ТОЧНОСТЬ ПЕРВОГО ЭТАПА ИССЛЕДОВАНИЯ НА ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМЫ DROSOPHILA MELANOGASTER

Аннотация:

Оценивали генотоксические эффекты гетероциклических соединений на основе генетико-токсикологических характеристик биологической модели Drosophila melanogaster. Используя показатели жизнеспособности (плодовитость, летальность потомства), определили, что из шести тестируемых веществ наименьшим токсическим эффектом обладает вещество № 3. Применение веществ № 1 и № 5 в используемых концентрациях не позволило получить достаточное количество жизнеспособных особей для проведения дальнейшего анализа, что свидетельствует об их высокой токсичности. Интенсивность апоптоза наблюдали при воздействии веществ № 2, № 4 и № 6. Оптимальным по параметрам токсичность/уровень апоптоза является вещество № 4 (низкая токсичность/высокий уровень апоптоза), тогда как вещество № 3 обладает общим низким уровнем токсичности, что отмечалось в виде заниженных показателей апоптоза. Ключевые слова: хиноксалины, анастезин, пефлоксацин, генотоксичностъ, Drosophila melanogaster. Генотоксины — химические соединения, которые могут проявлять высокую потенциальную мутагенную или канцерогенную активность — можно встретить практически в любой сфере жизни человека. Многие вещества, с которыми человек сталкивается в повседневной жизни (лекарства, косметические средства, инсектициды, гербициды, различные удобрения и др.), обладают генотоксической активностью. Распространение в окружающей среде веществ с такими свойствами может приводить к повышению частоты мутаций и увеличению риска возникновения различного рода заболеваний у человека, в том числе опухолевых. Одним из этапов проверки является применение различных тест-систем, в том числе и Drosophila melanogaster, которая благодаря сходству многих биохимических путей и ферментов с таковыми у млекопитающих является модельным объектом для изучения большого количества человеческих заболеваний. Поступая в организм Drosophila melanogaster, генотоксины действуют на ее репродуктивную систему. Цель данной работы — определить точность оценки генотоксичности веществ, которые только предполагается использовать в медицине, а также уже вполне успешно применяются для лечения, посредством первой тест-системы Drosophila melanogaster. Для этого измеряли показатели жизнедеятельности: плодовитость, частоту доминантных летальных мутаций и изменение интенсивности апоптоза в крыловых имагинальных дисках Drosophila melanogaster на примере дикого типа Oregon-R. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Для анализа генотоксичности использовали растворы следующих веществ в 2.5% ДМСО: № 1 (хиноксалин-2-ОН), № 2 (6,7-дифторхиноксалин), № 3 (6-амино-1,3-диметилпиримидин-2,4-дион), № 4 (1,3-диметилпиридопиримидин-2,4-дион), № 5 (этил 4-аминобензоат, или анастезин), № 6 (1-этил-6-фтор-7-(4-метилпиперазин-1 ил)-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиноксалин-3-карбоновая кислота или пефлоксацин). Дозы, условные обозначения, формулы и концентрации исследованных веществ приведены в таблице 1. Объектом исследования служили личинки второго возраста дикой линии Oregon-R. Определение ЛД для подвергшихся воздействию особей проводили следующим образом: личиночную смертность оценивали по общему количеству пупариев, а смертность на стадии куколки определяли по количеству (в процентах от общего количества пупариев) вылупившихся на момент завершения периода развития имаго. Определение фертильности проводили в течение 14 сут. Аналогичный опыт был проведен для контроля (расвор, содержавший только ДМСО). Использовали по 1500-1800 личинок на каждый опыт. Всего для анализа мутагенной активности веществ использовали до 23 пар имаго дрозофил. Изменение интенсивности апоптоза определяли с помощью флюоресцентной микроскопии (микроскоп "Leica" DM500 В). Перед этим для начала под бинокуляром проводили выделение крыловых имагинальных дисков из личинок, после чего использовали метод окрашивания клеток 0.1% раствором акридинового желтого. Критериями для распознавания клеток, вступивших в апоптоз, служили такие морфологические признаки, как конденсация хроматина, уплотнение и блеббинг (пузырение) цитоплазмы. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Результаты определения ЛД показали, что вещества №4, №5 и №6 индуцируют доминантные летальные мутации, превышающие среднее число доминантных летальных мутаций в контрольной группе (86.17,87.13 и 81% против 68.56%). Под воздействием вещества № 3 среднее LD несколько снизилось по сравнению с контрольной группой (65.5 и 68.56%) и оказалось значительно ниже средних показателей LD, индуцированных веществами №4, №5 и №6 (табл. 2). Число доминантных мутаций, индуцированных веществами №1 и №2, требует уточнения, так как выживших пар особей для составления выборок оказалось недостаточно для проведения анализа. Наибольшей плодовитостью характеризовались особи D. melanogaster, личиночный период жизни которых прошел в среде, содержащей вещество №3. Средняя индивидуальная плодовитость (СИП) указанных особей соизмерима с таковой у дрозофил из контрольной группы (6.25 к 6.24 в контроле) (рис.1). Вероятно, это вещество обладает наименьшей генотоксичностью в отношении анализируемых параметров. Наименьшие показатели плодовитости были отмечены у особей, выращенных в среде с добавлением вещества №6 (средний показатель СИП 3.18). Анализ плодовитости особей, личиночный период жизни которых прошел в средах с добавлением веществ №1, №2 и №5, не проводили из-за высокого процента гибели на постэмбриональной стадии. Можно предположить, что эти вещества проявляют такую сильную токсичность, что при добавлении их в той же концентрации, что и веществ №3, №4 (50 мкг) и №6 (25 мкг), особи не доживают до стадии имаго, погибая на разных этапах развития, что предполагает уменьшение их концентрации при дальнейших исследованиях. Более интенсивным апоптозом характеризовались крыловые имагинальные диски после воздействия веществ №2, №4 и №6 (рис.2). На имагинальных крыловых дисках после воздействия вещества №3 большая часть клеток, вступивших в апоптоз, была сосредоточена в основном на периферии диска. Клетки, вступившие в апоптоз, могут присутствовать не только по периферии крылового диска, но также и по центру, но в незначительном количестве. Возросшую интенсивность апоптоза в других экспериментальных группах можно связать с высоким уровнем генотоксичности веществ №2 и №6. Это косвенно подтверждается тем, что для того чтобы добавление вещества №6 не приводило к смерти личинок, его необходимо брать в концентрации в 2 раза меньше, чем вещество №3. При воздействии вещества №4 число полученных имаго было невелико, что также говорит о его высокой токсичности. Тогда как после добавления в среду вещества №3 уже в первом опыте было получено достаточно большое число жизнеспособных имаго D. melanogaster, а уровень апоптоза был существенно меньше, что может свидетельствовать о меньшей генотоксичности этого вещества по сравнению с остальными соединениями. Следовательно, если при дальнейшем тестировании на других объектах, например на грызунах и на культуре человеческих клеток, подтвердится эффект вещества №4, а именно низкая токсичность, но с выраженным противоопухолевым действием (выраженная интенсивность апоптоза), то это соединение можно будет рекомендовать как основу для противоопухолевых лекарств благодаря выраженному цитостатическому эффекту на фоне низкого генотоксического. Для веществ №1 и №5 уровень апоптоза не был проанализирован из-за высокой токсичности в использованной концентрации. Таким образом, использование Drosophila melanogaster как тест-системы на начальных этапах тестирования позволяет достаточно точно определять генотоксичность и канцерогенность химических соединений, а также их способность вызывать апоптоз клеток. Однако стоит учесть, что физиология человека и дрозофилы во многих аспектах различается, чем можно объяснить несоответствие результатов, полученных по анастезину и пефлоксацину, так как эти вещества уже применяются в медицинской практике. Так, анастезин (бензокаин) применяется как местный анестетик, а пефлоксацин — как антимикробное средство, тестирования позволяет достаточно точно определять генотоксичность и канцерогенность химических соединений, а также их способность вызывать апоптоз клеток. Однако стоит учесть, что физиология человека и дрозофилы во многих аспектах различается, чем можно объяснить несоответствие результатов, полученных по анастезину и пефлоксацину, так как эти вещества уже применяются в медицинской практике. Так, анастезин (бензокаин) применяется как местный анестетик, а пефлоксацин — как антимикробное средство.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.191-194. Библ. 5 назв.
Просмотров: 74