ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

Аннотация:

Исследовали концентрацию внеклеточной ДНК и ее фракций в динамике неосложненной беременности. Были обследованы 30 женщин с одноплодной беременностью. Концентрация внеклеточной общей ДНК, ДНК матери и фетальной ДНК в крови определяли в промежутках 11-14, 24-26 и 30-32 нед беременности. Уровень общей ДНК оценивали количественным ПЦР-анализом по определению концентрации гена RASSF1A, уровень фетальной ДНК — по определению гиперметилированной части гена RASSF1A. Концентрация внеклеточной общей ДНК и ДНК матери не менялась в первой половине беременности, однако увеличивалась после 24-26 нед. Уровень фетальной ДНК увеличивался от I ко II и III триместру беременности соответственно: 14.15 (2.32-36.25), 24.87 (6.29-129.32) и 32.62 (8.97-133.52) ГЕ/мл (р<0.05). Полученные данные характеризуют динамику изменения уровня внеклеточной ДНК и ее фракций в течение беременности, что необходимо учитывать при прогнозировании ее плацентоассоциированных осложнений. Ключевые слова: внеклеточная общая ДНК, внеклеточная ДНК матери, внеклеточная фетальная ДНК, RASSF1A ген, дисфункция плаценты. Представление о непроницаемости плацентарного барьера для большинства белков и химических соединений было опровергнуто в последние годы. Обнаружение в материнской крови клеток плода стало важным событием в пренатальной диагностике. Так, было показано наличие внеклеточной фетальной ДНК (фДНК) в материнской крови. В настоящее время определение фДНК активно используется в неинвазивной пренатальной диагностике анеуплоидий плода, определении RhD принадлежности и заболеваний,сцепленных с полом плода. По данным ряда исследований, фДНК в материнской крови обнаруживали при анэмбрионии, на ранних сроках беременности до установления фетоплацентарного кровообращения, что свидетельствует о ее плацентарном происхождении. В формировании и функционировании фетоплацентарного комплекса важная роль отводится взаимодействию факторов роста и запрограммированной клеточной гибели, следовательно, уровень фДНК отражает нормальное развитие плаценты и изменения при патологическом процессе. Дисфункция плаценты характеризуется повышенным апоптозом клеток трофобласта, что может приводить к увеличению концентрации фДНК в материнской крови. Однако для использования фДНКдля прогнозирования и диагностики осложнений беременности, ассоциированных с плацентарной дисфункцией, необходимо изучение ее концентрации в динамике неосложненной беременности. При этом следует учитывать, что внеклеточная ДНК в материнской крови состоит из двух фракций — фДНК и материнской ДНК (мДНК). В настоящее время данные об изменении концентрации фДНК в динамике беременности противоречивы, что определяет необходимость дальнейших исследований для выявления факторов, влияющих на ее концентрацию. Цель данной работы — изучить концентрацию внеклеточной ДНК и ее фракций в материнской крови в динамике неосложненной беременности. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследование проводили в ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России с 15 января 2016 г. по 15 апреля 2017 г. Перед забором биологического материала все женщины подписали информированное согласие на участие в клиническом исследовании. Было обследовано 30 здоровых женщин с одноплодной беременностью. Все беременные имели неотягощенный соматический и акушерско-гинекологический анамнез. Критериями исключения являлись такие осложнения беременности, как преэклампсия, преждевременные роды, задержка роста плода, гестационная артериальная гипертензия, гестационный сахарный диабет, хромосомные аномалии и пороки развития плода и плаценты, аномалии прикрепления и расположения плаценты, острая фаза и обострение хронических инфекционных заболеваний. С учетом критериев исключения в исследование вошли 22 женщины. Венозную кровь брали трижды в течение беременности: в промежутках 11-14,24-26 и 30-32 нед. Исследование одобрено комитетом по этике ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России. Периферическую кровь (по 5 мл на каждый срок исследования) собирали в вакуумные пробирки с ЭДТА и обрабатывали в течение 1 ч после забора. Плазму крови выделяли центрифугированием при 4°С в два этапа: первый этап — 10 мин, 200д, второй этап — 10 мин, 4500д. Образцы плазмы хранили при -80°С. Уровень общей ДНК (оДНК) оценивали с помощью количественного ПЦР-анализа путем определения концентрации гена RASSF1A. Оценка уровня фДНК основана на данных о том, что в клетках плаценты ген RASSF1A гиперметилирован, следовательно, концентрация его гиперметилированной части в крови матери будет соответствовать количеству геномных единиц фДНК. Методика выделения оДНК и фДНК описана нами в работе, однако в данном исследовании концентрацию ДНК-стандартов определяли с помощью флюориметра "Qubit 3.0". Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе "SPSS Statistics 20.0". Для оценки различий количественных переменных в двух зависимых группах использовали тест Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при р<0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Средний возраст женщин на момент родов составил 30.14±4.07 года. Большинство женщин имело нормальный исходный индекс массы тела, который в среднем составлял 20.70±2.29 кг/м2. В половине наблюдений женщины были первородящими (11 пациенток). Все пациентки родоразрешены в доношенном сроке беременности. Роды произошли через естественные родовые пути у 16(72.73%) женщин, путем операции кесарева сечения — у 6(27.27%). В 10(45%) наблюдениях пол новорожденного мужской, в 12(54.55%)—женский. Оценка состояния новорожденного по шкале Апгар на 1-й и 5-й минуте после родов составила в среднем 8.05±0.21 и 8.95±0.21 баллов соответственно. Масса тела детей при рождении соответствовала гестационному сроку и составила от 2855 до 3902 г (в среднем 3379.23±308.39 г). Концентрация оДНК в 11-14 и 24-26 нед не различалась (медиана 208.11 (52.62-1116.82) и 298.68 (58.20-1370.06) ГЕ/мл соответственно), затем отмечалось увеличение к 30-32 нед (медиана 424.79 (67.05-1594.66) ГЕ/мл; р=0.039) (рис. 1). Уровень мДНК оставался относительно стабильным до 24-26 нед (медиана 201.80 (47.80-1113.34) и 275.73 (48.46-1240.74) ГЕ/мл в 11-14 и 24-26 нед соответственно) с последующим увеличением к 30-32-й неделям беременности (медиана 398.56 (45.57-1461.15) ГЕ/мл; р<0.05) (рис. 1). В 11-14 нед беременности концентрация фДНК определялась во всех наблюдениях: медиана 14.15 (2.32-36.25) ГЕ/мл. К 24-26-й неделям отмечалось повышение уровня фДНК до 24.87 (6.29-129.32) ГЕ/мл (р=0.002), к 30-32-й — до 32.62 (8.97-133.52) ГЕ/мл (р=0.005) (рис. 2). Концентрация фДНК отражает патофизиологические изменения, сопровождающие плацентарную дисфункцию. В связи с этим в течение нескольких лет изучается роль внеклеточной фДНК в материнской крови в качестве маркера плацентоассоциированных осложнений беременности. Однако нет единого мнения о характере изменений концентрации фДНК. Имеются данные о прогностической значимости как высокой концентрации фДНК (более 90%), так и низкой (менее 5%). Таким образом, актуальным является определение диапазона нормативных значений фДНК с учетом физиологических изменений в организме беременной. Проанализировав концентрацию внеклеточной оДНК в динамике, мы не обнаружили существенных различий в первой половине беременности, что коррелирует с данными других исследователей. Однако после 24-26 нед беременности уровень оДНК значимо повышался, что связано с увеличением концентрации как мДНК, так и фДНК. В доступной литературе мы обнаружили всего одно исследование, в котором мДНК была проанализирована отдельно от оДНК. Также было показано, что концентрация мДНК увеличивалась со сроком беременности. В настоящее время известно несколько патофизиологических механизмов, в результате которых в крови появляется внеклеточная ДИК: высвобождение из неповрежденных клеток или в результате их некроза, апоптоза, поступление в кровоток по завершении дифференцировки эритробластов, в процессе созревания тромбоцитов и эритроцитов. По данным литературы, при неосложненном течении беременности к III триместру происходит повышение уровня АФК в материнской крови, приводящее к усилению иммунного воспалительного ответа с увеличением количества клеток крови, что определяет увеличение уровня внеклеточной мДНК. В то же время нами не было выявлено достоверного изменения концентрации оДНК и мДНК в динамике беременности. Различия полученных результатов обусловлены наличием анемии беременных у половины женщин, что являлось критерием исключения в данном исследовании. Также мы применяли другую методику определения ДНК-стандартов. В настоящее время проведено небольшое количество исследований, в которых концентрация фДНК определялась в динамике беременности. При этом методы определения фДНК в материнской крови существенно различались. В большинстве работ в качестве маркеров определения клеток плода были использованы SRY и DYS-14 локусы Y-хромосомы. Другим маркером фДНК является ген RHD в крови RhD-отрицательных женщин с RhD-положительным плодом. Однако данные методы определения фДНК ограничивали выборку по полу плода и резус-принадлежности матери и плода. Нами использован универсальный метод обнаружения фДНК путем определения гиперметилированной части гена RASSF1A, который был впервые предложен в работе. Мы обнаружили значимое увеличение медианы концентрации фДНК с 11-14 до 24-26 нед беременности и в 30-32 нед. В работе также было выявлено значимое повышение уровня фДНК в динамике беременности. При этом отмечен 2-кратный прирост фДНК во II триместре и 9-кратный — в III триместре по сравнению с I триместром (р<0.001). В работе, напротив, не было обнаружено значимого увеличения фДНК в первой половине беременности путем определения гиперметилированной части гена RASSF1A, что совпадает с данными исследований. Исследование апоптоза плаценты в течение не-осложненной беременности показало, что апоптоз плаценты наблюдается с ранних сроков и прогрессирует со сроком гестации (р<0.01). Таким образом, выявленная нами динамика концентрации фДНК отражает степень выраженности апоптотических изменений плаценты в течение беременности. Концентрация внеклеточной оДНК увеличивается в течение неосложненной беременности в соответствии с изменением ее фракций. Концентрация фДНК увеличивается с I триместра беременности, тогда как мДНК — во второй ее половине, что необходимо учитывать при прогнозировании плацентоассоциированных осложнений беременности.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.103-106. Библ. 15 назв.
Просмотров: 67