ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ И Notch-1 СИГНАЛИНГ КАК МАРКЕРЫ РЕГЕНЕРАЦИИ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ ЭМФИЗЕМЕ ЛЕГКИХ

Аннотация:

Исследовали влияние эластазы, экстракта сигаретного дыма, Д-галактозоамина гидрохлорида и ингибитора тирозинкиназы SU5416 на эндотелиальные прогениторные клетки и предшественники ангиогенеза, а также экспрессию незрелыми эндотелиальными клетками Notch-1. У мышей-самок линии С57В1/6 одновременно с эмфиземой легких различные по механизму действия повреждающие факторы вызывают патологические изменения микроциркуляции и разрушают альвеолярный эндотелий. Д-галактозоамина гидрохлорид нарушает мобилизацию и миграцию в эмфизематозно расширенные легкие эндотелиальных прогениторных клеток с VEGFR (CD45-CD309+) и предшественников ангиогенеза (CD45-CD309+ CD117+). Эластаза ингибирует эндотелиальные прогениторные клетки с VEGFR, экстракт сигаретного дыма — с фенотипом CD4-CD31+CD34+. При моделировании эмфиземы легких эластазой и Д-галактозоамином гидрохлоридом ангиогенез обеспечивается эндотелиальными клетками с фенотипом CD45-CD31+CD34% при введении SU5416 — эндотелиальными клетками с VEGFR, при введении ЭСД — CD31+ зрелыми эндотелиальными клетками. В восстановлении числа поврежденных эластазой и SU5416 незрелых эндотелиальных клеток участвуют Notch-1+ предшественники ангиогенеза и Notch-l+ эндотелиальные прогениторные клетки с VEGFR. Ключевые слова: эндотелиальные прогениторные клетки, Notch-1 сигналит, микрососудистая сеть легких, регенерация, эмфизема легких. В восстановлении микрососудистого русла в эмфизематозно расширенных легких участвуют эндотелиальные клетки из сохранившихся кровеносных сосудов. Обсуждается роль эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) в регенерации альвеолярного эндотелия. В частности, малая продуктивность ангиогенеза при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) объясняется нарушением мобилизации и хоминга в легочную ткань ЭПК из костного мозга. ЭПК представляют собой гетерогенную популяцию клеток. Так, ЭПК человека определяют как CD34+VEGFR2+CD133+ или CD34+VEGFR2+CD45dim. Для идентификации ЭПК также используют ко-экспрессию CD34 и рецептора к FGF-1 или экспрессию CD34 и рецептора к VEGF3. У мышей ЭПК охарактеризованы как Sca-1+c-kit+VEGF2R+. Другие исследовательские группы определяют фенотип незрелых клеток как CD45dim и CD133, CD31, CD144, CD34, CD309. С такой неопределенностью в эндотелиальных маркерах связано отсутствие понимания основ развития дефектов и регенерации альвеолярного эндотелия с участием ЭПК. Усложняет ситуацию и то обстоятельство, что ХОБЛ является следствием хронического воспаления, возникающего в том числе в ответ на усиление протеазной активности, на токсическое действие частиц и газов, травму альвеолярного эндотелия и дефицит а1-антитрипсина. При исследовании ЭПК такое разнообразие этиологических факторов ХОБЛ не учитывается. Целью данного исследования являлось изучение фенотипически разнообразных ЭПК у мышей с эмфиземой легких, индуцированной различными по природе и механизму действия факторами. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Эксперименты проведены на мышах-самках (n=80) линии C57BI/6 в возрасте 8-10 нед. Животные получены из питомника отдела биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д.Гольдберга (квалификационный сертификат имеется). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Исследование одобрено комитетом по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных НИИФиРМ им. Е.Д.Гольдберга. Животных рандомизировали на 4 группы (по 10 особей в каждой): 1-я — эмфизема легких, индуцированная экстрактом сигаретного дыма (ЭСД); 2-я — эмфизема легких, индуцированная эластазой; 3-я — эмфизема легких, индуцированная Д-галактозоамином гидрохлоридом (Д-ГГ), 4-я — эмфизема легких, индуцированная SU5416. Для каждой модели эмфиземы легких был свой контроль, возраст мышей контрольной группы соответствовал возрасту мышей с патологией. ЭСД вводили эндотрахеально на 1,4,7,10,13 и 16-е сутки эксперимента. ЭСД получали из сигарет марки L&M Red Label — 2 сигареты на 1 мл (состав 1 сигареты: смола 10 мг, никотин 0.8 мг, СО 10 мг). Для стандартизации ЭСД проводилось измерение рН и оптической плотности при длине волны 405 и 540 нм. Для индукции воспаления вводили ЛПС (3 мкг/мышь в 50 мкл PBS) эндотрахеально на 0-е и 3-й сутки эксперимента. Эластазу ("Sigma") вводили однократно интратрахеально (0.6 Е/мышь в 30 мкл 0.9% NaCI). Д-ГГ ("Sigma") вводили внутрибрюшинно (100 мг/кг в 100 мкл 0.9% NaCI) на 0,8,16,24,32,40,48,56-й час эксперимента. Ингибитор тирозинкиназы белка-рецептора VEGF SU5416 ("Sigma") вводили подкожно (20 мг/кг в 100 мкл 0.9% NaCI) на 0, 7,14,20-е сутки эксперимента. Первое введение повреждающих факторов принимали за 0-й день эксперимента. Животных 1-й группы и соответствующего контроля выводили из опыта передозировкой СО2 на 45-е сутки, 2-й группы — на 21 -е сутки, 3-й группы — на 3-й сутки, 4-й группы — на 38-е сутки эксперимента. Проводили стандартные гистологические исследования легких с подсчетом площади эмфиземы. Иммуногистохимическое исследование выполняли стрептавидин-биотин-пероксидазным методом по схеме, рекомендуемой производителем, с использованием системы визуализации NOVOLINK ("Novocastra") и моноклонапьных мышиных антител, необходимых для оценки экспрессии на мембране клеток CD16, CD31, панцитокератина. С помощью ИФА исследовали а1-антитрипсин в печени, сыворотке крови и гомогенате легкого согласно инструкции производителя ("Cusabio Biotech Co., Ltd"). Экспрессию мембранных рецепторов мононуклеаров анализировали с использованием мышиных моноклонапьных антител методом проточной цитофлюориметрии. Для анализа использовали прибор "FACSCanto II" с программным обеспечением "FACSDiva" ("BD Biosciences"). Изучали экспрессию клетками крови, легких и костного мозга поверхностных маркеров CD31(АРС), CD34(FITC), CD45(PerCP), CD117(Ре-Су7), CD309(APC) и внутриклеточного маркера Notch-1. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием пакета статистической обработки данных "SPSS 12.0". Вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего арифметического (т), значение вероятности (р). Достоверность различий оценивали с помощью параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Манна—Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Эластаза, ЭСД, Д-ГГ и SU5416 повреждали структуру альвеол и разрушали альвеолярный эпителий (рис. 1). Во всех опытных группах развивалась эмфизема легких, которая была более выражена при назначении эластазы и SU5416 (табл. 1). Эмфизема легких у мышей, индуцированная эластазой и ЭСД, характеризовалась как диффузная, SU5416 и Д-ГГ—как очаговая. Одновременно в легких отмечалось накопление CD16+-клеток, преимущественно макрофагов и лимфоцитов (рис. 1, табл. 2). В группе животных, получавших ЭСД, воспалительный инфильтрат располагался перибронхиально и в просвете отдельных альвеол, при назначении SU5416 — перибронхиально, после введения эластазы клетки воспаления встречались в интерстициальной ткани, в просвете отдельных альвеол и альвеолярных перегородках. Введение Д-ГГ вызывало значительную лимфомакрофагальную инфильтрацию паренхимы легких, в альвеолах обнаруживались небольшие скопления лимфоцитов. Таким образом, введение препаратов вызывало разрушение альвеол, воспаление и эмфизему легких. Симпатокомплекс нарушений в легких в группах с ЭСД и эластазой формируется вследствие прямого действия факторов на альвеолярную ткань. В этих условиях обнаруженное снижение концентрации а1-антитрипсина в легких мышей вторично и обусловлено повреждением альвеолярного эпителия (рис. 1). Как известно, этот гликопротеид синтезируется в печени, тормозит действие трипсина, химотрипсина, эластазы, калликреина, катепсинов и других ферментов тканевых протеаз, депонируется альвеолярными клетками. Между тем Д-ГГ в первую очередь разрушает гепатоциты, что вызывает дефицит а1-антитрипсина и, как следствие, повреждение альвеол. Интересны результаты введения SU5416. Мишенью для SU5416 выступает тирозинкиназа белка-рецептора к VEGF. Интратрахеальное введение ингибитора нарушало кровенаполнение капилляров альвеолярных стенок и разрушало микрососудистую сеть (площадь микрососудистого русла сокращалась на 12% относительно контроля, снижалась экспрессия CD31), и только потом развивались воспаление и эмфизема (табл. 1,2). Патологические изменения микроциркуляции и структуры микрососудистой сети обнаруживались и в других опытных группах. Так, ЭСД вызывал умеренную гиперемию сосудов альвеолярных стенок, запустевание и истончение альвеолярных капилляров, уменьшение количества CD31+-клеток в альвеолах (на 69%; р<0.05). После введения эластазы наблюдалась гиперемия капилляров межальвеолярных перегородок, умеренное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла и капилляров межапьвеолярных перегородок, экспрессия CD31 в легких животных снижалась более чем в 4 раза (р<0.05) по сравнению с контролем. Гиперемия, истончение альвеолярных капилляров и их запустевание, снижение экспрессии CD31 в легких мышей при введении Д-ГГ были менее выражены, чем при введении эластазы и ЭСД (рис. 1, табл. 2). Под влиянием эластазы и Д-ГГ количество CD45-CD31+CD34+ ЭПК в альвеолярной ткани увеличивалось, после введения SU5416 наблюдалось накопление ЭПК с VEGFR (рис. 2, 3). Между тем прироста числа незрелых эндотелиапьных клеток в легких мышей после назначения ЭСД не выявлено. При высокой активности незрелых эндотелиальных клеток разрушение альвеолярного эндотелия во всех опытных группах сохранялось. Это было связано с угнетением ряда прогениторных клеток. Д-ГГ оказывал ингибирующее действие на костномозговые, циркулирующие в крови легочные ЭПК с VEGFR и предшественники ангиогенеза, эластаза — на циркулирующие ЭПК с VEGFR, ЭСД — на циркулирующие предшественники ангиогенеза и CD45-CD31+CD34+ ЭПК. Механизмом действия Д-ГГ выступает нарушение мобилизации и миграции костномозговых незрелых эндотелиальных клеток в эмфизематозно расширенные легкие гуморальными и клеточными факторами воспаления. При этом не исключено снижение выживаемости клеток. Многие исследователи связывают процессы миграции, пролиферации и выживания зрелых эндотелиапьных клеток альвеолярной ткани с сигнальной системой Notch-1. Однако представления о Notch-1 сигналинге незрелых эндотелиальных клеток при ХОБЛ весьма ограничены. При оценке экспрессии маркера Notch-1 незрелыми эндотелиальными клетками эмфизематозно расширенных легких нами был выявлен ряд закономерностей. Так, в опыте с эластазой наблюдалось увеличение относительно контроля числа Notch-1+ предшественников ангиогенеза (на 56%; р<0.05) и Notch-1+ ЭПК с VEGFR (на 495%; р<0.05) в альвеолярной ткани мышей. При повреждении микрососудистого русла SU5416 отмечалось накопление Notch-1+ ЭПК с VEGFR (на 43%; р<0.05). Эти данные позволили сделать вывод о зависимости ангиогенеза при эмфиземе легких от Notch-1 сигналинга незрелых эндотелиальных клеток. Вероятно, с Notch-1+-клетками связано восстановление фракций ЭПК и предшественников ангиогенеза, поврежденных эластазой и SU5416, с последующим их вовлечением в регенерацию эндотелия. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что ЭСД увеличивал на 31.5% относительно контроля фракцию С031+-клеток, экс-прессирующих Notch-1 (р<0.05). С другой стороны, в общей фракции CD31 +-клеток число Notch-1+ ЭПК (CD45-CD31+CD34+) уменьшалось на 32% (р<0.05). Не исключено, что в ранние сроки после токсического действия никотина и смол ангиогенез поддерживается зрелыми эндотелиальными клетками из поврежденной микрососудистой сети легких. Полученные данные позволяют сделать вывод о зависимости механизмов регенерации альвеолярного эндотелия с участием ЭПК и предшественников ангиогенеза от природы эмфиземы легких. Для достижения регенеративного эффекта сначала необходимо провести противовоспалительную терапию и только потом избирательную фармакологическую стимуляцию ЭПК и предшественников ангиогенеза. Следует отметить важность результатов исследования Notch-1 сигналинга. С нашей точки зрения, рецептор Notch-1 незрелых клеток эндотелия выступает потенциальным маркером регенерации микрососудистой сети легких при ХОБЛ.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.157-163. Библ. 13 назв.
Просмотров: 77