ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛИЧЕСКОГО СЕРЕБРА НА СОСТАВ БЕЛКОВ МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС

Аннотация:

Изучено влияние наночастиц металлического серебра на протеом микросомальной фракции печени крыс при пероральном введении. Наноматериал с размером частиц в интервале 5-80 нм вводили ежедневно растущим крысам-самцам Вистар в течение 92 сут. Животные контрольной группы получали очищенную воду. Для контроля действия носителя крысам давали водный раствор стабилизатора поливинилпирролидона (ПВП). Белковый состав (протеом) микросомальной фракции печени изучали методом 2D-электрофореза с идентификацией вариабельных белковых пятен методом наноВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения. При действии наночастиц серебра в дозах 0.1,1 и 10 мг/кг массы тела в составе микросомальной фракции печени появлялось 8, 6 и 8 белков соответственно, отсутствовавших в контрольных группах, из числа которых с высокой степенью достоверности были идентифицированы субъединица 1 активаторного комплекса протеасомы (ген Psmel) и белок теплового шока HSP60 (ген Hspdl). Потребление наночастиц серебра приводило к исчезновению из микросомальной фракции белка бета2а цепи тубулина (ген Tubalb). Экспрессия каталазы, присутствовавшей в протеоме микросомальной фракции печени животных всех групп, была достоверно снижена при потреблении наночастиц серебра в дозах 0.1 и 10 мг/кг. Выявленные изменения в протеоме рассматриваются как проявления гепатотоксичности наночастиц серебра и могут быть в том числе связаны с антагонистическим влиянием серебра на статус эссенциального микроэлемента селена. Ключевые слова: наночасгпицы серебра, протеомика, белки теплового шока, протеасомы, токсичность. Наночастицы металлического серебра (НМС) в массовых масштабах производятся во всем мире и используются в широком ассортименте потребительской продукции. Производимое в мире количество НМС в 2011 г. составляло свыше 500 т в пересчете на серебро (Ад), а в 2015 г., возможно, уже превысило 1000 т (т.е. около 140 мг на каждого жителя Земли). НМС могут быть токсичными при пероральном поступлении. Это обусловлено биодоступностью Ад в форме НМС и их способностью высвобождать ионы одновалентного серебра (Ад+) — эффект "троянского коня". По данным, основным органом-мишенью НМС с диаметром частиц 5-80 нм при пероральном поступлении является печень, в которой отмечаются явления эозинофильного воспаления, жировой дистрофии гепатоцитов, изменения в активности ферментов I и II фаз детоксикации ксенобиотиков. У лабораторных животных, длительно потребляющих НМС в дозах свыше 1 мг/кг массы тела, наблюдается изменение гомеостаза ряда микроэлементов, в том числе резко снижаются показатели обеспеченности селеном. Вместе с тем молекулярные механизмы токсического действия НМС на ткань печени изучены недостаточно. Целью данной работы являлось изучение влияния длительного (3 мес) перорального введения НМС на состав экспрессируемых в печени крыс белков (протеом) с использованием в качестве биосубстрата микросомальной фракции печени (МФП). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использованы НМС в составе препарата "Арговит-С", производимого в России (ТУ 9310-03-79044259-12) в виде водного раствора с концентрацией 1.2% в пересчете на серебро, стабилизированного 19% поливинилпирролидоном (ПВП, разрешенная пищевая добавка Е1201). Ранее методами трансмиссионной электронной микроскопии и динамического рассеяния света установлено, что НМС в препарате отличаются высокой электронной плотностью, четкими контурами, преимущественно округлой формой и принадлежат к размерным фракциям с диаметрами 14.1 ±9.9 и 50.1+40.3 нм. Содержание частиц с диаметром >100 нм составляет менее 1.5% от общего числа частиц. Эксперимент проведен на аутбредных крысах-самцах Вистар с исходной массой 80+10 г, полученных из питомника филиала "Столбовая" (ФГБУН Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России). На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ1.2.2520-09. Рацион и воду, очищенную методом обратного осмоса, предоставляли в режиме свободного доступа. Животные 1 -й (контрольной) группы получали воду, 2-й группы (контроль носителя) — водный раствор ПВП в дозе 200 мг/кг массы тела, 3-5-й группы — НМС в дозах 0.1,1 и 10 мг/кг массы тела соответственно в пересчете на Ад. Животные 3-й и 4-й групп дополнительно получали ПВП в количестве, соответствующем его поступлению с препаратом НМС в 5-й группе. Таким образом, доза ПВП во всех опытных группах животных (со 2-й по 5-ю) не различалась, составляя 200 мг/кг массы тела. В течение первых 30 сут введение всех указанных препаратов осуществляли внутрижелудочно, а на протяжении последующих 62 сут — в виде добавки к корму. Животных выводили из эксперимента на 93-е сутки путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией. Печень отбирали у 6 животных из каждой группы немедленно после обескровливания, ткань разрезали на кусочки менее 1 см в диаметре, трижды промывали изотоническим 0.1 М трис-HCI буфером рН 7.4, охлажденным до 0-2°С, гомогенизировали в указанном буфере в соотношении 1:4 по массе в гомогенизаторе Поттера, охлаждаемом льдом, после чего выделяли МФП методом дифференциального центрифугирования на ультрацентрифуге "Beckman L7-65" ("Beckman"). МФП хранили до анализа при -70°С. Протеом МФП изучали с помощью системы для проведения 2D-электрофореза ("Bio-Rad") по методике производителя с последующей масс-спектрометрической идентификацией. Первое направление (изоэлектрофокусирование) осуществляли на стрипах с предустановленным градиентом рН 3-10 ("Bio-Rad"). Во втором направлении разделение осуществляли в пластинах из 12% ПААГ в присутствии 1% додецилсульфата натрия. Белковые пятна в гелях окрашивали азотнокислым серебром в соответствии с MP 1.2.0053-11. Изображения гелей получали с помощью денситометра GS-800 ("Bio-Rad"). Обработку изображений гелей проводили в программе "PDQuest". Молекулярные массы и изоэлектрические точки белков определяли по положению их пятен на геле с погрешностью ±20%. По результатам сравнения 30 гелей был составлен мастер-гель, на который наносили только те белковые пятна, которые выявлялись минимум на 3 электрофореграммах, принадлежащих хотя бы к одной из 5 групп. Каждому пятну, нанесенному на мастер-гель, присваивали идентификационный номер (ID). Величину оптической плотности (OD) каждого белкового пятна нормировали на величину суммы OD всех пятен данного геля. Гидролиз белков в геле проводили по методике. Анализ трипсиновых гидролизатов экстрагированных из пятен конститутивных и вариабельных белков проводили методом ВЭЖХ наномиллилитровых потоков, сопряженной с тандемным масс-спектрометром высокого разрешения. Белки идентифицировали по масс-спектрам их протеолитических пептидов в программе "Mascot v.2.5" ("Matrix Science"). Для поиска использовали базу данных "SwissProt" (версия 2013-04 — 539 829 последовательностей; 191 670 831 остатков) в сочетании с базой данных "Contaminants". В качестве допустимых модификаций аминокислотных остатков указывали одинарное и двойное окисление метионина и модификацию цистеина йодоацетамидом. Значение допуска на расхождение между теоретической и экспериментальной массой пептидов устанавливали равным 0.05 Д, допуска на расхождение между теоретической и экспериментальной массой дочерних ионов — 0.05 Д. При проведении идентификации допускалось не более двух пропущенных сайтов гидролиза на пептид и не более двух атомов углерода-13. Для увеличения достоверности идентификации белков каждый образец подвергали хромато-масс-спектрометрическому анализу в 3 повторах, записи о белках, не воспроизводившихся в каждом повторе, исключали. Обработку данных автоматизировали с помощью встроенной среды программирования "Visual Basic for Applications". Статистическую обработку данных нормализованных OD белковых пятен проводили путем расчета выборочного среднего, стандартной ошибки, достоверности различия согласно t критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Манна—Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Было проанализировано 30 образцов МФП, по 6 гелей в каждой группе крыс; на мастер-гель было нанесено в общей сложности 294 белковых пятна (рис. 1). Из общего числа нанесенных на мастер-гель пятен в 1-й группе как минимум на 3 гелях присутствовало 115 пятен, во 2-й — 178, в 3-й — 189, в 4-й — 157, в 5-й — 177 пятен. Сравнение с гелями 1-й группы показало, что в 3-й группе (НМС 0.1 мг/кг) минимум на 3 гелях появилось 8 белков, полностью отсутствовавших в 1-й группе, в 4-й — 6, в 5-й — 8 (при этом не были учтены пятна, отсутствовавшие в 1-й группе, но появившиеся во 2-й под действием ПВП; число таких пятен составило 11). Из белков, полностью отсутствовавших во 2-й группе, на гелях в 3-й группе было представлено 9 белков, в 4-й — 2, в 5-й — 7 белков. Из числа пятен, представленных как минимум на 3 гелях в 1 -й группе, полностью исчезло по одному пятну в 3-й и 5-й группе и 3 пятна в 4-й группе. Число таких пятен во 2-й группе составило 0,2 и 3 соответственно. При этом пятно с ID 9004, представленное в 1 -й группе, исчезало в 3,4 и 5-й группах независимо от дозы НМС. Большинство вариабельных белков имели низкую величину нормированной OD их пятен (менее 0.1 усл. ед.), что затрудняло их идентификацию. Из представленных на мастер-геле для масс-спектрометрического анализа были отобраны пятна ID 2807,4704,7711, присутствующие в значимых количествах на гелях 3, 4 и 5-й групп и полностью отсутствовавшие на гелях 1-й и 2-й групп; пятна ID 7208, 2602, 7311, 4601, экспрессия которых полностью отсутствовала в 1 -й группе и значительно возрастала в 3, 4 и 5-й группах по сравнению со 2-й группой; пятно ID 9004, полностью исчезавшее в 3,4 и 5-й группах, и пятна высококопийных белков ID 8001, 7103 и 8603, экспрессия которых отмечалась во всех группах. Идентифицированные белки ранжированы по величине Score, характеризующей надежность (воспроизводимость) их масс-спектральной идентификации, и показателя emPAl, дающего количественную оценку доли полипептидной последовательности белка, перекрываемого выявленными на масс-спектрограммах пептидами. С высокой степенью достоверности был идентифицирован белок ID 7208 как фрагмент 60-кД белка теплового шока HSP60 или шаперонина (ген Hspdl) (табл. 1, рис. 2). Наибольшая степень экспрессии этого белка (выявлен на 4 из 6 гелей) характерна для 5-й группы (НМС 10 мг/кг). Высокодостоверной является также идентификация белкового пятна ID 2807 как субъединицы 1 активаторного комплекса протеасомы (ген Psmel), которая встречается только на гелях от животных, получавших НМС, причем с наибольшей частотой (4/6) в 5 группе. Конститутивный (выявленный на гелях из всех групп) высококопийный белок ID 8603 был идентифицирован как катапаза (ген Cat). При этом оптическая плотность этого пятна снижается с увеличением дозы серебра (табл. 2) — в 5-й группе достоверно (р<0.05) по сравнению со 2-й группой. Белковое пятно ID 9004, полностью исчезающее во всех опытных группах, было идентифицировано как фрагмент бета2а цепи тубулина цитоскелета (ген Tuba 1b). Белок, соответствующий пятну ID 4704, был выявлен только на гелях опытных групп; он был идентифицирован как субъединица бета митохондриальной АТФ-синтазы (ген АТР5Ь). Конститутивное пятно ID 8001 принадлежало высококопийному белку, предположительно (Score=132) отождествленному с субъединицей а протеасомы (ген Psma6). Уровень экспрессии этого белка количественно не различался во всех группах (табл. 2). Это же относится к белковому пятну ID 7103, предположительно идентифицированному как конститутивно экспрессируемый фермент гликолиза глицерапьдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ген Gapdh). С низкой степенью достоверности (Scored 00) были идентифицированы белковые пятна ID 7311, 4601,7711 и 2602 в качестве альтернативного фрагмента HSP60, переходной АТФазы эндоплазматического ретикулума (ген Vcp), импортина (ген Кпраб) и протеин-дисульфид изомеразы (ген P4hb) соответственно (табл. 1). Следует отметить, однако, что экспрессия всех этих белков повышалась в опытных группах, причем для пятна ID 4601 достоверно в 3-й группе, судя по величине его нормированной OD (табл. 2). Таким образом, НМС серебра оказывают, по-видимому, определенное влияние на протеом МФП крыс, состоящее как в исчезновении, так и в появлении ряда белковых пятен. Часть этих эффектов в наибольшей степени наблюдается при минимальной дозе серебра (3-я группа), другие характерны главным образом для высоких доз НМС (4-я и 5-я группы). Отсутствие четкой зависимости доза— эффект для НМС, как и для ряда других изученных нанообъектов, предположительно связано с эффектами их агрегации при высоких дозах. Часть выявленных нами эффектов (белков ID 7208,7311, 4601 и 2602 на отдельных гелях 2-й группы) может быть соотнесена с действием носителя ПВП, что ставит под сомнение распространенное мнение о биологической инертности данного синтетического полимера. Однако исследование ПВП не входило в задачи данной работы, и для определения его эффектов могут потребоваться дополнительные исследования. Наиболее выраженным воздействием НМС на протеом печени крыс является экспрессия белка субъединицы 1 активаторного комплекса протеосомы (Psmel). Экспрессия этого фактора повышается при оксидантном стрессе, он участвует в механизме аутоиммунного повреждения р-клеток поджелудочной железы, а также маркирует резистентность некоторых видов опухолевых клеток к химиотерапии. Полученные нами данные указывают на роль протеасомной деградации белков как звена нарушений, развивающихся в клетках печени поддейсгвием накапливающихся в них НМС. Повышение содержания HSP60 (шаперонина) в МФП наблюдалось при наибольшей дозе НМС — 10 мг/кг. В норме данный белок локализован преимущественно в митохондриях, однако в условиях различных видов стресса возможен его выход во фракцию эндоплазматических мембран. Одной из особенностей HSP60 является его тесная связь со статусом селена в организме. Так, показана гиперэкспрессия этого белка при потреблении дефицитного по селену рациона, а также при нарушении статуса этого микроэлемента, вызванного интоксикацией свинцом. В нашем исследовании повышенный уровень HSP60 в МФП крыс 5-й группы, очевидно, коррелирует с ранее выявленным у них глубоким нарушением селенового статуса, вызванного микроэлементным антагонизмом серебра и селена. Установленное у получавших НМС крыс снижение экспрессии в печени белка ID 9004, идентифицированного со значительной долей вероятности как фрагмент бета2а цепи тубулина, может свидетельствовать о нарушении в этих условиях функции микротрубочек цитоскелета, что коррелирует с морфологическими нарушениями в гепатоцитах этих животных, выявленными ранее. Каталаза (ID 8603) — конститутивный белок, экспрессировавшийся в МФП животных всех групп, за исключением одной крысы из 5-й группы. Однако количественная мера продукции этого белка, оцененная по величине нормализованной OD его пятна (табл. 2), снижалась под влиянием НМС, причем наиболее заметно — в максимальной дозе. Известно, что снижение уровня каталазы является маркером гепатотоксического действия кадмия, ряда химических веществ и фармакологических препаратов в сочетании с этанолом. Полученные нами данные показывают, что это же может относиться к эффектам гепатотоксичности высоких доз серебра в форме наночастиц. Таким образом, протеомное исследование МФП крыс, получавших НМС в течение 92 сут, позволило выявить ряд новых протеомных эффектов гепатотоксического действия данного наноматериала, в первую очередь повышенную экспрессию субъединицы 1 протеасомного активаторного комплекса и HSP60, а также снижение уровня бета2а цепи тубулина и катапазы. Выявленные изменения коррелируют с наблюдаемой морфологической и биохимической картиной действия наночастиц серебра у этих животных и согласуются с данными о том, что печень является одной из основных мишеней токсического действия НМС при их многократном пероральном поступлении. Масс-спектрометрические данные были получены в ИБМХ на оборудовании ЦКП "Протеом человека" (Министерство образования и науки России).

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.90-95. Библ. 15 назв.
Просмотров: 76