ОБРАБОТКА МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА ПОДАВЛЯЕТ ОБРАЗОВАНИЕ МИОЗИНОВЫХ ПОПЕРЕЧНЫХ МОСТИКОВ

Аннотация:

Молекулярный механизм нарушения сократительной функции скелетных мышц, вызванный окислительным повреждением миозина, до конца не выяснен. Используя демембранизированные волокна из быстрой (т. psoas) и медленной (т. soleus) мышц кролика, мы исследовали влияние окисления миозина на механизм силогенерации и его кальциевую регуляцию. Выявлено, что эта обработка ведет одновременно к снижению как максимального напряжения, так и жесткости волокон, но не оказывает эффекта на их кальциевую чувствительность. Это свидетельствует о том, что механизм снижения силогенерации при окислении волокон состоит в подавлении образования миозиновых поперечных мостиков и не влияет на характеристики актин-миозинового взаимодействия. Ключевые слова: мышечное сокращение, актин-миозиновое взаимодействие, кальциевая регуляция. Активные формы кислорода и азота участвуют в регуляции метаболизма в клетках млекопитающих, но их избыток ведет к окислительной модификации белков. В мышечных клетках страдают белки сократительного аппарата, что может влиять на сократительную функцию мышц. Обработка интактных и демембранизированных волокон скелетных мышц оксидом азота, пероксинитритом, гидроксильными радикалами или пероксидом водорода влияет на силу сокращений и ее кальциевую чувствительность, эти изменения зависят от типа мышц, условий модификации и применяемых реагентов. Тяжелые (ТЦМ) и легкие цепи (ЛЦМ) миозина — одни из главных мишеней окислительных модификаций, основной из которых является карбонилирование. Однако молекулярный механизм нарушения сократительной функции мышц, вызванного окислительным повреждением миозина, до конца не выяснен. Цель данной работы — исследовать влияние обработки изолированных демембранизированных мышечных волокон пероксидом водорода на характеристики их сократимости и кальциевой чувствительности. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования на одиночных демембранизированных Тритоном Х-100 волокнах из быстрой (т. psoas) и медленной (т. soleus) мышц кролика проводили на микромеханометрической установке с использованием техники скачка температуры и под контролем длины саркомеров с помощью лазерной дифракции. Миозин из т. psoas содержал 90-95% быстрой llx изоформы ТЦМ, а также 2-3% lib изоформы и менее 1% медленной изоформы I. ТЦМ из т. soleus были представлены медленной изоформой I (до 95%) с примесью быстрой изоформы На. Волокно в рабочей ячейке активировали (рСа 4.5) при 1°С в течение 10 с, затем блок ячеек передвигали, и волокно оказывалось в воздушной ячейке при ~5°С, где его нагревали скачком температуры и выполняли протокол по измерению силы и жесткости при ~30°С (рис. 1). Жесткость, как меру числа присоединенных головок миозина, измеряли по амплитуде колебаний силы в ответ на 0.2% синусоидальные изменения длины волокна с частотой 1.5 кГц. Затем волокно возвращали в ячейку с расслабляющим раствором, содержащим 10 мМ Н202, и выдерживали в течение 10 мин при 5°С, далее протокол повторяли с активирующим раствором, содержащим Н202. Оказалось, что такая концентрация Н202 и экспозиция достаточны для существенных изменений характеристик быстрых волокон, но не влияют на характеристики медленных волокон. По этой причине мы увеличили концентрацию Н202 для медленных волокон до 100 мМ. Цикл обработки повторяли 5 раз, в итоге волокно подвергалось обработке Н202 в течение 50 мин. Для исследования влияния окисления на Са2+-чувствительность силы сокращения и жесткости волокон их обрабатывали расслабляющим раствором, содержащим Н202. Использовали все растворы с 10 мМ дитиотреитолом, чтобы предотвратить дальнейшее окисление. Эксперименты были проведены на 3 волокнах из быстрой мышцы и 3 волокнах из медленной. Полученные данные представлены как среднее значение±стандартное отклонение. Сравнения проводили с помощью U критерия Манна—Уитни (р<0.05). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Волокна из т. psoas обрабатывали 10 мМ раствором Н202, а из т. soleus — 100 мМ Н202, так как оказалось, что они менее чувствительны к действию окислителя, чем быстрые. Развиваемое волокном напряжение (Р) и его жесткость (S) снижались с длительностью обработки (рис. 2, а). Снижение аппроксимировали экспоненциальной функцией Y=Axexp(-kx)+Yо, где Y означает Р или S. Параметры А, к и Ро для волокон из т. psoas составили 40.8±1.1%, 0.150±0.011 мин-1 и 64.9±1.1% соответственно (n=3); для волокон из т. soleus — 96.2±1.6%, 0.047±0.002 мин-1 и 8.2+1.4% (n=3). Параметры снижения жесткости быстрых волокон: 43.3±1.4%, 0.030±0.001 мин-1 и 56.7±1.4% (n=3); медленных— 62.10+1.57%, 0.082±0.002 мин~1 и 37.90±1.54% (n=3) соответственно (рис. 2, б). Обработка мышечных волокон не влияла на Саг+-чувствительность силы и жесткости (рис. 3, таблица). Волокна из т. soleus были более устойчивы к обработке Н2О2, чем волокна из т. psoas — для достижения одинаковой степени подавления максимального напряжения требовалось увеличить концентрацию Н202 в 10 раз. Мы исследовали влияние окисления изолированных демембранизированных мышечных волокон обработкой Н202 на молекулярный механизм силогенерации миозина. Максимальное напряжение волокна снижалось с длительностью обработки. Медленные волокна оказались на порядок менее чувствительны к окислению, чем быстрые, сила сокращений в обоих типах волокон за 50 мин обработки Н202 снизилась примерно на 30% (рис. 2), но в быстрых волокнах это произошло при концентрации Н20210 мМ, а в медленных — при 100 мМ. Это указывает на то, что на изменение сократительных характеристик мышечных волокон значительное влияние оказывает их устойчивость к окислению, т.е. активность антиоксидантной системы. Окислению подвергаются аминокислотные остатки цистеина и метионина ТЦМ и ЛЦМ, что критично для взаимодействия с актином и ведет к ухудшению сократительной способности волокон скелетных мышц. Было выявлено, что при обработке скелетных волокон Н202 окисляются остатки метионина в ТЦМ и ЛЦМ, а это, по мнению авторов, нарушает переход головок миозина из слабосвязанного состояния с актином в сильносвязанное. Согласно нашим данным, обработка волокон Н202 подавляет способность молекул миозина присоединяться к актину в любом состоянии, что подтверждается снижением жесткости волокон. Результаты исследований влияния окисления белков сократительного аппарата на Са2+-регуляцию сокращения скелетных мышц неоднозначны. В одних экспериментах обнаружено снижение Са2+-чувствительности силы, в других — таких изменений не выявлено. По нашим данным, после обработки Н202 кальциевая чувствительность силы сокращений и жесткости обоих типов волокон не изменилась (таблица). Противоречивость данных по Са2+-чувствительности силы при обработке мышечных волокон окислителями объясняется результатами работы, в которой показано, что модификация белков зависит не только от времени и вида воздействия, но также от стадии цикла поперечного мостика, т.е. доступности для окисления важных аминокислотных остатков. Кроме того, как видно из полученных нами на волокнах из разных мышц одного животного результатов, эффект воздействия окислителя может зависеть от типа волокон. Результаты проведенного исследования показывают, что при кратковременной обработке Н202 мышечных волокон в первую очередь страдает силогенерирующая функция миозина, тогда как Са2+-чувствительность как силы, так и жесткости волокон практически не меняется. Обнаруженное нами значительное снижение жесткости мышечных волокон после их обработки Н202 экспериментально подтверждает предположение о снижении количества силогенерирующих головок миозина при его окислении.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.136-140. Библ. 13 назв.
Просмотров: 55