Поиск | Личный кабинет | Авторизация |
ОЦЕНКА ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ TUSSILAGO FARFARA L. В УСЛОВИЯХ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ НА КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА И ЭПИТЕЛИЯ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА "ДНК-КОМЕТ"
Аннотация:
Методом ДНК-комет установлено, что применение полисахаридов Tussilago farfara L. приводит к уменьшению уровня апоптоза и ДНК-повреждений, вызванных полихимиотерапией, в клетках костного мозга и эпителия тонкого кишечника мышей линии С57В1/6, что свидетельствует о генопротективных и защитных свойствах полисахаридов. Ключевые слова: полихимиотерапия, полисахариды, ДНК, костный мозг, тонкий кишечник. В настоящее время разрабатываются и внедряются в клиническую практику новые схемы и режимы комбинированной цитостатической терапии. Препараты платины входят в стандарты лечения злокачественных опухолей с различной локализацией. Так, схемы полихимиотерапии с цисплатином применяются для лечения рака легкого, яичников, желудка, шейки матки и другой онкологической патологии. Агрессивное воздействие цитостатической терапии приводит к повреждению ДНК не только в клетках опухоли, но и в здоровых клетках, обладающих высокой пролиферативной активностью, в частности, костного мозга и тонкого кишечника. Поэтому возникает необходимость в поддерживающей терапии, позволяющей предупредить или уменьшить проявления нежелательных побочных эффектов противоопухолевого лечения. Перспективными агентами для коррекции ДНК-нарушений, вызванных антибластомными средствами, являются полисахариды. В ранее проведенных исследованиях показано, что совместное применение полисахаридов Tussilago farfara L. (мать-и-мачехи обыкновенной) и цитостатиков в условиях монохимиотерапии снижает гематологическую токсичность, способствует повышению устойчивости печени и слизистой оболочки тонкого кишечника к действию противоопухолевых препаратов, повышает противоопухолевое и антиметастатическое действие цитостатиков. Целесообразным является изучение корректорных свойств этих веществ в условиях полихимиотерапии. Необходимость проведения таких исследований диктуется тем, что полихимиотерапевтическое воздействие представляет собой более адекватную клиническим условиям модель цитостатического лечения, так как онкологические пациенты, как правило, получают одновременно два и более антибластомных средства. Цель данной работы — изучить возможность снижения степени повреждения ДНК и уровня апоптоза в клетках костного мозга и эпителия тонкого кишечника мышей с помощью полисахаридов Tussilago farfara L. на фоне полихимиотерапии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Эксперименты выполнены на мышах-самцах линии C57BI/6 массой 19-20 г первой категории разводки лаборатории экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д.Гольдберга (сертификат качества № 188-05). Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Исследование проведено в соответствии с требованиями лабораторной практики (GLP), Приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. "Об утверждении правил лабораторной практики", ФЗ "О лекарственных средствах" (ст. 36), "Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ". Методы выделения и изучения химической структуры полисахаридов Tussilago farfara L. (моносахаридный состав, определение содержания уроновых кислот) разработаны на базе Центра внедрения технологий и лаборатории инновационных фармацевтических технологий СибГМУ (Томск). Данный полисахаридный комплекс состоит из двух основных компонентов: рамногалактуронана I (33%) и нейтральных полисахаридов (67%), представленных суммой арабиногалактана, рамнана и гапакторамнана. В ранее проведенных исследованиях лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д.Гольдберга установлено, что наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдается при внутрибрюшинном введении полисахаридов, в отличие от внутрижелудочного, при котором наступление фармакологического эффекта лимитируется физиологическими особенностями живого организма, кроме того, он снижается за счет биотрансформации действующего вещества пищеварительными ферментами. Механизм действия препаратов полисахаридной природы может реализоваться опосредованно, через клетки иммунной системы, в частности макрофаги, которыми богата внутрибрюшинная жидкость. При внутрибрюшинном введении лекарственные препараты быстро адсорбируются клетками брюшной полости, проникая через стенки брюшины, густо пронизанные кровеносными сосудами, что способствует наступлению терапевтического эффекта в кратчайшие сроки. Кроме того, установлено, что биологическая активность полисахаридов при внутрибрюшинном введении не снижается относительно внутривенного, что позволяет экстраполировать полученные результаты на ситуацию в клинике и рекомендовать внутривенный путь для клинических исследований в качестве основного способа введения. Полисахариды вводили животным курсом ежедневно в течение 14 сут до введения цитостатиков, внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг. На 15-е сутки после начала лечения полисахаридами животным трижды (через день), внутрибрюшинно вводили цитостатические препараты в комбинациях цисплатин+паклитаксел и цисплатин+иринотекан. Иринотекан ("Veropharm") использовали в дозе 10 мг/кг, цисплатин ("Teva") — 2.5 мг/кг, паклитаксел ("Dr. Reddy's Laboratories Ltd.")—12 мг/кг, интервал между введением каждого цитостатика составлял 20 мин. Для оценки генопротективных свойств полисахаридов на фоне полихимиотерапии использовали метод "ДНК-комет" в щелочной версии в соответствии с рекомендациями. Мышам контрольной группы (негативный контроль) вводили эквивалентный объем физиологического раствора. В качестве позитивных контролей использовали мышей, которым внутрибрюшинно вводили комбинации противоопухолевых препаратов. Через 3 ч после последнего введения цитостатиков животных выводили из эксперимента методом дислокации шейных позвонков, выделяли бедренные кости и эпителий тонкого кишечника. Эпифизы бедренных костей срезали и вымывали клетки костного мозга 2 мл предварительно охлажденного до 4°С ФСБ, содержащего 20 мМ ЭДТА-Na2, и 10% ДМСО рН 7.5. Тонкий кишечник измельчали в стеклянной пробирке в 3 мл ФСБ и раздавливали стеклянной палочкой. Пробирки выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов, после чего 1.5 мл верхнего слоя переносили в новую пробирку. Суспензии клеток в объеме 60 мкл вносили в пробирки с 240 мкп 0.9% раствора легкоплавкой агарозы (tплавл <42°С) в ФСБ, подогретого до 42°С (микротермостат "Термит"), и ресуспензировали. Затем 60 мкл раствора агарозы с клетками наносили на предварительно покрытые 1% универсальной агарозой предметные стекла, покрывали покровным стеклом и помещали на лед. Все проводимые в дальнейшем операции осуществляли в затемненном помещении при желтом свете. После затвердевания агарозы (около 10 мин) покровные стекла осторожно удаляли, микропрепараты помещали в стеклянную кювету (тип Шиффердекер), заливали предварительно охлажденным до 4°С лизирующим буфером (10 мМ tris-HCI рН 10.0, 2.5 М NaCI, 100 мМ ЭДТА-№2, 1% Тритон Х-100, 10% ДМСО) и инкубировали не менее 1 ч. После окончания лизиса микропрепараты переносили в камеру для электрофореза (Sub Cell GT, "Bio-Rad"). Камеру заполняли буфером для электрофореза (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА-1Ма2, рН>13). Приготовленные микропрепараты инкубировали в течение 20 мин для реализации щелочно-лабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК, затем проводили электрофорез в течение 20 мин при напряженности поля 1 В/см и силе тока -300 мА. По окончании электрофореза микропрепараты перемещали в стеклянную кювету и фиксировали в 70% растворе этилового спирта (время фиксации 15 мин). После фиксации микропрепараты высушивали и хранили до начала микроскопирования. Непосредственно перед микроскопированием препараты окрашивали флюоресцирующим красителем SYBR Green I (1:10 ООО в ТЕ-буфере с 50% глицерином) в течение 20 мин в темноте. Анализ проводили на флюоресцентном микроскопе ("Микромед 3 Люм"), совмещенном с цифровой камерой высокого разрешения, при увеличении 200. Полученные с микропрепаратов изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения "CometD". В качестве показателей повреждения ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте комет (%ДНК в хвосте); гибель клеток оценивали по процентному содержанию апоптотических ДНК-комет (% апоптотических ДНК-комет). С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью t критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: В ранее проведенных исследованиях было показано, что при использовании цисплатина в сочетании с иринотеканом лимитирующей является гастроинтестинальная токсичность, тогда как при введении цисплатина с паклитакселом в большей степени проявляется повреждающее действие цитостатической терапии на систему крови. В связи с этим для оценки защитного действия полисахаридов Tussilago farfara L. на клетки костного мозга использовали схему полихимиотерапии цисплатин+паклитаксел, а на клетки эпителия тонкого кишечника — цисплатин+иринотекан. У животных группы негативного контроля на микропрепаратах клеток тонкого кишечника (рисунок, а) и костного мозга регистрировались в основном ДНК-кометы, характерные для неповрежденных клеток: с яркой сферической формой без хвоста. При ведении животным комбинаций цитостатиков на микропрепаратах как клеток костного мозга, так и тонкого кишечника (рисунок, б) обнаружено возрастание ДНК-комет, характерных для поврежденных клеток: с ярким ядром и хорошо заметным "хвостом". Картина клеток, образующих ДНК-кометы в костном мозге и тонком кишечнике животных (рисунок, б), получавших совместно с противоопухолевыми препаратами полисахариды, практически не отличалась от таковой в негативном контроле: регистрировались ДНК-кометы, характеризующие клетки с минимальными ДНК-повреждениями. Известно, что помимо основного механизма действия противоопухолевых препаратов повреждающим фактором при цитостатическом воздействии на клетки является нарушение окислительно-восстановительного баланса, что сопровождается усиленной активацией процесса ПОЛ и приводит к нарушению целостности и разрушению клеточных мембран. Истощение антиоксидантных ресурсов в нормальных тканях организма приводит к состоянию окислительного стресса. При взаимодействии АФК с ДНК появляются нарушения внутринуклеотидных связей, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, а также образование аддуктов ДНК, т.е. возникают первичные повреждения ДНК. Такие показатели ДНК-повреждений, как %ДНК в хвосте кометы и % апоптотических ДНК-комет клеток костного мозга и эпителия тонкого кишечника у животных, получавших полихимиотерапию, были значимо выше по сравнению с негативным контролем. Установлено, что показатель ДНК-повреждений клеток тонкого кишечника в группе животных, леченных по схеме цисплатин+иринотекан, был выше в 1.7 раза, а число апоптотических клеток — в 2.2 раза по сравнению со значениями негативного контроля (р<0.01). Процентное содержание ДНК в хвосте комет и апоптотических ДНК-комет в клетках костного мозга животных, получавших цисплатин и паклитаксел, было выше по сравнению с показателями негативного контроля в 3.2 и 2.2 раза соответственно (р<0.01; таблица). В то же время при совместном с цисплатином и иринотеканом введении полисахаридов % ДНК в хвосте комет и % апоптотических ДНК-комет в клетках эпителия тонкого кишечника был достоверно ниже (в 1.4 и 1.5 раза соответственно), чем при полихимиотерапии. В клетках костного мозга животных, леченных по схеме "цисплатин+паклитаксел" в комбинации с полисахаридами, % ДНК в хвосте комет был ниже в 10.9 раза, а % апоптотических ДНК-комет — в 6.7 раза по сравнению с соответствующим позитивным контролем (р<0.01; таблица). В литературе имеются данные об эффективности использования полисахаридов в качестве антиоксидантов как в эксперименте, так и в клинической практике. Вероятно, защитное действие полисахаридов на клетки костного мозга и тонкого кишечника связано с их антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами за счет подавления ПОЛ. Другой возможный механизм защитного действия полисахаридов может быть обусловлен их способностью стимулировать синтез нуклеиновых кислот и белков. При введении полисахаридов в клетках возрастает количество белка посредством увеличения в них синтеза РНК и ДНК, что приводит к усилению синтетических процессов и активации обмена веществ, а это, в свою очередь, способствует усилению процесса репарации. Известно, что наиболее значимым результатом соматических мутаций является увеличение риска возникновения злокачественных новообразований и нарушение иммунитета, в связи с этим стоит отметить иммуномодулирующие свойства полисахаридов как возможный механизм антигенотоксической активности. Таким образом, добавление в схемы полихимиотерапии цисплатин+иринотекан и цисплатин+паклитаксел полисахаридов Tussilago farfara L. приводит к уменьшению ДНК-повреждений в клетках костного мозга и тонкого кишечника, что свидетельствует о генопротективных свойствах полисахаридов.
Авторы:
Сафонова Е.А.
Издание:
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.174-178. Библ. 15 назв.
Просмотров: 59