ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ НЕСТАБИЛЬНЫХ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ

Аннотация:

Проведено комплексное морфологическое изучение образцов различных типов нестабильных атеросклеротических бляшек, полученных от 33 мужчин с окклюзирующим коронарным атеросклерозом, у которых в ходе операции коронарного шунтирования была проведена эндартерэктомия из коронарной артерии. В полученных образцах с помощью морфометрического и иммуногистохимического метода оценивали экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММП-2, ММП-9), коллагена IV, CD31, CD34, фактора VIII, актина гладкомышечных клеток. Показано, что в нестабильных бляшках липидного типа определяется наибольшая экспрессия ММП-9, превышающая таковую в бляшках воспалительно-эрозивного и дистрофически-некротического типов в 1.4 и 1.24 раза соответственно. Нестабильные бляшки дистрофически-некротического типа характеризуются наибольшей экспрессией коллагена IV по сравнению с бляшками воспалительно-эрозивного и липидного типов (в 2.8 и 2.2 раза соответственно). В бляшках воспалительно-эрозивного типа выявлена самая высокая степень неоваскуляризации, подтвержденная повышенной экспрессией маркеров CD31 и CD34 по сравнению с липидным (в 7.6 и 18.95 раза соответственно) и дистрофически-некротическим (в 31.1 и 39.8 раза) типами. Ключевые слова: атеросклероз, нестабильная бляшка, иммуногистохимия, металлопротеиназы, неоваскуляризация. Атеросклеротическая бляшка, проходя этапы своего развития, в определенные временные периоды с момента возникновения и до фиброзной облитерации просвета сосуда может оставаться стабильной или превращаться в нестабильную, а также переходить из одного состояния в другое. Такие преобразования атеросклеротических бляшек связаны с возможностями компенсации сосудистой стенки, которая определяется как сосудистое ремоделирование и может идти по двум основным путям. Первый путь — это путь экспансивного ремоделирования по типу расширения просвета сосуда в пораженном сегменте, которое протекает при разрушении компонентов внеклеточного матрикса, доказательством чего служат патологоанатомические наблюдения и экспериментальные модели, указывающие на повышенную экспрессию матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 в таких сосудах. Второй путь — это путь сосудистой компенсации, сужение просвета сосуда за счет укрепления и утолщения интимального слоя, или констриктивное ремоделирование. В таких артериях наблюдается повышенное содержание гладкомышечных клеток и коллагена, что ведет к стабильности атеросклеротического очага, но, с другой стороны, и к хроническому стенозированию просвета коронарных артерий. Дисбаланс между компонентами внеклеточного матрикса и металлопротеиназами приводит к снижению механической устойчивости фиброзной покрышки и формированию нестабильной бляшки. Нестабильные атеросклеротические бляшки принято разделять на три типа: 1-й — липидную (фиброатерома), 2-й — воспалительно-эрозивную, 3-й — деструктивную (дистрофически-некротическую). Характерными чертами бляшек 1-го типа являются крупное атероматозное ядро (циркулярно или эксцентрично расположенное), истонченная фиброзная покрышка; для бляшек 2-го типа характерны небольшое липидное ядро, фиброзная покрышка, обильно инфильтрированная клетками воспалительного ряда (макрофагами и Т-лимфоцитами) или пенистыми клетками, гибель эндотелиальных клеток на поверхности воспалительной или липидной эрозии покрышки; для бляшек 3-го типа — выраженные дистрофические изменения и некрозы в покрышке, очаги кальцификации разных размеров под истонченной покрышкой. Актуальной представляется молекулярно-биологическая оценка различных вариантов нестабильных атеросклеротических бляшек у пациентов с окклюзирующим коронарным атеросклерозом. Изучение этого вопроса необходимо для выяснения молекулярных механизмов и факторов возникновения таких процессов, как воспалительная инфильтрация, пролиферация гладкомышечных клеток, образование или деструкция коллагеновых волокон и сосудистая пролиферация в бляшке. Эти процессы оказывают большое влияние на морфологию сосудистой стенки, определяют особенности ее ремоделирования, влияют на течение ИБС. Цель данной работы — сравнительный анализ иммуногистохимических показателей внеклеточного матрикса и неоангиогенеза в различных типах окклюзирующих просвет сосуда нестабильных атеросклеротических бляшек коронарных артерий (КА) пациентов после операции коронарного шунтирования. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Проведен патоморфологический и иммуногистохимический анализ атеросклеротических бляшек КА после коронарной эндартерэктомии (из правой КА или огибающей ветви левой КА), выполненной во время операции коронарного шунтирования в Центре хирургии аорты и коронарных артерий ФГБУ НМИЦ им. акад. Е.Н.Мешалкина Минздрава России. Атеросклеротические бляшки получены от 33 пациентов мужского пола (средний возраст — 62.5±10.9 года) с коронарографически верифицированным многососудистым коронарным атеросклерозом и стабильной стенокардией напряжения II-III функционального класса. Коронарографическое исследование выполнено на моноплановой ангиографической установке "Innova4200" ("General Electric") или "Infinix" ("Toshiba"). В исследование вошли пациенты с хронической окклюзией или субокклюзией КА. Поданным коронарографии, поражение двух КА встречалось в 43% случаев, трех КА — в 57%. Каждый из 33 образцов атеросклеротически пораженной интимы с частью среднего слоя КА был продольно и поперечно симметрично разделен на 3 фрагмента для гистологического исследования. Макроскопический анализ включал определение распространенности бляшки, степени стенозирования просвета КА, кровоизлияний в структуры бляшки, наличия обызвествления, тромбов. После стандартной гистологической проводки парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону, исследовали в микроскопе "AxioLab.AI" ("Carl Zeiss"). Подготовку образцов для иммуногистохимического исследования проводили по стандартным протоколам в иммуностейнере "LabVision Autostainer 720" ('Thermo Scientific") с использованием системы UltraVision Quanta HRP DAB Protocol и моноклонапьных и поликлональных первичных антител ("Thermo Scientific", ready-to-use): к ММП-9, коллагену IV (клон PHM-12+CIV22), CD31 (клон JC/70A), CD34 (клон QBEnd/10), актину гладкомышечных клеток (ASM) (клон 1 A4/asm-1), фактору VIII; использовали также моноклональные антитела к ММП-2 (разведение 1:20; "Abeam"). Объемную плотность иммуногистохимически окрашенных участков внеклеточного матрикса оценивали в процентах с использованием программы "AxioVision Rel.4.9.1" при увеличении 400 с помощью закрытой тестовой системы из 100 точек. В каждом срезе исследовали все поля зрения фиброзной покрышки атеросклеротической бляшки (не менее 10 полей зрения) и в каждом из них измерения проводили при 5 различных произвольно выбранных положениях окулярной сетки. Экспрессию ММП-2 и ММП-9 определяли в цитоплазме фибробластов, эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток, макрофагов, мастоцитов, во внеклеточном матриксе, аморфных массах атероматозных ядер. Применяли полуколичественный метод: выраженная экспрессия — "3+" (при окрашивании как цитоплазмы клеток, так и большей части внеклеточных компонентов >50%), умеренная —"2+" (при окрашивании цитоплазмы клеток и очаговом окрашивании внеклеточных компонентов <50%), слабая — "1+" (при окрашивании только цитоплазмы клеток), отсутствие окрашивания —"—". Экспрессию коллагена IV оценивали также полуколичественным методом с учетом объемной плотности "окрашенного" внеклеточного матрикса как выраженную — "3+" (при окрашивании >50% внеклеточного матрикса), умеренную — "2+" (при окрашивании 25-50% внеклеточного матрикса), слабую — "1 +" (при окрашивании <25% внеклеточного матрикса); отсутствие окрашивания — "-". Экспрессию ASM оценивали подоле позитивно окрашенных гладкомышечных клеток. Экспрессию фактора VIII, CD31 и CD34 оценивали также по доле позитивно окрашенных эндотелиоцитов. В каждом случае подсчитывали не менее 100 клеток. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения "Microsoft Office Excel 2010" и "SPSS 13.0". Данные представлены в виде средних значений (±стандартное отклонение) для количественных и полуколичественных величин или как значения и проценты — для качественных. Показатели исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. Достоверность различий между средними значениями оценивали с использованием t критерия Стьюдента (для признаков с нормальным распределением) или критерия Манна—Уитни (для признаков с ненормальным распределением). Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р<0.05). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Дистрофически-некротический тип нестабильной атеросклеротической бляшки оказался самым распространенным и отмечался в 64% случаев, вторым по распространенности был липидный тип — 23%, воспалительно-эрозивный тип нестабильных бляшек был выявлен в 13% случаев. Подобная частота распространения бляшек липидного и дистрофически-некротического типов была установлена также и другими исследователями при анализе частоты и локализации разных типов нестабильных атеросклеротических бляшек основных КА при острых коронарных синдромах. При анализе различных сегментов атеросклеротических бляшек были отмечены как однородные бляшки, т.е. каждый из сегментов соответствовал одному и тому же гистологическому типу, так и бляшки с различным строением сегментов. Последние были выделены в самостоятельный, так называемый смешанный тип атеросклеротической бляшки, что отображает гетерогенность ее строения. К смешанному типу можно было отнести 35% всех исследованных бляшек. При этом в одной атеросклеротической бляшке ни разу не встречались комбинации более двух гистологических типов. Наиболее распространенное сочетание различных гистологических типов — это стабильные бляшки с одним дистрофически-некротическим сегментом (37.5% случаев), дистрофически-некротические бляшки с одним стабильным сегментом (29%), и в равной степени были представлены сочетания атероматозной и стабильной бляшек (12.5%) и некротически-дистрофической и атероматозной бляшек (12.5%). Выявленную гетерогенность атеросклеротического очага можно определить как важную особенность морфогенеза, т.е. перехода бляшки из одного структурного состояния в другое. На месте атероматозных масс может возникать рыхлая фиброзная ткань с последующей организацией в плотную соединительную или костную, что способствует переходу бляшки из нестабильного состояния в стабильное, и, наоборот, развитие некродистрофических изменений плотной соединительной ткани может обусловить накопление атероматозного детрита или солей кальция в очаге некроза с образованием нестабильной бляшки. При сравнении тканевой экспрессии металлопротеиназ в различных типах нестабильных атеросклеротических бляшек установлено, что экспрессия ММП-9 была максимальной в бляшках липидного типа — в 1.4 раза (р<0.05) больше, чем в бляшках воспалительно-эрозивного типа (табл. 1), и в 1.24 раза (р<0.05) больше, чем в бляшках дистрофически-некротического типа (рисунок, а). Значимых различий в экспрессии ММП-2 между нестабильными бляшками трех типов получено не было (рисунок, б; табл. 1). Это может быть обусловлено накоплением этого фермента не только в некротических массах бляшек дистрофически-некротического типа, но и в пенистых макрофагах бляшек липидного и воспалительно-эрозивного типов. Наибольшая экспрессия коллагена IV наблюдалась в бляшках дистрофически-некротического типа по сравнению с бляшками воспалительно-эрозивного и липидного типов (в 2.8 и 2.2 раза соответственно, р<0.05) (рисунок, в; табл. 1). При иммуногистохимическом анализе панэндотелиальных маркеров CD31 и CD34 установлено, что в бляшках воспалительно-эрозивного типа экспрессия этих маркеров (оцениваемая по объемной плотности сосудов) была выше, чем в бляшках липидного типа (в 7.6 и 18.95 раза соответственно) и дистрофически-некротического типа (в 31.1 и 39.8 раза) (табл. 2). Оценка объемной плотности сосудов, позитивных по фактору VIII, в бляшках различных типов не выявила статистически значимых различий, но отмечалась тенденция к повышению объемной плотности сосудов в бляшках воспалительно-эрозивного типа (рисунок, г). Самое низкое значение объемной плотности сосудов было отмечено в нестабильных бляшках дистрофически-некротического типа, что можно объяснить их морфологическими особенностями и клеточным составом. В бляшках этого типа отмечались отсутствие или легкая степень выраженности воспалительной реакции, сниженная инфильтрация внеклеточными липидами и пенистыми клетками, которая присутствовала лишь в поверхностных слоях. Выявлены особенности экспрессии сосудистых маркеров в сосудах артериального типа. Так, экспрессия CD31 наблюдалась как в выстилающем эндотелии, так и снаружи окружающих артериальную стенку перицитов (рисунок, г). Экспрессия CD34 была выявлена только в выстилающем эндотелии (рисунок, д). Экспрессия фактора VIII была самой значительной в эндотелиоцитах и перицитах, но также регистрировалась в межклеточном матриксе (рисунок, е). Установленные особенности васкуляризации бляшек могут способствовать их дальнейшему развитию по пути к нестабильности, в частности, определять ее тип. Отсутствие или малая степень васкуляризации бляшки не обеспечивает приток циркулирующих в крови клеточных элементов, таких как лимфоциты и макрофаги, а также липидов и кристаллов холестерина, что не позволяет ей развиваться по воспалительно-эрозивному или липидному типу нестабильности. В то же время сниженная сосудистая плотность не может обеспечить сформировавшийся стабильный атеросклеротический очаг должным притоком метаболитов, что, в свою очередь, может способствовать его некротически-дистрофическим изменениям с дальнейшей кальцификацией и формированием нестабильной некротически-дистрофической бляшки. Таким образом, по данным проведенного иммуногистохимического исследования, нестабильные атеросклеротические бляшки КА могут быть разделены с учетом характерных для них структурных и молекулярных особенностей на 3 типа. Бляшки дистрофически-некротического типа, несмотря на наличие в них распространенных некрозов и капьцификации, обнаруживают самую высокую экспрессию коллагена IV и сниженную степень васкуляризации (по оценке маркеров CD31 и CD34) относительно двух других типов. Для бляшек липидного типа характерна повышенная экспрессия ММП-9 по сравнению с бляшками дистрофически-некротического и воспалительного типов. Воспалительный тип нестабильной бляшки дополнительно отличается повышенной степенью васкуляризации относительно двух других нестабильных типов, что подтверждается экспрессией маркеров CD31 и CD34. Столь значимый уровень васкуляризации свидетельствует о хорошем кровоснабжении ате-росклеротического очага, что, в свою очередь, объясняет отсутствие таких морфологических проявлений атеросклеротического процесса, как очаги некроза, крупноглыбчатая кальцификация и расширенный клеточный состав бляшек такого типа.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 7.-С.114-119. Библ. 14 назв.
Просмотров: 82