ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ РЕЦЕПТОРОВ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ В КОЖЕ ЧЕЛОВЕКА

Аннотация:

Данные литературы позволяют предположить участие тиреоидных гормонов в возрастной регуляции функций фибробластов дермы. Поэтому целью нашей работы стало изучение содержания рецепторов тиреоидных гормонов в фибробластах дермы человека от эмбрионального развития до глубокой старости. В работе использовали кусочки кожи плодов человека, умерших до рождения от 20-й до 40-й недели беременности, и людей, умерших от различных причин в возрасте от рождения до 85 лет. Были изучены общее число фибробластов, доля фибробластов с положительной окраской на ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), экспрессия рецепторов тиреоидных гормонов-альфа и -бета- в фибробластах дермы. PCNA и рецепторы тиреоидных гормонов выявляли иммуногистохимически. Общее число фибробластов определяли в срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Максимальное содержание рецепторов тиреоидных гормонов-альфа и -бета было обнаружено в фибробластах дермы плодов на сроке 20-40 нед беременности. В возрастном интервале от рождения до 40 лет содержание рецепторов тиреоидных гормонов-альфа и бета- в фибробластах дермы снижалось. С 41 года до 85 лет количество обоих типов рецепторов тиреоидных гормонов оставалось примерно одинаковым. Общее число и доля РСЛ/Д-положительных фибробластов в дерме уменьшались возрастом, наиболее значительно — с антенатального периода до 40 лет. Корреляционный и дисперсионный анализы показали, что возрастное снижение числа фибробластов и их пролиферативной активности достоверно связано с уменьшением содержания рецепторов тиреоидных гормонов-альфа и бета-. Результаты позволяют предположить, что рецепторы тиреоидных гормонов участвуют в возрастном уменьшении численности и пролиферации фибробластов в дерме человека. Ключевые слова: кожа, старение, онтогенез, фибробласты, рецепторы тиреоидных гормонов, PCNA С возрастом в коже появляются признаки старения. Изучение этого процесса привело к открытию ряда механизмов возрастных изменений кожи. Клиническое проявление признаков старения зависит от состояния межклеточного вещества дермы. Коллагеновые и эластические волокна становятся фрагментированными и теряют их изначальную организацию. Состав и молекулярная масса протеогликанов дермы также изменяются с возрастом. Протеогликаны теряют свою изначальную массу, и в этом состоянии они не могут ассоциировать достаточное количество воды . Хорошо известно, что изменения во внеклеточном матриксе дермы обусловлены нарушениями функций фибробластов дермы, так как именно эти клетки ответственны за синтез и распад всех компонентов межклеточного вещества. Показано, что численность фибробластов в дерме существенно уменьшается с возрастом . . Следовательно, возможности регенерации дермы с возрастом снижаются. Однако механизмы, которые управляют физиологией фибробластов дермы на протяжении жизни, остаются неизвестными. Установлено, что тиреоидные гормоны оказывают сильное влияние на кожу. Клинические проявления у пациентов с заболеваниями щитовидной железы хорошо это подтверждают. У людей с гипотиреозом кожа сухая, холодная на ощупь, бледная и отечная. Рост волос замедлен, они легко выпадают и становятся редкими . Морфологически кожа у пациентов с гипотиреозом характеризуется накоплением жидкости и гликоз-аминогликанов, инфильтрирована лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками. Коллагеновые волокна дермы разделены жидкостью и большим количеством аморфного вещества соединительной ткани . У пациентов с гипертиреозом кожа влажная, теплая на ощупь, красноватая, утонченная и более пигментированная, имеет признаки шелушения. Люди с гипертиреозом очень часто страдают от истончения волос . Показано, что тиреоидные гормоны оказывают влияние на пролиферацию и дифференцировку клеток кожи у млекопитающих .Тиреоидные гормоны оказывают существенное воздействие на кожу даже у низших позвоночных. Известно, что у амфибий тиреоидные гормоны регулируют процесс метаморфоза, манифестацией которого является замена двухслойного эпителия кожи на многослойный. Таким образом, тиреоидные гормоны могут быть потенциально вовлечены в регуляцию функций фибробластов дермы на протяжении жизни. Тиреоидные гормоны реализуют свое действие посредством взаимодействия с рецепторами. В настоящее время известно два типа рецепторов тирео-идных гормонов — альфа и бета.Рецепторы тиреоидных гормонов обнаружены в структурах волосяных фолликулов, сальных железах, эпидермисе, потовых железах, фибробластах и кровеносных сосудах дермы .Однако данных о содержании рецепторов тиреоидных гормонов в фибробластах дермы в различные возрастные периоды нет в научной литературе. Поэтому целью нашей работы явилось изучение содержания рецепторов тиреоидных гормонов в фибробластах дермы человека от антенатального периода до глубокой старости. Материалы и методы Исследование проведено на аутопсийном материале кожи из нижней части передней поверхности шеи у плодов человека и людей, умерших от различных причин от 20 нед беременности и до 85 лет. В области забора кусочков кожи для исследования не было повреждений и патологических изменений. Исследование одобрено этическим комитетом медицинского факультета Чувашского государственного университета им. И. Н. Ульянова (протокол № 3/4 от 31.01.14). Кусочки кожи фиксировали в 4% формалине и заливали в парафин, затем изготавливали срезы толщиной 5—7 мкм. Для подсчета фибробластов в дерме нами были использованы препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, которые сначала фотографировали при ув. 40 помощью микроскопа «Olympus СХ-21» и цифровой камеры «Olympus Camedia 4040z». Затем фотографии загружали в программу Sigma Scan Pro 5.0 demo (Systat Software Inc., США), с помощью которой определяли площадь участков дермы и число в них фибробластов . Фибробласты идентифицировали по морфологии как клетки, имеющие вытянутое или веретенообразное ядро и малый объем цитоплазмы . Подсчитывали фибробласты, которые не были ассоциированы с кровеносными сосудами. В результате, вычисляли общее число фибробластов на 1 мм2 ткани. В каждом случае фотографировали как минимум 3—5 случайно выбранных полей зрения. Ядерный антиген пролиферирующих клеток (.PCNA), рецепторы тиреоидных гормонов-альфа и -бета выявляли непрямым иммуногистохимическим методом. Сначала препараты инкубировали в 0,1 % растворе пероксида водорода на дистиллированной воде в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазной активности. Затем проводили восстановление антигенов в 0,15 М трисбуфер-ном растворе (TBS) с рН 9 и 0,004% ЭДТА при 90 °С в течение 10 мин. Кроличьи поликло-нальные анти-РСЛМ антитела (АНР1419, AbD Serotec, Великобритания) в разведении 1:100, кроличьи поликлональные антитела против рецепторов тиреоидных гормонов-а (GTX15543, GeneTex, США) в разведении 1:50, кроличьи поликлональные антитела против рецепторов тиреоидных гормонов-(3 (GTX15545, GeneTex, США) в разведении 1:50 использовали в качестве первых антител. Все первые антитела разводили на TBS рН 7,2—7,6. Антикроличью EnVision + систему, конъюгированную с пероксидазой (К4002, Dako Cytomation, Дания), применяли в качестве вторых антител. Активность пероксидазы выявляли методом с пероксидом водорода и диаминобензидином (Sigma Chemical Co., St. Louis, США). Контрольные препараты проводили по всем этапам иммуногистохимии таким же образом, за исключением того, что вместо первых антител использовали нормальную кроличью сыворотку. В контроле ни разу не получали специфического окрашивания. Препараты с окраской на PCNA докрашивали гематоксилином. Для исключения возможных отличий в интенсивности окрашивания все срезы для выявления каждого антигена проводили по этапам иммуногистохимии одномоментно так, чтобы все препараты были инкубированы в абсолютно одинаковых TBS, растворах первых и вторых антител, растворе для выявления активности пероксидазы в течение абсолютно одинаковых времени и температуры.Для подсчета PCNA -положительных фибробластов препараты фотографировали, затем изображения загружали в программу Sigma Scan Pro 5.0 demo. Далее подсчитывали число PCNAпозитивных и PCNA -негативных фибробластов. После подсчетов рассчитывали долю PC Аппозитивных фибробластов . В каждом случае анализировали как минимум три случайно выбранных участка препарата. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на рецепторы тиреоидных гормонов определяли путем измерения оптической плотности (D) положительно окрашенных участков препарата. Процедуру фотометрии выполняли с применением программы Sigma Scan Pro 5.0 demo. Срезы фотографировали с использованием светового микроскопа «Olympus» при ув. 40, адаптера камеры «Olympus C3040-ADU» и фотокамеры «Olympus Camedia 4040z». В каждом случае фотографировали 3—5 случайно выбранных полей зрения. Фотографии загружали в программу Sigma Scan Pro 5.0 demo и определяли D путем измерения интенсивности окраски позитивно окрашенных клеточных ядер (F) и структур без окрашивания (F0). В каждом случае измеряли не менее 100 ядер. Оптическую плотность рассчитывали по формуле: D=\g(FQ/F). Величину D расценивали в качестве уровня экспрессии рецепторов . Результаты группировали по возрастному принципу: группа 1 — 20—40 нед беременности; группа 2 — 0—20 лет; группа 3 — 21—40 лет; группа 4 — 41—60 лет; группа 5 — 61—85 лет. Для исследования рецепторов тиреоидных гормонов использовали 127 кусочков кожи (группа 1 — 10 плодов мужского пола, 9 плодов женского пола; группа 2 — 16 мужчин, 12 женщин; группа 3: 22 мужчины, 9 женщин; группа 4 — 14 мужчин, 9 женщин; группа 5 — 10 мужчин, 16 женщин). Для исследования общего числа и доли PCNA-положительных фибробластов использовали 139 кусочков кожи (группа 1 — 15 плодов мужского пола, 10 плодов женского пола; группа 2 — 21 мужчина, 12 женщин; группа 3 — 16 мужчин, 24 женщины; группа 4 — 12 мужчин, 14 женщин; группа 5 — 8 мужчин, 7 женщин). По каждой группе данных рассчитывали средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (т). Достоверность влияния возраста, половой принадлежности на исследуемые параметры кожи оценивали с помощью дисперсионного анализа. Взаимосвязи возраста и параметров кожи оценивали с применением непараметрического рангового корреляционного анализа Спирмена. Корреляционный анализ выполняли без разделения данных на возрастные группы. Достоверными считали отличия при р<0,05. Результаты и обсуждение. Рецепторы тиреоидных гормонов-альфа были выявлены в фибробластах дермы во всех возрастных группах (рис. 1, 2). Однако интенсивность иммуногистохимического окрашивания на тиреоидные рецепторы-а отличалась в разных возрастных группах. У плодов на сроке 20—40 нед беременности (группа 1) интенсивность окрашивания ядер фибробластов на тиреоидные рецепторы-а была максимальной (см. рис. 1, 2). В возрастном диапазоне от рождения до 20 лет (группа 2) уровень экспрессии тиреоидных рецепторов-альфа в фибробластах дермы был меньше, чем в группе 1 (см. рис. 1, 2). В срезах кожи людей 21—40 лет (группа 3) интенсивность экспрессии рецепторов тиреоидных гормонов-а была на 30,66 % меньше, чем.в предыдущей группе (см. рис. 2). В возрастных интервалах 41—60 лет (группа 4) и 61 — 85 лет (группа 5) интенсивность окрашивания рецепторов тиреоидных гормонов-а была примерно такой же, как и в группе 3 (см. рис. 1, 2). Корреляционный анализ выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (г=—0,37, р<0,05) возраста и интенсивности экспрессии рецепторов тиреоидных гормонов-а в фибробластах дермы. Однофакторный дисперсионный анализ также показал достоверное влияние возраста на уменьшение содержания рецепторов тиреоидных гормонов-а в фибробластах дермы (р<0,001). Рецепторы тиреоидных гормонов-бета были также обнаружены в фибробластах дермы во всех возрастных группах (см. рис. 2, рис. 3). Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на рецепторы тиреоидных гормонов-Р имела отличия в разных возрастных периодах. Экспрессия рецепторов тиреоидных гормонов-бета в фибробластах дермы плодов на сроке 20—40 нед беременности была максимальной по сравнению с другими группами (см. рис. 2, 3). В группе людей в возрасте от рождения до 20 лет (группа 2) интенсивность окрашивания фибробластов дермы на рецепторы тиреоидных гормонов-бета была на 6,96% ниже, чем в группе 1 (см. рис. 2, 3). Экспрессия рецепторов тиреоидных гормонов-бета в фибробластах дермы людей в возрастном интервале 21—40 лет (группа 3) была меньше на 26,95 %,чем в предыдущей группе (см. рис. 2, 3). В группе 4 (41—60 лет) и в группе 5 (61—85 лет) интенсивность окрашивания фибробластов дермы на рецепторы тиреоидных гормонов-бета существенно не отличалась от данных группы 3 (21—40 лет) (см. рис. 2, 3). Корреляционный анализ выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (г=—0,31; р<0,05) возраста и интенсивности экспрессии рецепторов тиреоидных гормонов-бета в фибробластах дермы. Однофакторный дисперсионный анализ также показал достоверное влияние возраста на уменьшение содержания рецепторов тиреоидных гормонов-бета в фибробластах дермы (р< 0,001). Определение численности фибробластов в дерме показало возрастное уменьшение их популяции (рис. 4, 5). Наиболее выраженное уменьшение числа фибробластов происходило в возрастном интервале от 20 нед беременности до 20 лет (см. рис. 4, 5). Анализ срезов кожи с им-муногистохимической окраской на PCNA показал, что с возрастом доля PCNA-позитивных фибробластов в дерме существенно снижалась (см. рис. 4, 5). Так, в группе 1 (20—40 нед беременности) 39,96±2,29% (М+т) фибробластов дермы имели положительное окрашивание на PCNA. Доля PCNA-позитивных фибробластов в группе 2 (от рождения до 20 лет) была на 21,47% меньше, чем в группе 1. В группе 3 (21—40 лет) количество PCNA-позитивных фибробластов было на 23,69% меньше, чем в группе 2. В группе 4 (41—60 лет) количество PCNA-положительных фибробластов было почти таким же, как и в группе 3. В группе 5 (61—85 лет) было зафиксировано снижение численности PCNA-позитивных фибробластов на 27,19% по сравнению с группой 4. Корреляционный анализ выявил высокую отрицательную взаимосвязь (г=—0,62; р<0,05) возраста и изменений общего числа фибробластов в дерме. Однофакторный дисперсионный анализ также показал достоверное влияние возраста на уменьшение общей численности фибробластов в дерме (р<0,001). Корреляционный анализ показал высокую отрицательную достоверную взаимосвязь (г=—0,72; р<0,05) возраста и изменений числа PCNA -положительных фибробластов в дерме. Однофакторный дисперсионный анализ также показал достоверное влияние возраста на уменьшение численности PCNA-положительных фибробластов в дерме (р<0,001). В работе были использованы образцы кожи плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. В связи с этим была проведена проверка влияния половой принадлежности на изучаемые параметры дермы. Для этого был использован двухфакторный дисперсионный анализ, где в качестве одного из факторов была использована половая принадлежность, а в качестве другого — возраст. Проведенный анализ не выявил достоверного (р<0,05) влияния пола на возрастное изменение общей численности и доли PCNA - положительных фибробластов, экспрессии рецепторов тиреоидных гормонов-а и -(3. Результаты показали, что в фибробластах дермы присутствуют оба типа рецепторов тиреоидных гормонов во все исследованные возрастные интервалы. Другие исследователи также выявили оба типа тиреоидных рецепторов в фибробластах дермы.Однако наша работа установила, что уровень экспрессии рецепторов тиреоидных гормонов неодинаков в разные возрастные периоды жизни. Была выявлена сходная возрастная динамика содержания тиреоидных рецепторов-а и -(3. Максимальная численность обоих типов тиреоидных рецепторов была зафиксирована в антенатальном периоде (20—40 нед беременности). От рождения до 40 лет содержание тиреоидных рецепторов-а и -(3 начинало существенно снижаться, с 41 года численность рецепторов тиреоидных гормонов в фибробластах дермы оставалась постоянной до 85 лет. Экспрессия рецепторов в ткани зависит от баланса между их синтезом и деградацией. Поэтому можно предположить, что возрастное снижение содержания тиреоидных рецепторов в фибробластах дермы обусловлено или замедлением их синтеза, или ускоренным разрушением. Для установления точного механизма возрастного уменьшения количества тиреоидных рецепторов в фибробластах дермы необходимы дальнейшие исследования. Работа показала, что число фибробластов в дерме снижается с возрастом. Наиболее существенное возрастное уменьшение числа фибробластов наблюдали от антенатального периода до 40 лет. С 41 года до 85 лет происходило менее выраженное снижение количества фибробластов. Примерно то же самое наблюдали с изменением численности PCNA- позитивных фибробластов в дерме. Максимальное возрастное снижение доли PCNA -позитивных фибробластов в дерме происходит с антенатального периода до 40 лет. PCNA является дополнительным компонентом ДНК полимеразы-6, которая обеспечивает синтез и репарацию ДНК . PCNA присутствует в клетках, находящихся в G.-, 5-, С,- и М-периодах клеточного цикла . Другими словами, PCNA является маркером клеток, находящихся в клеточном цикле . Поэтому возрастное снижение доли PCNA-позитивных фибробластов в дерме показывает, что количество этих клеток, находящихся в клеточном цикле, снижается с возрастом. Следовательно, возрастное уменьшение общего числа фибробластов в дерме является следствием снижения их пролиферативной активности. Другие исследователи также обнаружили уменьшение численности фибробластов и их пролиферативной активности в дерме с возрастом . Такое уменьшение могло явиться и результатом активации процессов апоптоза . Кроме того, возрастное уменьшение популяции фибробластов в дерме может быть обусловлено снижением интенсивности их обновления и образования новых фибробластов из стволовых клеток . Это предположение подтверждают данные о возрастном уменьшении количества стволовых клеток в коже.Предыдущими исследованиями также было обнаружено, что у фибробластов с возрастом снижаются многие показатели, характеризующие их функциональную активность . Сравнение данных возрастной динамики численности и пролиферации фибробластов дермы с содержанием в них рецепторов тиреоидных гормонов показывает удивительное сходство. Корреляционный анализ демонстрирует наличие отрицательной достоверной взаимосвязи изменения уровня экспрессии тиреоидных рецепторов и исследованных параметров фибробластов. Эти данные позволяют предположить, что сигнализация тиреоидных гормонов может изменять пролиферативную активность фибробластов дермы. Наше предположение может быть подтверждено данными других исследователей, которые продемонстрировали угнетение пролиферации культивируемых фибробластов и кератиноцитов в условиях гипотиреоза. Замедление роста волос, уменьшение пролиферативной активности эпидермиса, наружного и внутреннего корневого влагалища волоса было отмечено у крыс после тиреоидэк-томии. У мышей с генетическим отсутствием рецепторов тиреоидных гормонов было выявлено уменьшение активности пролиферации эпидермиса, замедление роста волос, что было связано со сниженным уровнем циклина D1 и повышенной экспрессией антипролиферативных протеинов р19 и р27 .Эксперименты на мышах с нанесением на кожу трийодтиронина показали активацию пролиферации эпидермиса, наружного и внутреннего корневого влагалища волоса, ускорение роста и увеличение численности волос . Введение тиреоидных гормонов мышам приводило к увеличению содержания эпидермального фактора роста в коже . Таким образом, наши данные и результаты других исследователей показали, что тиреоидные гормоны оказывают активирующее действие на пролиферативные процессы в структурах кожи. Поэтому возможно, что возрастное уменьшение пролиферации фибробластов дермы может бьггь обусловлено уменьшением в них содержания тиреоидных рецепторов и нарушением транс-дукции сигнала тиреоидных гормонов. Однако для выяснения точных механизмов возрастного уменьшения численности фибробластов в дерме необходимо дальнейшее изучение этого вопроса. Выводы. Экспрессия рецепторов тиреоидных гормонов-альфа и -бета в фибробластах дермы человека снижается от антенатального периода до 40 лет. Возрастное снижение количества фибробластов в дерме и снижение активности их пролиферации достоверно коррелирует с уменьшением в них содержания рецепторов тиреоидных гормонов-параметры дермы. Для этого был использован двухфакторный дисперсионный анализ, где в качестве одного из факторов была использована половая принадлежность, а в качестве другого — возраст. Проведенный анализ не выявил достоверного (р<0,05) влияния пола на возрастное изменение общей численности и доли PCNA - положительных фибробластов, экспрессии рецепторов тиреоидных гормонов-альфа и бета, что позволяет предположить участие рецепторов тиреоидных гормонов в возрастном уменьшении численности и пролиферативной активности фибробластов дермы.

Авторы:

Издание: Успехи геронтологии
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 1.-С.82-90. Библ. 31 назв.
Просмотров: 155