ВЛИЯНИЕ МЕТФОРМИНА НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ГИПОТАЛАМИЧЕСКИЕ СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ У КРЫС С ОЖИРЕНИЕМ, ВЫЗВАННЫМ ВЫСОКОУГЛЕВОДНОЙ И ВЫСОКОЖИРОВОЙ ДИЕТОЙ

Аннотация:

Метформин (МФ), препарат первой линии выбора при лечении сахарного диабета, в последние годы применяется для лечения ожирения. Его терапевтический эффект обусловлен не только воздействием на периферические ткани, но и на гипоталамус, контролирующий пищевое поведение и энергетический обмен. Цель работы состояла в изучении влияния терапии МФ (200 мг/кг в сут, 8 нед) у крыс с ожирением, вызванным высокоуглеводной/высокожировой диетой, на метаболические и гормональные показатели и функциональное состояние гипоталамических сигнальных систем. Лечение МФ крыс с ожирением (группа ОжМ) нормализовало пищевое поведение, снижало массу тела и жировой ткани, уровень глюкозы, инсулина и лептина, повышало чувствительность к глюкозе и инсулину, улучшало показатели липидного обмена, восстанавливало -фосфорилирование / -киназы в печени. В гипоталамусе частично восстанавливались стимулирующие аденилатци-клазу (АЦ) эффекты агонистов меланокортиновых рецепторов 4-го типа и дофаминовых рецепторов 1-го типа, усиливался ингибирующий АЦ эффект агонистов серотонинового рецептора 1В-го типа (С1ВР), что сопровождалось повышением экспрессии гена Htrlb, нормализовался стимулирующий эффект CgP-агониста EMD-386088. При этом различия в активности лептиновой и инсулино-вой систем и соотношении анорексигенных и орек-сигенных факторов в гипоталамусе крыс групп Ож и ОжМ были выражены слабо. Таким образом, лечение МФ меняет функциональную активность ги-поталамической меланокортиновой, дофаминовой и серотониновой систем у крыс с ожирением, что является одной из причин снижения потребления ими пищи, восстановления метаболических показателей и чувствительности к инсулину. Ключевые слова:Метформин, ожирение, гипоталамус, аденилатциклазная система, меланокортиновый рецептор, инсулиновая резистентность. Метформин (МФ) широко применяют для лечения сахарного диабета 2-го типа . В основе его терапевтического эффекта лежит способность повышать чувствительность тканей к инсулину и снижать продукцию глюкозы гепатоцитами, что улучшает гликемический контроль и восстанавливает энергетический обмен, нарушенные при диабете. В последние годы появились клинические и экспериментальные данные, что МФ может применяться для улучшения энергетического гомеоста-за при ожирении, в том числе не связанном с диабетом . При этом эффективность МФ при различных формах ожирения сильно различается, что во многом обусловлено особенностями молекулярных механизмов и мишеней действия этого препарата. В основе действия МФ на периферические органы и ткани лежит его способность стимулировать активность АМФ-активируемой протеинкиназы (АМФК), важнейшего энергетического сенсора клетки. АМФК контролирует протекание таких процессов, как липогенез, глюконеогенез, транспорт глюкозы, стресс эндоплазматического рети-кулума.Вызываемое МФ восстановление активности АМФК в печени, скелетных мышцах и жировой ткани, сниженной при диабете и ожирении, нормализует углеводный и липидный обмен, препятствует развитию окислительного стресса, липотоксичности, улучшает функции инсулиновой и других систем . В последние годы появились данные, что мишенями МФ могут быть не только периферические ткани, но и мозг, в первую очередь гипо-таламические нейроны.При этом в гипоталамусе МФ не стимулирует, как на периферии, а ингибирует активность АМФК. В результате, усиливаются анорексигенные влияния, снижается потребление пищи, как это показано при лечении МФ пациентов и экспериментальных животных с ожирением. Однако механизмы, лежащие в основе анорексигенного эффекта МСР и его способности влиять на центральную регуляцию энергетического обмена и инсулиновой чувствительности, исследованы недостаточно. Цель работы состояла в изучении того, как длительное (8 нед) лечение МФ крыс с ожирением, вызванным комбинированной высокоуглеводной и высокожировой диетой, влияет на их метаболические и гормональные показатели и на активность ги-поталамических систем. Функциональное состояние лептиновой, меланокортиновой, дофаминовой и серотониновой систем в гипоталамусе оценивали по экспрессии генов, кодирующих их основные компоненты, и по регуляторным эффектам агонистов меланокортинового рецептора 4-го типа (МК4Р), дофаминовых рецепторов 1-го и 2-го типа (Д,Р, Д2Р) и серотонинового рецептора 1В-подтипа (СШР) на активность аде-нилатциклазы (АЦ). Активность инсулиновой и лептиновой систем оценивали по фосфорилиро-ванию серин/треониновой >Ш-киназы по остатку Ser473. Материалы и методы. Все эксперименты были проведены на самцах крыс линии Wistar и соответствовали требованиям этического комитета ИЭФБ РАН, European Communities Council Directive 1986 (86/609/ EEC) и правилам, изложенным в «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Все возможности для сокращения числа животных, необходимых для достижения поставленных задач, были предприняты. Для индукции ожирения, начиная с возраста 26 дней, крысят вместо воды поили 30 % раствором сахарозы. В рацион также добавляли насыщенные жиры (маргарин) из расчета 4 г маргарина на крысу в день. Через месяц после начала приема высокоуглеводной / высокожировой диеты повышали суточное количество маргарина до 5 г, еще через месяц — до 6 г. У четырехмесячных крыс с помощью глюкозотолерантного теста оценивали чувствительность к глюкозе, для чего в/б вводили раствор глюкозы (2 г/кг) и в течение 120 мин в крови, полученной из хвостовой вены, измеряли ее концентрацию . Были отобраны животные с повышенной массой тела и нарушенной толерантностью к глюкозе, затем случайным образом их поделили на группы: ОжМ, которая в течение 8 нед получала МФ в дозе 200 мг/кг в сут (перорально, п=6), и Ож, которая вместо МФ получала плацебо (п=6). Крысы контрольной группы того же возраста находились на стандартном рационе (группа К', п=6). За неделю до окончания лечения для оценки, вызываемой инсулином утилизации глюкозы, проводили инсулиноглюкозотолерантный тест (ИГТТ), для чего крысам одновременно вводили глюкозу (2 г/кг, в/б) и инсулин (Хумалог, 0,8 МЕ/кг, п/к) [9]. За 2 дня до окончания лечения проводили ГТТ. Уровень глюкозы определяли в течение 120 мин после глюкозной нагрузки с помощью тест-полосок One Touch Ultra (США). После декапитации под наркозом у крыс забирали кровь для оценки биохимических показателей, извлекали ткани гипоталамуса и печени для изучения экспрессии генов с помощью количественной ПЦР и фосфорилирования белков с помощью вестерн-блоттинга. Концентрацию инсулина в крови и леп-тина в крови и гипоталамусе определяли с помощью наборов «Rat Insulin ELISA» («Mercodia», Швеция) и «ELISA Kit for Leptin» («Cloud-Clone Corp», США). Концентрацию триглицеридов (ТГ), общего холестерина (ОХ) и Х-ЛПВП и Х-ЛПНП оценивали с помощью наборов фирмы «Olvex Diagnosticum» (Россия). Тотальную РНК из гипоталамуса выделяли с помощью набора «РИБО-золь-В» (ФГУН ЦНИИЭ, Россия). Обратную транскрипцию проводили с помощью набора «RevertAid Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit» («Thermo Fisher Scientific Inc.», США). Амплификацию проводили в смеси (25 мкл), содержащей 10 нг обратно транскрибированного продукта, по 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров, qPCRmix—HS SYBR+LowROX ( «Евроген», Россия). Для оценки экспрессии генов LepR, Mc4r, Drd\, Drd2, HtAb, /rs2, Akt\, Aktl, Ptpn\, Pome, Agrp, Npy, кодирующих лептиновый рецептор (ЛепР), МК4Р, Д1Р, Д2р, Сшр, IRS2, изоформы 1 И 2 /Ш-киназы, протеинфосфотирозинфосфатазу 1В (ПФТФ1В), проопиомеланокортин (ПОМК), агутиподобный пептид (АПП), нейропептид У (НПУ) , использовали праимеры, структуры которых приведены в работе .В качестве контроля использовали ген для глицеральдегидфосфатдеги-дрогеназы (Capdh). Амплификационный сигнал детектировали с помощью прибора «7500 Real-Time PCR System» (США). Анализ данных проводили с помощью 7500 Software v2.0.6. и Expression Suite Software vl.0.3. Расчет экспрессии целевого гена проводили по методу ДАО.Фосфорилирование Akt-киназ оценивали с помощью вестерн-блоттинга . Для этого ткани гипоталамуса и печени гомогенизировали (1:20) в 20 мМ Tris-HCl-буфере (рН 6,8), который содержал 25 мМ ЭДТА, 0,1% Triton Х-100, ингибиторы протеаз и фосфатаз. Гомогенат центрифугировали (100 g, 10 мин), к супернатанту добавляли (3:1, v/v) 200 мМ Tris-HCl-буфер {рН 6,8), содержащий 400 мМ (3-меркаптоэтанол, 4% SDS, 40% глицерин и 0,01% бромфеноло-вый синий. Пробы нагревали до 95 °С (3 мин), разделяли в 10% полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Bio-Rad, США). Мембраны в течение часа обрабатывали 5 % раствором сухого обезжиренного молока в Т'В5-7и;ееп-20-буфере (рН 7,6). Затем в течение ночи ( + 4 °С) мембраны инкубировали с первичными антителами Anti-Akt (1:1000), Anti-Phospho-Akt(Serm)( 1:1000), Anti-GAPDH (1:2000) («Cell Signaling Technology», США), в качестве вторичных антител использовали goat anti-rabbit IgC HRP (1:5000) («Cell Signaling Technology», США). Для детекции меченых антителами белков применяли набор для иммунохемолю-минесценции («Novex ECL Reagents, Invitrogen», США). Выделение фракций плазматических мембран из гипоталамуса крыс и определение в них активности АЦ проводили с использованием меченого субстрата [а-32Р]АТФ с удельной активностью 1000 Ки/ммоль («Изотоп», Россия), как описано ранее. Для оценки чувствительности АЦ к гормонам использовали дофамин, серотонин, С6Р-агонист EMD-ШШ, Д. -агонист SKF 82958, Д7 -агонист бромокриптин, а-меланоцитстимулирующий гормон (а-МСГ) («Sigma-Aldrich», США), МК4Р-агонист THIQ, С1ВР-агонист 5-нонилокситриптамин (5-НОТ) («Tocris Cookson Ltd.», Великобритания). Статистический анализ экспериментальных данных проводили с помощью программы Microsoft Office Excel' 2007 (надстройки AtteStat 12.5 и Daniel's XL Toolbox 6.52). Данные представляли как M+SD, данные по экспрессии генов — как M±SEM. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро—Уилка Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали /-критерий Стьюдента, для сравнения трех групп — дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения, обрабатывали с применением (/-критерия Манна— Уитни. Статистически значимыми считали отличия при уровне значимости р<0,05. Результаты и обсуждение Крысы с ожирением имели повышенную массу тела, абдоминального и эпидидимального жира, гиперфагию, умеренно выраженную гипергликемию, гиперинсулинемию, нарушения липидно-го баланса, что выражалось в повышении уровня I Г, ОХ, атерогенного Х-ЛПНП, соотношения Х-ЛПНП/Х-ЛПВП (табл.1). С помощью ГТТ показано, что уровень глюкозы через 120 мин.после глюкозной нагрузки (ГТТШ) и значение AUC 0-120 (интегрированная площадь под кривой «концентрация глюкозы (ммоль/л) - время (мин)» в интервале времени от 0 до 120 мин) в группе Ож были достоверно выше, чем в контрольной. В ИГТТ, где оценивали способность экзогенного инсулина снижать уровень глюкозы после нагрузки, уровень глюкозы (ИГТТ10) и значение AUC 0-120 / Эти данные свидетельствует о сниженной чувствительности тканей к глюкозе и инсулину у крыс группы Ож и развитии у них инсулиновой резистентности. В группе Ож отмечали сильно выраженную ги-перлептинемию, на что указывало шестикратное повышение уровня лептина в крови. В то же время, уровень лептина в гипоталамусе был снижен. Эти данные свидетельствуют о лептиновой резистентности у крыс с ожирением, следствием чего является периферическая гиперлептинемия и нарушение транспорта лептина через гемато-энцефалический барьер, что приводит к дефициту лептина в гипоталамусе, как это показано для пациентов и экспериментальных животных с ожирением . Развитие лептиновой резистентности в условиях избыточного потребления насыщенных жиров и легко усваиваемых углеводов является одним из механизмов, ведущих к нарушению энергетического обмена и ожирению. При лечении МФ отмечали нормализацию пищевого поведения, снижение массы тела и жировой ткани, улучшение показателей липидного обмена, в том числе снижение на 22% соотношения Х-ЛПНП/Х-ЛПВП и, как следствие, снижение индекса атерогенности (см. табл. 1). В крови крыс группы ОжМ уровень глюкозы и инсулина снижался до уровня у контрольных животных, следствием чего было снижение индекса инсулиновой резистентности, рассчитанного как произведение концентрации глюкозы и инсулина натощак. В группе Ож индекс инсулиновой резистентности был повышен на 183 %, в группе ОжМ он превышал значение этого индекса в контрольной группе только на 16 %. Лечение МФ приводило к частичному восстановлению чувствительности к глюкозе и инсулину, о чем свидетельствует снижение в сравнении с группой Ож уровня глюкозы через 120 мин после глюкозной нагрузки в ГТТ и ИГТТ и значений AUCQ_m для глюкозных кривых в обоих тестах (см. табл. 1). В группе ОжМ отмечали значительное снижение уровня лептина в крови и нормализацию уровня лептина в гипоталамусе . Эти данные свидетельствуют о повышении чувствительности к инсулину и лепти-ну и нормализации транспорта лептина через гема-тоэнцефалический барьер у крыс, леченных МФ. Поскольку в условиях ожирения может меняться активность инсулиновой и лептиновой систем на периферии и в ЦНС , на следующем этапе работы изучали активность этих систем в печени и гипоталамусе по степени 5ег473-фОСфо-рилирования серин/треониновой Art-киназы, основной мишени инсулина и лептина. Имеются данные, что в гепатоцитах инсулин через Art-зависимые пути повышает захват глюкозы, усиливает синтез гликогена, снижает глюконеогенез .Лептин, стимулируя фосфорилирование Art-киназы в гипоталамических нейронах, усиливает продукцию меланокортиновых пептидов, активирует меланокортиновую систему, вызывая, таким образом, снижение аппетита и повышение интенсивности энергетического обмена/ Важную роль в регуляции энергетического гомеостаза и периферической инсулиновой чувствительности играет и гипоталамическая инсулиновая система, также включающая в качестве эффекторного звена различные изоформы Art-киназ . Нами показано, что в печени крыс группы Ож фосфорилирование Art-киназ по остатку Ser473 ослаблено, о чем свидетельствует снижение на 41% соотношения фосфо-Art/общая Art. Лечение МФ приводило к возрастанию фос-форилирования до уровня, который не отличался от такового в контрольной группе (рисунок). Следовательно, МФ восстанавливает способность инсулина активировать Akt-киназу в печени, и этот эффект, как можно полагать, обусловлен способностью МФ стимулировать АМФК в гепатоцитах и улучшать энергетический статус этих клеток. В отличие от печени, в гипоталамусе крыс группы Ож фосфорилирование Art-киназ не отличалось от такового в контрольной группе. Несмотря на то, что лечение МФ приводило к небольшому его повышению, различия с группами К и Ож не были статистически значимыми (данные не представлены). При изучении экспрессии генов, кодирующих основные компоненты лептиновых и инсулиновых путей, в гипоталамусе крыс группы Ож было обнаружено, что экспрессия генов Insr, Art1 и Ptpib, кодирующих инсулиновый рецептор, Art1-киназу и ПФТФ1В, негативный регулятор этих путей, не менялась, в то время как экспрессия генов Lepr, Akt2 и lrs2, кодирующих ЛепР, Art1-киназу и 1RS2, в небольшой степени повышалась Лечение МФ приводило к повышению экспрессии гена Akt2, но слабо влияло на экспрессию других генов. Следовательно, при ожирении, вызванном высокоуглеводной/высокожировой диетой, лептиновая и инсулиновая системы гипоталамуса не испытывают значительных изменений, и МФ-терапия на них существенно не влияет. Показано также, что в группах Ож и ОжМ в одинаковой степени повышалась экспрессия гена Роте, кодирующего ПОМК, прекурсор анорекси-генных меланокортиновых пептидов, и снижалась экспрессия генов, кодирующих орексигенные факторы — АПП и НПУ .Поскольку в группах Ож и ОжМ соотношение анорексиген-ных и орексигенных факторов смещено в сторону анорексигенных, это должно приводить к снижению потребления пищи. В то же время, крысы группы Ож характеризовались гиперфагией, а крысы группы ОжМ имели нормальное пищевое поведение. Кажущееся несоответствие во многом объясняется изменением чувствительности меланокор-тиновой системы к меланокортиновым пептидам. Несмотря на то, что в обеих группах экспрессия гена Мс4г была снижена (см. табл. 2), ослабленная в группе Ож чувствительность АЦ к аго-нистам МК ,Р в гипоталамусе крыс, леченных МФ, частично восстанавливалась. На это указывает повышение стимулирующих АЦ эффектов а-МСГ и МК4Р-агониста THIQ в группе ОжМ в сравнении с группой Ож . Однако это повышение не столь значительное, чтобы им можно было в полной мере объяснить значительное снижение потребления пищи и улучшение энергетического го-меостаза у крыс группы ОжМ. Мы полагаем, что важными факторами, ведущими к нормализации пищевого поведения и метаболизма у крыс группы ОжМ, являются снижение деградации ПОМК и выявленные нами изменения в моноаминергиче-ских системах гипоталамуса, функционально связанных с гипоталамическими меланокортиновой и лептиновой системами. Известно, что в условиях окислительного стресса и липотоксичности, характерных для ожирения, в гипоталамических нейронах нарушается про-цессинг ПОМК и усиливается его деградация . Обнаруженная нами повышенная экспрессия ПОМК является компенсаторной реакцией на эти процессы. Поскольку МФ улучшает энергетический гомеостаз, то негативные метаболические влияния на процессинг ПОМК при лечении МФ ослабевают, что должно приводить к повышению концентрации меланокортиновых пептидов в гипоталамусе и усиливать их регуляторные эффекты на меланокортиновую систему, чувствительность которой к ним, согласно нашим данным, сохраняется. Нами показано, что МФ-терапия существенно меняет активность дофаминовой и серотони-новой систем в гипоталамусе крыс с ожирением. В группе Ож снижается экспрессия генов, кодирующих оба типа ДР, ослабляются стимулирующие АЦ эффекты дофамина и селективного Д^агониста SKF-82958 и ингибирующие эффекты дофамина и Д2-агониста бромокриптина на стимулированную форсколином активность АЦ (см. табл. 2, 3). Наряду с этим, повышается экспрессия гена Htrlb, кодирующего СШР, усиливается ингибирующий эффект 5-НОТ, осуществляемый через этот рецептор, и повышаются стимулирующие АЦ эффекты серотонина и селективного С6Р-агониста EMD-386088. Все эти изменения указывают на ослабление дофаминовой и усиление серотониновой сигнализации в гипоталамусе крыс с ожирением, причем баланс стимулирующих и ингибирующих влияний в каждом случае сохраняется. Лечение МФ приводит к повышению экспрессии гена Drd1 и стимулирующих АЦ эффектов дофамина и SKF-82958, реализуемых через Д,Р, существенно не затрагивая Д1Р-путь. В группе ОжМ отмечается перераспределение се-ротониновых путей в пользу ингибирующего АЦ пути, что сопряжено со значительным повышением экспрессии гена Htr1b. Так, соотношение абсолютных значений эффектов 5-НОТ, агониста С,-сопряженного С1ВР и EMD-386088, агониста (^-сопряженного С&Р в группах Ож и ОжМ составляет 0,6 и 0,96. Усиление сигнализации через С]ВР может снижать мотивацию к потреблению пищи и опосредованно улучшать энергетический гомеостаз. На это указывают данные, что агонисты СЩР модулируют анорексигенные эффекты меланокортиновых пептидов, влияя на активность меланокортиновой системы. Возможно, этим объясняется более выраженный ответ на агонисты МК 4Р в условиях повышения экспрессии Htrlb и усиления ингибирующего АЦ эффекта 5-НОТ в группе ОжМ. К анорексигенному эффекту приводит и ингибирование G -сопряженных С,Р с помощью SB-742457, селективного С.Р-антагониста. Этот эффект сопоставим с таковым агониста С2СР, который также вызывает чувство насыщения и снижает потребление пищи.Вследствие этого усиление в группе Ож и нормализация в группе ОжМ стимулирующего АЦ эффекта С6Р-агониста EMD-386088 может вносить заметный вклад в усиление мотивации к потреблению пищи в группе Ож и в ее ослабление в группе ОжМ. Ослабление стимулирующего и ингибирующе-го дофаминовых путей и частичное восстановление Д1-сигнализации является еще одним фактором, влияющим на пищевое поведение у крыс групп Ож и ОжМ. При этом значительный вклад могут вносить изменения соотношения гетеро- и гомоди-мерных комплексов, образуемых Д^Р и Д2Р, поскольку известно, что образование таких комплексов меняет активность рецепторов и их регуляцию дофамином. При связывании с гетеродимерными Д1Р/Д2Р-комплексами, дофамин активирует не только цАМФ-зависимые, но и кальций-зависимые и 3-фосфоинозитидные пути, что в значительной степени определяет его физиологические эффекты, в том числе на пищевое поведение и энергетический гомеостаз . Длительное лечение Метформином крыс с ожирением, вызванным высокоуглеводной/ высокожировой диетой, приводило к нормализации пищевого поведения, снижению массы тела и жировой ткани, улучшало липидный обмен, снижало уровень глюкозы, инсулина, лептина, повышало чувствительность к глюкозе и инсулину, усиливало инсулин-индуцированную утилизацию глюкозы, восстанавливало Ser473-фосфорилирование /Ш-киназы в печени. Наряду с этим, Метформин в гипоталамусе восстанавливал ослабленные при ожирении стимулирующие аденилатцикла-зу эффекты агонистов МК4Р и Д,Р. а в случае Д,Р повышал экспрессию гена Drdl, сниженную в группе Ож. Отмечены изменеиия в соотношении стимулирующих и ингибирующих аденилатциклазу серотониновых путей, что иллюстрируется снижением стимулирующего аденилатциклазу эффекта С6Р-агониста EMD-386088, усилением ингибирующего аденилатциклазу эффекта С(ВР-агониста 5-НОТ и повышением экспрессии гена Htr\b. При этом активность лептиновой и инсулиновой систем и соотношение анорексигенных и орексигенных факторов в гипоталамусе крыс, леченных Метформином, в группах Ож и ОжМ существенно не различались. На основе полученных данных сделан вывод, что при лечении Метформином в гипоталамусе крыс с ожирением в наибольшей степени меняется активность меланокортиновой, дофаминовой и се-ротониновой систем, что ведет к снижению мотивации к потреблению пищи, восстановлению метабо лических и гормональных показателей, повышению чувствительности к инсулину и лептину.

Авторы:

Издание: Успехи геронтологии
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 1.-С.139-146. Библ. 30 назв.
Просмотров: 134