ПРЕНАТАЛЬНАЯ СЕНСОРНАЯ СТИМУЛЯЦИЯ ИНДУЦИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА НЕЙРОТРОФИНА BDNF В МОЗГЕ И ПОТЕНЦИРУЕТ СОЗРЕВАНИЕ ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ПРЕДПОЧТЕНИЯ У ЦЫПЛЯТ

Аннотация:

Исследовали эффекты световой и звуковой стимуляции эмбрионов курицы на экспрессию генов транскрипционных факторов c-Fos и Egr-1 и нейротрофина BDNF в мозге и созревание видоспецифического поведения следования новорожденных цыплят за матерью. Пренатальная стимуляция постоянным светом повышала предпочтение цыплятами "естественного" объекта, т.е. обладала эффектом прайминга. c-Fos и Egr-1 экспрессировались в мозге 19-дневных эмбрионов на высоком базальном уровне, и ни световая, ни звуковая стимуляция не влияла на количество c-Fos и Egr-1 экспрессирующих клеток. BDNF также имел обширную базальную экспрессию, но при этом световая и звуковая стимуляция дополнительно индуцировала мРНК BDNF в структурах мозга, связанных с формированием предпочтения при импринтинге. Полученные результаты указывают на возможность вовлечения BDNF в эффекты пренатального сенсорного прайминга на развитие видоспецифического поведения. Ключевые слова: BDNF, прайминг, импринтинг, цыплята, мозг Способность новорожденных животных к распознаванию и предпочтению родителей является важнейшим адаптивным механизмом, обеспечивающим выживание потомства в естественной среде. Формирование прочной привязанности и поведения следования у новорожденных детенышей зрелорождающихся животных происходит в процессе импринтинга, в результате которого новорожденный запоминает характеристики матери. Хотя новорожденные цыплята в процессе импринтинга одинаково успешно обучаются следовать за "естественным" и "искусственным" объектом, после некоторых видов неспецифических воздействий у них развивается выраженное предпочтение "естественного" объекта. Такие воздействия, способные инициировать развитие видоспецифического зрительного предпочтения, были обозначены термином "прайминг". Ранее мы показали, что праймирующее действие оказывает двигательная активность или звуковая стимуляция новорожденных цыплят, причем этот эффект опосредуется экспрессией гена транскрипционного фактора c-Fos в ряде областей мозга. Цель данной работы — проверить, можно ли осуществить пренатальный прайминг эмбрионов курицы путем их стимуляции светом или звуком, а также исследовать возможность вовлечения в этот процесс транскрипционных факторов c-Fos и Едг-1 и гена нейротрофина BDNF (brain-derived neurotrophic factor). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Пренатальный прайминг. Куриные эмбрионы (Gallus gallus domesticus) породы Ломанн Браун доставляли с птицефабрики в возрасте 10-15 дней и помещали в светоизолированные лабораторные инкубаторы. На 19-й день инкубации (Е19) часть эмбрионов подвергали стимуляции постоянным светом (освещенность на поверхности яиц около 2000 люкс) или звуком (запись музыкальных фрагментов с частотой 100-5500 ГЦ и громкостью 50-98 дБ). Длительность стимуляции составляла 4 ч (для анализа и поведения экспрессии BDNF) или 1.5 ч (для анализа экспрессии c-Fos и Egr-1). Поведение. Эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.), а также "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (ФГБУ НИИНФ им. П.К.Анохина, протокол № 1 от 3.09.2005 г.). После окончания стимуляции эмбрионы помещали в индивидуальные боксы, где цыплята вылуплялись и содержались до тестирования. Тестирование предпочтения проводили в возрасте 30±8 ч, одновременно предъявляя цыпленку два объекта — "естественный" (чучело курицы) и "искусственный" (цилиндр). Цыпленка помещали во вращающееся "беличье" колесо (радиус 14 см, ширина 13 см) в затемненном помещении. Колесо стояло в середине арены, в противоположных концах которой находились освещенные вращающиеся объекты. Тестирование продолжалось 20 мин, число оборотов колеса регистрировали автоматически. Коэффициент предпочтения рассчитывали для каждого цыпленка как отношение числа оборотов колеса в сторону курицы к общему числу оборотов за время тестирования; полученные коэффициенты усреднялись для каждой группы. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью теста ANOVA для выборок, различающихся между собой по одному параметру. Анализ экспрессии. Немедленно по окончании сенсорной стимуляции эмбрионы извлекали из яйца, декапитировали и извлекали мозг. Детекцию белков c-Fos и Egr-1 проводили иммуногистохимически на криостатных срезах (20 мкм) с первичными антителами кролика ("Santa Cruz") и вторичными антикроличьми антителами козы (Vectastain Elite ABC Kit; "Vector Labs"). Визуализацию проводили диаминобензидином ("Sigma"). Детекцию мРНК гена BDNF проводили методом нерадиоактивной in situ гибридизации с РНК-зондом, синтезированным путем транскрипции in vitro в присутствии меченного дигоксигенином уридинтрифосфата по протоколу производителя (DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7); "Roche"). ДНК-матрица для синтеза была предоставлена проф. В.Бухманом и Н.Нинкиной (Университет Кардиффа, Великобритания). Гибридизация проводилась по стандартному протоколу, после чего срезы инкубировали с антителами к дигоксигенину, связанными с щелочной фосфатазой, и визуализировали экспрессию субстратом щелочной фосфатазы ("Roche"). Все срезы оцифровывали под микроскопом "Olympus" ВХ50 с помощью системы TurboScan ("Objective Imaging Ltd"). Экспрессию анализировали в структурах зрительной и слуховой систем, а также в областях, связанных с импринтингом. Количественный анализ проводился в программе "Image Pro Plus 3.0" ("Media Cybernetics"). Вычисляли плотность экспрессии как отношение числа меченых клеток в выбранной области к площади области в мм2. Статистическую обработку полученных данных проводили в программе "Statisti-са 6.0" (критерии Крускала—Уоллиса и Манна—Уитни). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Поведение. Стимуляция эмбрионов не изменяла двигательной активности цыплят в колесе: общее число оборотов за время тестирования в стимулированных группах не отличалось от контроля. В то же время число оборотов колеса в сторону "естественного" объекта было достоверно выше в группе, получавшей световую стимуляцию, по сравнению с группами контроля и звуковой стимуляции (рис. 1, а). Коэффициент предпочтения "естественного" объекта в группе световой стимуляции также был достоверно выше, чем в двух других группах (рис. 1, б). Известно, что у эмбрионов куропатки праймирующее воздействие оказывает освещение эмбрионов в течение 10 мин в час в последний день инкубации. У цыплят световая стимуляция эмбрионов в возрасте Е17-Е19 имеет критическое значение для развития мозга, в частности, приводит к развитию морфологической асимметрии зрительной проекции и определяет функциональную латерализацию ряда функций мозга. Важно отметить, что в естественных условиях эмбрионы получают световую стимуляцию через скорлупу и оболочки яйца. Как показывают полученные нами результаты, эта стимуляция ускоряет созревание видоспецифического поведения следования за матерью у цыплят, необходимого для выживания новорожденного. Звуковая стимуляция в наших экспериментах не влияла на врожденное зрительное предпочтение. В то же время показано, что постоянная стимуляция эмбрионов музыкальными фрагментами (с Е17 до конца инкубации, в течение 15 мин каждый час) приводит к усилению как зрительного, так и акустического предпочтения видоспецифического объекта. По-видимому, краткосрочная (4 ч) акустическая экспозиция в наших экспериментах была недостаточна для влияния на процессы развития. С другой стороны, в наших предыдущих экспериментах такой стимуляции было достаточно для получения праймирующего эффекта у новорожденных цыплят. Отсутствие аналогичного эффекта в эмбриональном периоде может быть связано с меньшей степенью зрелости мозга, в частности, слуховой системы. Экспрессия c-Fos и Egr-1. Клетки, содержащие белки транскрипционных факторов c-Fos и Egr-1, были обнаружены у эмбрионов всех групп в областях переднего мозга, относящихся к зрительной системе (апикальный гиперпаллиум, НА; денсоцеллюлярный гиперпаллиум, HD) и связанных с импринтингом (медиоростральный нидопаплиум/вентральный гиперпаллиум, MNH; промежуточный медиальный мезопаллиум, IMM). Количественный анализ плотности экспрессии не выявил различий между стимулированными и контрольными животными ни в одной из структур. Высокий базальный уровень экспрессии в структурах переднего мозга и отсутствие эффекта стимуляции предполагают, что в этом периоде экспрессия c-Fos и Egr-1 связана с эндогенными процессами развития, а не вызванной пластичностью. Ранее было показано, что звуковая стимуляция эмбрионов способна модулировать экспрессию c-Fos в слуховых ядрах ствола мозга в возрасте Е20, но основные изменения в уровне экспрессии связаны с эндогенными процессами развития. Отсутствие подобной модуляции в наших экспериментах может быть связано с более поздним созреванием переднего мозга по сравнению со стволовыми структурами. Экспрессия BDNF. Нейротрофин BDNF вовлекается в обеспечение критических периодов развития зрительной системы, причем его действие в развивающейся нервной системе осуществляется зависящим от активности нейронов способом. Мы обнаружили высокий базальный уровень мРНК BDNFв ряде структур мозга 19-дневных эмбрионов цыплят (НА, HD, IMM, MNH, гиппокамп). Выявлены также структуры, в которых BDNF-положительные клетки отсутствовали у контрольных эмбрионов и появлялись у эмбрионов, подвергавшихся стимуляции. Так, свет индуцировал экспрессию BDNF в таламических ядрах, относящихся к тектофугальному и таламофугальному зрительным путям и в латеральном нидопаплиуме — области, получающей конвергентные входы от обоих путей. Звуковая стимуляция вызывала экспрессию BDNF в латеральном спириформном ядре среднего мозга, относящемся к слуховой проекции. Количественный анализ выявил достоверное увеличение уровня экспрессии у стимулированных светом или звуком эмбрионов в области MNH, играющей ключевую роль в акустическом импринтинге (рис. 2). Ранее было показано, что постоянная звуковая стимуляция с 10-го дня инкубации приводит к увеличению размеров ядер нейронов MNH и большему количеству нейронов, экспрессирующих Са2+-связывающие белки. У стимулированных светом эмбрионов была также выявлена асимметричная индукция экспрессии в области HD, относящейся к зрительному Wulst — высшей проекции таламофугального пути (рис. 3). Известно, что световая стимуляция 17-19-дневных эмбрионов в течение 2.5 ч приводит к асимметрии таламофугального пути с большим количеством входов в Wulst левого полушария. Повышенная экспрессия BDNF в левом HD эмбрионов после стимуляции светом предполагает вовлеченность этого нейротрофина в процессы установления и стабилизации таламопаллиальных связей в созревающей зрительной системе эмбриона. Кроме того, известно, что базальный уровень мРНК BDNF в области HD цыплят максимален в день вылупления. Зрительный импринтинг индуцирует экспрессию BDNF в HD и НА, а введение рекомбинантного белка BDNF в HD усиливает импринтинг. Постоянная видоспецифическая звуковая стимуляция эмбрионов цыплят начиная с Е17 приводит к асимметричному возрастанию уровня экспрессии BDNF в области Wulst. Совокупность этих и полученных нами данных свидетельствует в пользу предположения о вовлечении BDNF в процессы формирования избирательных нейрональных связей, обеспечивающих развитие родительской привязанности у цыплят как за счет облегчения их обучения признакам матери (импринтинга), так и ускорения созревания их видоспецифического предпочтения посредством неспецифических воздействий (прайминга). Таким образом, полученные нами результаты показали, что 4-часовая стимуляция эмбрионов постоянным светом на 19-й день инкубации обладает праймирующим действием, ускоряющим созревание видоспецифического поведения следования новорожденных цыплят за матерью. В отличие от постнатального прайминга, эти процессы не были связаны с активацией экспрессии транскрипционных факторов c-Fos и Egr-1. Вместе с тем вызванная сенсорной стимуляцией экспрессия гена нейротрофина BDNF в специфических областях мозга указывает на возможное существование BDNF-опосредованных механизмов в феномене пренатального прайминга.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.186-190. Библ. 14 назв.
Просмотров: 49