БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ИНБРЕДНЫХ/АУТБРЕДНЫХ ЛИНИЙ И ТЕТРАГИБРИДА DBCB МЫШЕЙ В ВЫСОКОСАХАРОЗНОЙ IN VIVO МОДЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА

Аннотация:

Изучены реакции интегральных, биохимических, морфологических и витаминных показателей и обеспеченность жирорастворимыми витаминами у самок-мышей инбредной линии DBA/2J, аутбредной линии ICR-1 (CD-I), а также тетрагибрида DBCB на in vivo модели метаболического синдрома (потребление с рационом 30% раствора сахарозы в течение 2 сут). В отличие от инбредной и аутбредной линий, мыши-тетрагибриды DBCB характеризовались развитием абдоминального ожирения, гиперхолестеринемии и выраженной морфологической картиной жировой дистрофии печени. У этих животных усиливался также сопряженный с липидами транспорт в печень витамина Е, приводящий к компенсации его содержания в органе в условиях уменьшения поступления с высокосахарозным рационом. Выявленные межлинейные различия могут быть связаны с генетическими особенностями двух исследованных линий мышей и тетрагибрида DBCB и требуют дальнейших геномных, транкриптомных, протеомных и морфологических исследований. Полученные на in vivo модели метаболического синдрома результаты позволяют установить ключевые биомаркеры для комплексной диагностики и прогнозирования такого осложнения метаболического синдрома, как неалкогольный стеатоз печени. Ключевые слова: метаболический синдром, мыши, in vivo модели, тетрагибриды, сахароза. Потребность в доклинических испытаниях новых методов диетической и медикаментозной коррекции метаболического синдрома (МС), вызванного потреблением высокоуглеводной пищи и характеризующегося ожирением, дислипидемией, гипергликемией и повышенным АД, требует адекватных in vivo моделей лабораторных животных. Одним из подходящих видов животных для воспроизведения таких моделей является лабораторная домовая мышь (Mus domesticus), которая характеризуется относительно малой продолжительностью жизни, большой интенсивностью обменных процессов, высокой степенью изученности генома, наличием значительного числа инбредных/аутбредных и нокаутных линий, по-разному реагирующих на диетические воздействия. Целью данной работы как части программы разработки in vivo модели МС являлось изучение реакции интегральных, биохимических, морфологических и витаминных показателей у мышей инбредной линии DBA/2J, аутбредной линии ICR-1 (CD-1), а также тетрагибрида DBCB на потребление рациона с повышенной квотой легкоусвояемого углевода (30% раствора сахарозы). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали самок мышей (возраст 8-10 нед) аутбредной линии ICR-1 (CD1), инбредной линии DBA/2J и тетрагибрида DBCB (сложного гибрида 2-го поколения), полученных путем скрещивания 4 различных инбредных линий мышей (DBA/2J, BALB/c, С В A/Lac и C57BI/6J), поступивших из питомника "Столбовая". Для получения F1 самок DBA/2J скрещивали с самцами BALB/c (1-й гибрид F1), а самок CBA/Lac с самцами C57BI/6J (2-й гибрид F1). Для получения тетрагибридов особей из обоих гибридов F1 скрещивали между собой. Животные из каждой линии и тетрагибрид были разделены на две группы по 8 особей в каждой. Средняя масса тела в сформированных группах изначально достоверно не различалась в пределах каждой линии (р>0.1; ANOVA). Животные контрольных групп получали сбалансированный полусинтетический рацион по AIN93M с некоторыми модификациями, из расчета 4 г сухого корма на одно животное в сутки и очищенную обратным осмосом питьевую воду, а животные опытных групп—такой же рацион и 30% раствор сахарозы вместо воды в режиме свободного доступа. Животных содержали группами по 4 особи в клетке при 21±1°С и режиме освещения 12/12 ч. Работу с животными выполняли в соответствии с руководством и Приказом Минздрава РФ № 193н от 01.04.2016 г. "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Общая продолжительность кормления рационами составила 62 сут. В течение всего эксперимента ежедневно определяли количество съеденного корма и выпитой жидкости, еженедельно — массу тела животных с точностью ±0.1 г, наблюдали за внешним видом, активностью, состоянием шерстяного покрова, особенностями поведения. Кровь брали на 63-и сутки при декапитации под эфирной анестезией в мерные пробирки с 0.03 см31% гепарина, индивидуально фиксируя разведение каждой пробы. Отбор органов осуществляли стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали. Массу органов и тканей (печень, селезенка, сердце, почки, тимус, легкие, головной мозг и забрю-шинный жир) определяли на лабораторных весах с точностью ±0.01 г. Сразу после отбора печень охлаждали на льду до 0-2°С, отбирали кусочки ткани правой боковой доли для морфологического исследования и фиксировали их в 3.7% растворе формальдегида в 0.1 М натрий-фосфатном буфере рН 7.00±0.05 в течение не менее 3 сут, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации, пропитывали ксилолом, заливали гомогенизированной парафиновой средой "Histomix" на автоматизированной станции заливки блоков. Парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм готовили на санном микротоме "Microm HM355s" ("Leica") и окрашивали гематоксилином и эозином. Микропрепараты исследовали при увеличении 630. Биохимические показатели плазмы крови (содержание глюкозы, триглицеридов, холестерина, ЛПВП) определяли на биохимическом анализаторе "Konelab 20i" по стандартным методикам. Содержание витаминов А (ретинола и пальмитата ретинола) и Е (альфа-токоферола) в гомогенате печени определяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием параметрических критериев ANOVA, двухстороннего t критерия Стьюдента для несвязанных показателей с поправкой Levine на неравенство выборочных дисперсий, непараметрического критерия Манна—Уитни при уровне значимости р<0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. На протяжении всего эксперимента потребление 30% раствора сахарозы вместо питьевой воды привело к снижению поедаемости основного рациона мышами двух линий и тетрагибрида. При этом, несмотря на колебания общей фактически потребленной калорийности (с основным рационом и раствором сахарозы) по дням опыта, рационы, потребляемые мышами инбредной линии DBA/2J и тетрагибрида DBCB, оставались в среднем изокалорийными рационам животных контрольных групп (р>0.05, t критерий). Однако у аутбредных мышей ICR-1 опытной группы потребление основного рациона снижалось настолько сильно, что общая потребляемая калорийность была систематически снижена по сравнению с контрольной группой на 20-25% (р<0.05). Доля потребленной сахарозы в общем потреблении углеводов и относительная доля углеводов в общей калорийности рациона в опытных группах мало различалась у мышей ICR-1 и тетрагибрида DBCB и была систематически и достоверно (р<0.05) снижена по сравнению с данными показателями у мышей DBA/2J. При этом тетрагибриды DBCD опытной группы достоверно быстрее прибавляли в массе на протяжении второй половины эксперимента (начиная с 21-х суток различие было статистически достоверным), тогда как мыши DBA/2J — только в коротком интервале 36-48 сут, а прибавка массы в обеих группах мышей ICR-1 не имела статистически достоверных различий на протяжении всего эксперимента. Избыточное потребление сахарозы приводило к достоверному (р<0.05) повышению у гибридов DBCB массы печени (с 3.31±0.11% в контроле до 4.39±0.24% в опыте) и забрюшинного жира (с 7.39±1.14 до 10.25±0.65% от массы тела) (рис. 1). У других исследованных линий мышей достоверных различий в относительной массе внутренних органов и тканей выявлено не было. Морфологическое исследование правой боковой доли печени (рис. 2) показало, что у мышей ICR-1 и DBCB даже при потреблении контрольного рациона к возрасту выведения из эксперимента (4-4.5 мес жизни) наблюдалась аномальная структура ткани с заметным внутриклеточным накоплением жира в отдельных гепатоцитах. У потреблявших сахарозу мышей DBA/2J и особенно ICR-1 наблюдалось накопление диффузных жировых включений в большинстве гепатоцитов, часто с оттеснением ими ядра на периферию клетки. Вместе с тем картина накопления жира в печени тетрагибридов DBCB, получавших 30% сахарозу, была качественно иной: появлялись очень крупные сферические клетки — видоизмененные гепатоциты, выглядящие как отдельные округлые жировые вакуоли, наряду со значительным количеством морфологически нормальных гепатоцитов. Во всех группах мышей, получавших сахарозу, возрастал уровень гликемии (рис. 1, а), причем наиболее выраженным и достоверным этот эффект был у мышей DBA/2J и ICR-1. Гибриды DBCB, напротив, характеризовались достоверным повышением уровня ЛПВП и общего холестерина плазмы крови, который у них был также достоверно повышен по сравнению с животными двух других линий как на стандартном рационе, так и при потреблении сахарозы. Значительных изменений уровня триглицеридов плазмы крови в данной серии опытов не было выявлено ни у одной из двух линий мышей и тетрагибрида. У всех исследуемых линий мышей и тетрагибрида потребление сахарозы практически в равной степени приводило к достоверному (р<0.05) уменьшению концентрации ретинола пальмитата в ткани печени (рис. 3), что согласуется со снижением в этих группах потребления данного витамина. Однако при оценке содержание витамина Е оказалось, что аналогичный эффект наблюдался только у мышей ICR-1, тогда как у мышей DBCB и DBA/2J значительное снижение потребления данного витамина с высокосахарозным рационом не сопровождалось уменьшением его запасов в печени. При этом, как следует из полученных данных, у мышей ICR-1 на стандартном рационе наблюдался более высокий базальный уровень альфа-токоферола в печени по сравнению с мышами DBA/2J, что может быть связано с большим накоплением липидов в печени аутбредных мышей линии ICR-1 по сравнению с инбредной линией DBA/2J. Воспроизведение in vivo моделей патологических состояний призвано достичь наибольшего возможного развития комплекса фенотипических изменений, соответствующих клинической картине моделируемого заболевания. Так, в случае с МС желательным является сочетание в одной модели максимального числа метаболических нарушений — гипергликемии, инсулиновой резистентности, дислипидемии, повышенного АД, абдоминального ожирения. В этом отношении мыши инбредной линии DBA/2J и аутбредной линии ICR-1 не соответствовали картине МС по всем исследованным признакам, за исключением повышенного уровня гликемии через 2 мес эксперимента. С другой стороны, у тетрагибридов DBCB отмечались признаки дислипидемии (повышенный уровень холестерина в плазме крови), ожирения (увеличение массы тела, относительной массы печени и жировой ткани), а также морфологическая картина жировой дистрофии печени, для количественной оценки которой необходимо проведение дополнительных исследований с использованием специальных методик. Таким образом, выбор линии животных критически важен для воспроизведения такого состояния, как МС, на высокоуглеводном рационе. Факторами, влияющими на воспроизводимость алиментарно-зависимых состояний, таких как МС, помимо состава применяемого экспериментального рациона, пола и исходного возраста животных, является генотип используемой линии. Значительно большая генетическая однородность инбредных линий по сравнению с аутбредными способна уменьшить интервал нормы реакции алиментарных факторов и тем самым повысить достоверность выявления требуемых эффектов. Однако эта же генетическая однородность может привести к невоспроизводимости модели в случае какого-либо сочетания генов, "неудачного" с позиции моделирования той или иной патологии. Так, мыши инбредной линии DBA/2J характеризуются повышенной склонностью к развитию почечной дисфункции, диабетической ретинопатии, некоторых типов опухолей и вместе с тем не отвечают увеличением средней продолжительности жизни при ограничении рациона по калорийности в отличие от большинства других инбредных и аутбредных линий. Одним из способов оптимизации in vivo моделей может быть использование животных-гибридов первого-второго поколения между несколькими инбредными линиями. Такие животные отличаются большей по сравнению с исходными родительскими инбредными линиями степенью гетерозиготности, критически важной для поддержания высокого уровня углеводного/липидного метаболизма и воспроизведения требуемой патологии, но меньшей гетерозиготностью и большей стабильностью фенотипических проявлений по сравнению с обычными аутбредными линиями. Как показали данные эксперимента, полученные нами самки тетрагибриды DBCB 2-го поколения являются перспективным объектом для воспроизведения МС. В данной работе были выявлены как минимум два различных типа реагирования печени экспериментальных животных на высокоуглеводный рацион. Так, у самок тетрагибридов DBCB потребление сахарозы соответствует классической картине жировой дистрофии печени с образованием крупных жировых вакуолей при сохранении определенного числа морфологически нормальных гепатоцитов. Аналогичная картина жировой вакуолизации наблюдалась в работе у мышей линий C56BI/6 и 129Sv, получавших высокожировой рацион. При этом в отличие от них мыши линии CD1 (синоним использованных нами ICR-1) практически не демонстрировали признаков жировой вакуолизации. В работе, выполненной в сходных условиях, жировая вакуолизация ткани печени наблюдалась у мышей CD1 только после 3-месячного потребления высокожирового рациона, а до этого момента накопление жира в гепатоцитах имело диффузный характер, аналогичный наблюдаемому нами у этой линии на рационе с добавкой сахарозы. Мыши инбредной линии DBA/2J по результатам гистологического исследования жировой дистрофии печени заняли промежуточное положение между двумя другими линиями, при том что у них полностью отсутствовали признаки спонтанного накопления жира в гепатоцитах на стандартном рационе. Массивное накопление липидов в печени тетрагибридов DBCB на высокосахарозном рационе согласуется с ростом у них концентраций общего холестерина и особенно ЛПВП, отвечающих за его перенос из периферических тканей в печень. Можно предположить, что в этих условиях и усиливается сопряженный с липидами транспорт в печень витамина Е, приводящий к компенсации его содержания в органе в условиях уменьшения поступления с высокосахарозным рационом. Для витамина А, межорганное распределение которого контролируется уровнем экспрессии специфических транспортных белков, данный эффект не наблюдается. В основе рассмотренной вариабельности ответа на потребление избытка сахарозы в ткани печени могут лежать особенности экспрессии в ней групп генов, ответственных за метаболизм липидов, в частности Ppar-у сигнального пути. Для установления особенностей этого механизма необходимо проведение транскриптомных и протеомных исследований. Полученные на in vivo модели МС результаты позволят, в частности, установить ключевые биомаркеры для комплексной диагностики и прогнозирования развития такого серьезного осложнения МС, как неалкогольный стеатоз печени, в клинике.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.107-113. Библ. 14 назв.
Просмотров: 85