах выявлялись уже у 58% крыс с отдаленными метастазами в печень в 17% случаев. В первичном опухолевом очаге наблюдалась умеренная дифференцировка клеток. Значения ангиогенеза в метастазах находятся в прямой зависимости от степени клеточной дифференцировки и увеличиваются прямо пропорционально росту анаплазии опухолевых клеток. Высокая интенсивность клеточной пролиферации Ki-67 у крыс 1-й опытной группы выявлена в 19% опухолей с GRADE 1 и в 59% — с GRADE 2 (рис. 2). Во 2-й опытной группе высокая пролиферация клеток отмечалась в 17% опухолей с GRADE 1, в 75% — с GRADE 2 (рис. 3) и в 100% — с GRADE 3. Экспрессия Bcl-2 в 1-й опытной группе отмечалась в 13% опухолей с высокой степенью дифференцировки и в 26% опухолей с умеренной дифференцировкой клеток. Во 2-й опытной группе позитивную реакцию давали 16% клеток высокодифференцированных опухолей, 33% клеток умеренно дифференцированных опухолей и 19% клеток опухолей с низкой степенью дифференцировки. Следует отметить, что позитивная реакция на Bcl-2 отмечалась не только в цитоплазме опухолевых клеток, но и в многочисленных клетках лимфоцитарной инфильтрации (таблица). В высокодифференцированных опухолях у крыс 1 -й опытной группы экспрессия белка-супрессора р53 выявлялась в 14%, в умеренно дифференцированных — в 33% (рис. 2). У крыс 2-й опытной группы гиперэкспрессия р53 выявлялся в 21% опухолей с GRADE 1, в 67% — с GRADE 2 (рис. 3) и в 100% — с GRADE 3 (таблица). Позитивная реакция с VEGF в 1-й опытной группе отмечалась в 12% опухолей с GRADE 1 и в 25% — с GRADE 2, причем в зоне инвазивного роста и на границе здоровых тканей экспрессия VEGF была выше, чем в других слоях опухоли. Опухоли у крыс 2-й опытной группы характеризовались достоверно более высокой экспрессией маркеров ангиогенеза. Реакция к VEGF выявлялась и в строме опухоли, и в опухолевых клетках. Позитивную реакцию давали 11% клеток в опухолях с GRADE 1 и 37% — с GRADE 2. В низкодифференцированных клетках реакция с VEGF была достоверно более интенсивная и составляла 58% (таблица). Таким образом, при изолированном введении канцерогена в толстой кишке формируются аденокарциномы с высокой и умеренной клеточной дифференцировкой. При введении канцерогена на фоне имеющегося иммунодефицитного состояния процент развития аденокарцином с GRADE 2 и GRADE 3 увеличивается в 1.5 раза (р<0.001). Кроме того, это проявляется более агрессивным морфологическим фенотипом опухолей и появлением отдаленных метастазов. В злокачественных опухолях с низкой клеточной дифференцировкой отмечается значимое увеличение экспрессии Ki-67, Bcl-2 и р53 (р<0.001), что, безусловно, является важным прогностическим фактором. Гиперэкспрессия белка р53 и высокий уровень Ki-67 имеют потенциально неблагоприятный прогноз, связанный с высоким риском развития рецидивов, низкой выживаемостью, а также наличием метастазов. Кроме того, животные, у которых выявляется коэкспрессия мутантного р53 и маркера апоптоза Вс1-2, имеют более агрессивные и метастазирующие опухоли. В наших предыдущих исследованиях было показано, что индуцирование опухоли толстой кишки сопровождается выраженной атрофией вилочковой железы с дезорганизацией эпителиальных клеток, структур нетимопоэтического окружения коркового и мозгового вещества, а также угнетением тимопоэза. В связи с развитием постспленэктомического гипоспленизма и значительным дисбалансом иммунной и эндокринной системы развивающаяся опухоль быстро ускользает от иммунного надзора за счет факторов иммунорезистентности (выделение растворимых опухолевых антигенов, приобретение устойчивости к апоптозу клеток за счет потери рецептора к ФИО, продукция в большом количестве ИЛ-6 и ИЛ-10), становится более агрессивной с развитием ранних отдаленных метастазов.

Авторы:

Стручко Г.Ю.
Меркулова Л.М.
Москвичев Е.В.
Кострова О.Ю.
Михайлова М.Н.

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.84-89. Библ. 13 назв.
Просмотров: 67

Рубрики
Ключевые слова
bcl-2
cd3+
ki-67
situ
абсолютный
автоматический
агрессивность
аденокарцинома
акантоз
активность
акты
аналоги
анаплазия
ангиогенез
анестезия
антиген
антигенный
антисептика
антитела
апоптоз
аппарат
архивирование
асептика
атрофия
аутопсия
базе
белковая
белые
биологический
благоприятный
болезнь
болеющие
большая
брюшные
быстрый
бытовые
вариабельность
введен
веса
вещество
взрослые
визуализация
вилочковая
включениями
влияние
внутрибрюшинный
внутриэпителиальные
вода
воздействие
восстановление
впервые
врачи
время
вскрытие
вторичные
второй
вывод
выделение
выживаемости
выполнение
высокий
гематоксилин
гиперэкспрессия
глубокая
гормонотерапия
государственная
граница
групп
дальний
данные
данных
дезорганизация
действие
диагноз
диагностика
дисбаланс
дисплазия
дистальная
дифференцированная
дифференцировки
доля
другого
дыхание
железы
желудка
желудочно-кишечного
желудочного
женщин
жестокое
живот
животного
животные
жизни
жиров
заболевания
зависимости
закон
закономерности
залива
заряженный
защита
здоровое
злокачественная
значению
значимость
зоны
зрения
изменение
измерение
изолированное
изучение
ил-10
ил6
иммунитет
иммунная
иммунобиохимическ
иммуногистохимическое
иммуногистохимия
иммунодефицит
иммунодефицитные
иммунология
иммунорезистентность
иммуносупрессия
иммунотерапия
инвазивная
инвазии
индуцирование
индуцированная
интактной
интенсивная
интенсивность
инфильтрация
использование
исследование
исследований
исследователя
канцерогенез
канцерогены
кишечная
кишка
кишки
классификация
клетка
клеток
клеточная
клетчатка
клиническая
ключ
кожи
количественная
количество
комнатные
контрольные
концентрация
корковая
корреляты
критерии
крыса
крысы
курсов
лабораторная
лабораторные
лейкоплакия
лет
лечебная
лечение
лимфатическая
лимфоцит
лимфоцитарного
линейная
линии
лицензия
локализации
маркер
массой
материал
медики
медицин
медицинская
мембранная
местная
место
метастаз
метастазирование
метастатические
метод
методика
микробы
микроскопическая
микроскопы
многослойный
множественная
модели
мозговая
молекулярная
молочной
моно
моноклональные
морфологическая
морфология
морфометрический
морфометрия
мужчин
мутантный
мутационных
надзор
наличия
направление
направленный
нарушение
нарушения
население
настоящие
неблагоприятные
недифференцированная
недостаточность
нейтральные
нелинейная
низкие
новообразование
новообразования
новые
облучение
ободочная
оболочка
обоснование
образ
образов
образование
обращение
общего
общей
одновременная
одного
окончания
окрашивание
онкогенные
онкологическая
онкология
операции
опухолевая
опухолей
опытные
органов
основа
основания
основной
особенности
особо
отдаленные
отдел
отношение
отрицательное
очага
ошибки
папилломатоз
пара
парафин
патогенез
патогенетическая
патоморфология
пациент
первичная
перевод
передозировка
переход
печень
пищеварение
пищевод
плоские
плоскоклеточная
площадь
подсчет
позитивные
показатели
пола
поликлональные
полост
поля
после
послед
постспленэктомический
потенциальный
потери
правила
практика
практическая
предопухолевый
признаки
приказы
применение
принцип
принятия
приобретение
причина
проблема
проведение
проводка
прогноз
прогностическая
программ
прогресс
прогрессирование
продукция
пролиферативная
пролиферация
пропорционально
простая
протоколы
проточная
процесс
проявления
прямая
р53
работа
развивающиеся
развитие
разделение
различный
размер
разработка
разрез
рак
рака
раннего
распространенность
раствор
растворимый
расчет
реакцией
ревизия
регионарная
результата
рекомендации
рецептор
рецидив
риск
роль
россии
российская
роста
своевременная
связанные
связей
селезенка
сердечн
серозная
систем
след
следствия
слизистая
слова
служб
случаев
смертности
снижение
снимки
события
солидные
соответствие
состав
состояние
сохраненная
спектр
специфическая
спленэктомия
способ
способности
среда
среднего
срезы
стандартные
статистика
статистические
стекла
стенка
степени
строма
структур
супрессоры
схема
счет
таблицы
температура
терапия
течения
тимопоэз
тип
тканевая
ткань
толстая
толстой
толщина
тракт
тракта
трансформация
тубулярный
увеличение
угнетение
удаление
узлы
умеренная
уровень
ускользания
условия
успехе
устойчивости
уход
фактор
федеральная
федерации
фенотип
фоновое
форм
формалинового
формирование
формы
функции
характер
характеристика
химиотерапия
цветная
цветов
цель
циркулярный
цитоплазма
цитоплазматическая
цифровые
частота
число
эксперимент
экспериментальная
экспериментальные
экспрессия
эндокринная
эндофитная
эозин
эпителиальные
эпителии
эфиры
эффективный
Ваш уровень доступа: Посетитель (IP-адрес: 18.97.14.86)
Яндекс.Метрика