ИССЛЕДОВАНИЕ ОКСИДАНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРЕПАРАТА КРУНИДОН IN VITRO И IN VIVO

Аннотация:

Исследовано влияние ионов Fe2+ полимеризованного гемоглобина в составе препарата "Крунидон" и молекулярного гемоглобина ("Sigma") на инициацию ОН*-радикалов в системе Фентона. Установлено, что полимеризованный гемоглобин, входящий в состав крунидона, в отличие от тетрамера гемоглобина не интенсифицирует генерацию ОН*-радикалов. Оксидантный потенциал крунидона in vivo оценивали, используя в качестве биомаркера содержание МДА в плазме крови собак после внутривенного многократного введения (в течение 5 сут в дозе 114 мг/кг). Введение препарата не приводило к статистически значимому увеличению содержания МДА на 1-е и 4-е сутки после воздействия и не влияло на содержание общего белка в плазме крови. Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что гемоглобин полимеризованный в составе препарата "Крунидон" не обладает прооксидантной активностью и может служить основой для разработки неоксигенных форм кровезаменителей. Ключевые слова: кровезаменитель, гемоглобин полимеризованный, крунидон, радикалы ОН+, малоновый диальдегид. Растущая потребность в гемотрансфузиях, дефицит и ограниченная доступность препаратов крови обусловили актуальность создания заменителей крови. Одно из направлений разработки кровезаменителей — создание биосовместимых сред на основе натурального или модифицированного гемоглобина человека и животных, что реализует идею моделирования естественного транспорта кислорода эритроцитами. Инфузии растворов свободного гемоглобина выявили серьезные препятствия к его клиническому применению, в связи с чем были предложены различные способы его химической модификации. Импульсом к разработке кровезаменителей на основе гемоглобина крупного рогатого скота стали безопасность и доступность крови и интересы военной промышленности, ограниченной условиями хранения и отсроченного применения компонентов донорской крови. Американская компания Biopure создала три поколения препарата "Гемопюре" (Hemopure) на основе бычьего гемоглобина, полимеризованного глутаровым альдегидом. Оксиглобин предложен для применения в ветеринарной практике. Гемопюр прошел 22 клинических исследования в США, Европе и ЮАР и в 2001 г. был зарегистрирован в ЮАР. Компанией ООО "НИК Медбиофарм" был разработан препарат "Крунидон" — лиофилизат для приготовления раствора для инфузий, представляющий собой полимеризованный, очищенный бычий гемоглобин, сшитый глутаровым альдегидом, с добавлением декстрозы и аскорбиновой кислоты в качестве стабилизаторов. Важнейшая функция кровезаменителей на основе гемоглобина—газотранспортная. Кислород, играющий ключевую роль в энергетическом обмене живых существ, способен к самопроизвольным неферментативным реакциям одноэлектронного восстановления, приводящим к образованию радикальных и молекулярных АФК. Среди АФК наиболее опасен гидроксильный радикал ОН+, способный окислять с высокой скоростью практически любое органическое и неорганическое соединение клетки, приводя к необратимым, зачастую негативным последствиям. Существенный вклад в генерацию АФК вносят металлы переменной валентности, в том числе ионы железа. Транспорт кислорода к различным тканям млекопитающих осуществляет сложный железосодержащий белок гемоглобин, в структуре которого четыре атома двухвалентного железа, входящих в состав четырех железопорфириновых колец. Уникальным свойством гемоглобина является способность его железа обратимо и без изменения валентности присоединять кислород и переносить его в различные ткани. В то же время имеются данные о том, что в определенных условиях железо порфириновых колец гемоглобина может интенсифицировать пероксидацию липидов, катализировать распад перекисных соединений, приводящих к образованию гидроксильных радикалов ОН*. Известно также, что содержащийся в эритроцитах гемоглобин не токсичен для организма, в то время как не связанный с эритроцитами свободный гемоглобин токсичен и способен нарушать функционирование многих органов и тканей, а также интенсифицировать генерацию АФК и свободнорадикальные реакции ПОЛ. Целью данной работы являлась оценка влияния препарата "Крунидон" на инициирование свободнорадикальных реакций, активированных гемом или ионами железа в составе этого препарата. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Крунидон, действующим веществом которого является полимеризованный бычий гемоглобин, предоставлен для исследования разработчиком. Лекарственная форма препарата "Крунидон" — лиофилизат для приготовления раствора для инфузий, представляет собой лиофилизированный пористый стерильный порошок темно-красного цвета с характерным запахом, горьковатого вкуса. Приготовленный раствор—стерильный, прозрачный, темно-красный, без осадка и взвеси. Для исследования была предоставлена готовая лекарственная форма крунидона следующего состава: активное вещество — гемоглобин полимеризованный 2.0 г; вспомогательные вещества: декстроза 1.79 г; натрия хлорид 0.2 г; кислота аскорбиновая 0.01 г (1 флакон). Исследование влияния крунидона на активацию свободнорадикальных реакций ПОЛ in vitro проводили, используя систему реакций Фентона, согласно которой при взаимодействии с Н202 ион двухвалентного железа окисляется до трехвалентного, катализируя при этом разложение Н202 с образованием гидроксильного радикала: Fe2++H202->Fe3++0H-+0H-. Ингредиентами служили солевой фосфатный буфер, 2-0-дезоксирибоза (3 ммоль/л), Н202 в концентрации 2 ммоль/л. В качестве катализатора распада Н2Ог использовали ионы двухвалентного железа, входящие в состав соли Мора (FeS04-(NH4)2S04-6H20) и крунидона, а также гемоглобина крови быков ("Sigma"). Все препараты, содержащие Fe2+, использовали в концентрации по Fe2+, равной 27.3 мкМ. Реакционную смесь готовили с использованием ФСБ (0.14 моль/л NaCI, 20 ммоль/л фосфатный буфер рН 7.4) и последовательного добавления дезоксирибозы и Н202. Реакцию инициировали внесением в реакционную смесь различных препаратов железа. Пробы в течение 1 ч инкубировали наводя-ной бане при 37°С и приливали 1 мл 3% трихлоруксусной кислоты и 1 мл 1% тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Смесь инкубировали при 100°С в течение 20 мин. Оптическую плотность определяли при 532 нм на спектрофотометре "UV/Vis 2800" ("ЮНИКО-СИС"). Гидроксильный радикал активно реагирует с целевой молекулой дезоксирибозы и индуцирует ее деградацию. Среди конечных продуктов, специфичных для окислительной деградации дезоксирибозы, обнаружен МДА. МДА в кислой среде реагирует с ТБК и, связываясь с двумя молекулами ТБК, образует стойкий окрашенный комплекс. Высокая чувствительность и специфичность реакции продуктов деградации дезоксирибозы с ТБК (ТБК-продукты) стали причиной широкого использования ТБК-продуктов для оценки уровня генерации ОН*-радикалов, МДА имеет максимум поглощения при Х=532 нм и мольный коэффициент экстинкции 156 000 опт. ед. Полученные значения оптической плотности позволили определить концентрацию МДА и оценить пропорциональный этой концентрации уровень генерации ОН*-радикалов. Для оценки оксидантного потенциала крунидона in vivo было исследовано его влияние на уровень пероксидации липидов при введении в организм собак (беспородные собаки-самцы массой 14.7±2.48 кг). Кровь брали из подкожной вены голени животных. Плазму крови получали до введения и на 1 -е и 4-е сутки после завершения 5-кратного ежедневного внутривенного введения крунидона в дозе 114 мг/кг (по гемоглобину полимеризованному). Определение концентрации МДА в плазме крови проводили с использованием КМn04 и FeSO4 по методу. Концентрация белка определена биуретовым методом с применением коммерческого набора (ООО "Агат-Мед"). Для статистической обработки полученных результатов применялись методы параметрической и непараметрической статистики. Достоверность различий между группами оценивалась с помощью t критерия Стьюдента и U критерия Манна—Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Одним из потенциальных источников токсичности кровезаменителей на основе гемоглобина является гем или ионы железа, освободившиеся при окислении гемоглобина. Ионы железа катализируют химические реакции, в результате которых с участием анион-радикала кислорода (реакция Хабер— Вейса) и Н2О2 (реакция Фентона), а также органических перекисей происходит образование активных гидроксильных радикалов ОН*, являющихся химической основой возникновения свободнорадикальных патологий. Анализ влияния лекарственных и биологически активных соединений на генерацию in vitro гидроксильных радикалов может служить показателем как прооксидантной активности изучаемых соединений, так и их антирадикальной активности, снижающей уровень генерации этого токсического радикала, способного повреждать клеточные мембраны, ДНК, белки, липиды. Ионы двухвалентного железа соли Мора активировали генерацию радикала ОН*, увеличивая при этом содержание ТБК-продуктов (рисунок). В то же время железо, входящее в состав гемоглобина препарата "Крунидон", статистически значимо не влияло на генерацию радикала ОН*. В отличие от крунидона, гемоглобин ("Sigma") повышал уровень генерации радикала ОН*, увеличивая при этом содержание ТБК-продуктов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что по сравнению с гемоглобином ("Sigma") гемоглобин полимеризованный, входящий в состав крунидона, менее токсичен и не интенсифицирует в системе Фентона генерацию гидроксильных радикалов ОН*. Для оценки оксидантного потенциала крунидона in vivo было исследовано его влияние на уровень пероксидации липидов при введении препарата в организм собак. Увеличение концентрации продуктов ПОЛ рассматривается как универсальный механизм повреждения клетки при различных патологических состояниях, поэтому содержание продуктов ПОЛ в организме может быть использовано в качестве биомаркера для оценки влияния лекарственных средств и биологически активных соединений на уровень антиоксидантной защиты. Наиболее часто в качестве биомаркера пероксидации липидов используют МДА. Наряду с фосфолипидами альбумины играют важную роль в формировании антиоксидантных и прооксидантных свойств плазмы крови и могут быть связаны с процессами хронических нарушений. В связи с этим целесообразно исследовать влияние внутривенного введения крунидона на содержание в плазме крови собак не только МДА, но и общего белка, который в основном представлен в плазме альбумином. Крунидон растворяли в физиологическом растворе и вводили собакам опытной группы внутривенно многократно (в течение 5 сут) в дозе 114 мг/кг, что соответствует максимальной суточной терапевтической дозе 8 г на человека. До введения и на 1-е и 4-е сутки после введения препарата в плазме крови определяли концентрации МДА и общего белка. Пятикратное ежедневное введение препарата не приводило к статистически значимому увеличению маркера оксидативного стресса МДА в плазме крови (таблица). Также существенно не изменялось содержание общего белка в плазме крови. Эти результаты могут свидетельствовать об отсутствии негативного воздействия крунидона на организм. Известно, что внеэритроцитарный гемоглобин способен интенсифицировать генерацию АФК и свободнорадикальные реакции ПОЛ. В работе установлена прямая количественная зависимость между дозой свободного гемоглобина и образованием ТБК-продуктов в сложной системе реакции ПОЛ in vitro. Свободный гемоглобин легко подвергается аутоокислению, в результате которого гемовое железо переходит из двухвалентного состояния в трехвалентное. Близость свободного гемоглобина к эндотелиальным источникам NO, а также недостаточность естественной антиокислительной защиты создают предпосылки для запуска каскада реакций образования свободных радикалов, активации ПОЛ и включения других механизмов цитотоксичности и воспаления. Другие факторы — присутствие фрагментов стромы эритроцитов, низкая стабильность тетрамеров, которые в течение нескольких часов после инфузии диссоциируют до низкомолекулярных димеров, превращение в метгемоглобин, быстрая элиминация гемоглобина из кровотока — также способствуют токсичности растворов свободного гемоглобина. Эффективным способом устранения указанных негативных явлений может считаться полимеризация, примененная при разработке препарата "Крунидон". Было установлено, что многократное внутривенное введение небольших количеств (48 и 60 мг/кг) очищенного человеческого гемоглобина крысам Sprague-Dawley приводило к статистически значимому увеличению концентрации МДА и 4-гидроксиноненала в плазме крови. Полученные нами результаты по введению свободного от эндотоксинов полимеризованного гемоглобина собакам свидетельствуют, что примененная терапевтическая доза крунидона не вызывает инициацию свободнорадикальных реакций ПОЛ по данным содержания МДА в плазме крови. Результаты проведенных in vitro и in vivo исследований позволяют сделать вывод о том, что гемоглобин полимеризованный в составе препарата "Крунидон" не обладает прооксидантной активностью и может служить основой для разработки неоксигенных форм кровезаменителей.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.170-173. Библ. 15 назв.
Просмотров: 133