ВЛИЯНИЕ АКТИВАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ИОННОГО КАНАЛА TRPM8 НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ TRP ИОННЫХ КАНАЛОВ В ГИПОТАЛАМУСЕ. СРАВНЕНИЕ С ВОЗДЕЙСТВИЕМ ХОЛОДА

Аннотация:

Активация периферического ионного канала TRPM8 ментолом, как и острое охлаждение (снижение глубокой температуры на 3°С), приводит к повышению экспрессии гена ионного канала TRPV3 в 1.5 раза в заднем гипоталамусе крыс, без изменения экспрессии этого гена в переднем гипоталамусе. Экспрессия генов других термочувствительных ионных каналов (TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPA1 и TRPM8) в гипоталамусе не изменялась ни при стимуляции периферического TRPM8, ни при действии острого холода. Увеличение экспрессии гена Trpv3 может свидетельствовать о повышении чувствительности нейронов гипоталамуса в диапазоне функционирования ионного канала TRPV3 (31-39°С). Обсуждается связь изменения экспрессии гена Trpv3 и сдвига порогов терморегуляторных реакций. Полученные данные свидетельствуют о наличии функциональной связи между TRP ионными каналами периферической нервной системы и TRP каналами центральных структур головного мозга. Ключевые слова: TRP ионные каналы, экспрессия генов, гипоталамус, холод, ментол. Процессы, происходящие в структурах мозга, при формировании терморегуляторного эфферентного сигнала изучены далеко не полностью. Из многочисленных схем, обобщающих накопленные экспериментальные данные, следует, что интегрирующие сигналы центра терморегуляции гипоталамуса формируются с учетом информации, поступающей как от периферических терморецепторов, так и от термочувствительных нейронов различных структур мозга, в том числе и самого гипоталамуса. К настоящему времени накоплены данные о том, что молекулярной основой температурной чувствительности как периферических, так и центральных нейронов являются термочувствительные ионные каналы, в том числе и TRP (Transient Receptor Potential). Выделяются шесть термочувствительных TRP ионных каналов— два холодочувствительных, активирующихся при понижении температуры: ниже 17°С — TRPA1, ниже 28°С — TRPM8; а также четыре теплочувствительных, которые активируются при повышении температуры: TRPV1 — от 42°С и выше, TRPV2 — от 52°С и выше, TRPV3 — в диапазоне 31-39°С, TRPV4 — от 25 до 42°С. Все вместе они охватывают диапазон температур, воспринимаемых большинством млекопитающих. Присутствие термочувствительных TRP ионных каналов показано как в периферических кожных афферентных волокнах, так и в структурах головного мозга, в том числе и в гипоталамусе. Не исключено, что изменение активности и температурной чувствительности нейронов гипоталамуса может определяться изменением количества белковых молекул термочувствительных TRP ионных каналов, встроенных в мембрану нейронов, что, в свою очередь, связано с изменением экспрессии генов этих каналов. Кроме температуры, некоторые TRP-каналы могут быть активированы природными веществами, являющимися их агонистами: TRPM8 — ментолом, TRPA1 — горчичным маслом, TRPV1 — капсаицином, TRPV3 — камфорой и т.д. Ранее показано, что предварительная активация ментолом периферического термочувствительного ионного канала TRPM8 кожи (т.е. нетермическая модуляция афферентного сигнала) приводит к изменению порогов терморегуляторных реакций при охлаждении, а также к определенным сдвигам в работе иммунной системы. Какие при этом изменения происходят в центре терморегуляции, остается загадкой. Цель данного исследования — выявление связи периферического ионного канала TRPM8 с 6 термочувствительными TRP ионными каналами гипоталамуса в разных температурных условиях. Гипоталамус функционально неоднороден. Передний гипоталамус связан с термочувствительностью и преимущественным участием в процессах теплоотдачи, в то время как функционирование заднего отдела гипоталамуса связано в основном с интеграцией поступающей информации и регуляцией метаболических процессов, в том числе теплопродукции. Поэтому исследование изменений активности генов термочувствительных ионных каналов, происходящих в центре терморегуляции, важно провести с учетом этих особенностей гипоталамуса. В задачи исследования входило определение уровня экспрессии генов 6 термочувствительных TRP ионных каналов (TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPA1 и TRPM8) в переднем и заднем отделах гипоталамуса в следующих условиях: при отсутствии температурного и фармакологического воздействия на организм; при фармакологической стимуляции периферического холодочувствительного ионного канала TRPM8 его агонистом ментолом, что позволит выявить связь этого ионного канала с термочувствительными TRP ионными каналами переднего и заднего гипоталамуса; оценить наличие изменений в экспрессии генов TRP ионных каналов гипоталамуса при холодовом воздействии на организм на фоне активированного периферического ионного канала TRPM8; сравнить эти данные с изменениями в экспрессии генов TRP ионных каналов гипоталамуса при охлаждающих воздействиях без предварительной стимуляции периферического ионного канала TRPM8, полученными ранее. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Эксперименты проводили на самцах крыс Вистар массой 250-350 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму. Все процедуры были выполнены в соответствии с международными правилами Европейского сообщества 1986/609/ЕЕС о гуманном обращении с животными. Эксперименты проводились при температуре воздуха в помещении 22-24 С. Охлаждение и регистрацию физиологических показателей проводили на наркотизированных животных (нембутал 40 мг/кг) для исключения двигательной активности и стрессорной компоненты. Исходно с помощью термостатируемого столика температура кожи живота поддерживалась на уровне 37.30±0.06°С, ректальная температура — на уровне 37.50±0.06°С. Охлаждение проводилось в области живота, предварительно освобожденной от шерсти, площадь термода составляла 25 см2, скорость снижения температуры кожи — 0.0040±0.0001°С/с (модель медленного охлаждения). Снижение ректальной температуры во всех случаях было одинаковым — на 3.0-3.5°С. Для контроля глубины и скорости охлаждения ректальная и кожная температура регистрировалась непрерывно с помощью термопар и комплекса системы "BIOPAC" ("Biopac Systems Inc."). Подробно методы регистрации описаны ранее. Нетемпературная активация периферического ионного канала TRPM8 проводилась аппликацией на кожу живота (25 см2) 1 мл 1% суспензии ментола (5-methyl-2-[1 methylethyl]cyclohexanol; "Sigma") в физиологическом растворе, длительность аппликации 20 мин. Контрольные животные подвергались 20-минутной аппликации 1 мл чистого физиологического раствора. Животные, подвергавшиеся охлаждению, были декапитированы на пике охлаждения по достижении снижения ректальной температуры на 3.0-3.5°С, т.е. согласно нашим предыдущим исследованиям в момент полного развития термозащитных метаболических и сосудистых реакций. Животные, не подвергавшиеся охлаждению, были декапитированы одновременно с животными, которым предъявлялся холодовый стимул. После декапитации быстро на холодной подложке извлекали головной мозг и выделяли гипоталамус, его деление на передний и задний осуществляли вертикальным сечением по середине образца. Пробы замораживали жидким азотом и хранили при -70°С до выделения суммарной РНК. Экспрессию генов ионных каналов определяли количественным методом ОТ-ПЦР, подробно описанным ранее. Для проверки наличия геномной ДНК в пробах проводили ПЦР с праймерами к генутриптофангидроксилазы 1 (Tph1), который не экспрессируется в головном мозге. Все праймеры, использованные в анализе, были разработаны на основе последовательностей, опубликованных в базе данных "EMBL Nucleotide", и синтезированы в компании "Biosan". Экспрессию исследуемых генов выражали в количестве копий в пересчете на 100 копий гена пептидил-пролил-цис/транс изомеразы А (Ppia), Примесей геномной ДНК в исследуемых пробах при максимальном количестве циклов амплификации обнаружено не было. Были сформированы 4 экспериментальные группы: 1-я—животные, подвергнутые аппликации физиологического раствора (контроль; n=6); 2-я — животные, подвергнутые аппликации суспензии 1% ментола (n=8); 3-я — животные, подвергнутые аппликации физиологического раствора и охлаждению (n=7); 4-я — животные, подвергнутые аппликации суспензии ментола и охлаждению (n=6). Статистическую достоверность полученных результатов оценивали с использованием f критерия Стьюдента для независимых переменных, межгрупповые сравнения проводили с помощью многофакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием post-hoc теста Фишера. Данные представлены в виде среднего значения±ошибка среднего (М±m). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Уровень экспрессии гена Ppia в отделах гипоталамуса контрольных и опытных групп достоверно не различался (р>0.05), что позволило использовать уровень мРНК Ppia в качестве эндогенного стандарта (табл. 1,2). Проведенное исследование подтвердило полученные нами ранее данные о повышенной экспрессии гена ионного канала TRPM8 в переднем гипоталамусе, а генов ионных каналов TRPA1 и TRPV1 — в заднем гипоталамусе. Ранее нами получены данные о влиянии разных типов холодового воздействия на экспрессию генов TRP ионных каналов в гипоталамусе как целой структуре. Поскольку передний и задний отделы гипоталамуса функционально неоднозначны, представлялось важным выяснить локализацию изменений в экспрессии генов Тгр. Глубокое охлаждение, не влияя на экспрессию генов TRP ионных каналов в переднем гипоталамусе, приводило к достоверному изменению экспрессии только гена Trpv3 и только в заднем отделе гипоталамуса — его экспрессия увеличивалась 1.5 раза (табл. 1). Аппликация ментола на кожу вызывала достоверное повышение экспрессии гена Trpv3 в 1.5 раза только в заднем отделе гипоталамуса, для переднего гипоталамуса наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии этого гена (табл. 2). Экспрессия генов других TRP ионных каналов (TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPA1 и TRPM8) не претерпевала изменений ни в переднем, ни в заднем отделе гипоталамуса. Предъявление охлаждающего воздействия в сочетании со стимуляцией периферического ионного канала TRPM8 не приводило к дополнительному повышению экспрессии генов TRP ионных каналов, в том числе и гена ионного канала TRPV3, ни в переднем, ни в заднем гипоталамусе (табл. 2). Таким образом, под влиянием как острого охлаждения, так и аппликации ментола на кожу в гипоталамусе происходят сходные изменения экспрессии генов термочувствительных TRP ионных каналов — в заднем отделе гипоталамуса наблюдается повышение экспрессии гена ионного канала TRPV3. Степень повышения экспрессии гена Trpv3 в заднем гипоталамусе в этих случаях также совпадала. Это может приводить к увеличению количества TRPV3 ионных каналов в клетках заднего гипоталамуса и обусловливать повышение чувствительности нейронов в диапазоне температур функционирования этого ионного канала 31-39°С. От температурной чувствительности нейронов гипоталамуса зависят температурные пороги термозащитных реакций. В этом контексте интересно сопоставить результаты данного и предыдущего исследования с фармакологической активацией периферического ионного канала TRPM8 ментолом и регистрацией терморегуляторных реакций. Показанное в этой работе уменьшение температурных порогов запуска термозащитных реакций после предварительной (перед охлаждением) активации периферического канала TRPM8 ментолом, по-видимому, связано с повышением чувствительности нейронов гипоталамуса к температурным изменениям в диапазоне 31-39°С, обусловленным, в свою очередь, увеличением экспрессии гена ионного канала TRPV3. Ранее мы исследовали экспрессию генов TRP ионных каналов в гипоталамусе у животных при длительной адаптации к холоду и показали, что экспрессия гена ионного канала TRPV3 снижается при длительном действии холода, что согласуется со снижением количества нейронов гипоталамуса, чувствительных в диапазоне 35-39°С (диапазон температур, совпадающий с таковым для ионного канала TRPV3), а также с повышением температурных порогов для терморегуляторных реакций. Таким образом, модуляцию чувствительности нейронов гипоталамуса можно осуществлять за счет изменения активности гена Trpv3, которая зависит от активности ионных каналов периферических афферентных волокон, в данном случае от активности ионного канала TRPM8. Это свидетельствует о важности периферического ионного канала TRPM8 в регуляции активности генов TRP ионных каналов гипоталамуса — ведущей центральной структуры регуляции висцеральных функций, а также о функциональной связи ионных каналов TRPM8, локализованных в периферической нервной системе, и ионных каналов TRPV3, локализованных в центральных структурах мозга.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.141-145. Библ. 14 назв.
Просмотров: 57