РЕЦЕПЦИЯ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ТКАНИ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, СВЯЗЬ С ЭКСПРЕССИЕЙ И СОДЕРЖАНИЕМ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ Вrn-3а И TRIM 16

Аннотация:

Изучены особенности рецепции половых стероидных гормонов в ткани папиллярного рака щитовидной железы и доброкачественной опухоли. Выявлено увеличение экспрессии мРНК AR, ERбета которое отражает злокачественный характер роста опухоли. Ядерные факторы Brn-3a, TRIM16, способные влиять на уровень экспрессии стероидных гормонов, играют важную роль в развитии опухолей щитовидной железы. Показано, что уровень мРНК TRIM16 связан с экспрессией ERбета, что, вероятно, опосредовано его антиэстрогенным действием. Ключевые слова: рак щитовидной железы, AR. ER, Brn-3a, TRIM16 В общей структуре онкологической заболеваемости на рак щитовидной железы (РЩЖ) приходится 1-1.5%. С 2004 по 2014 гг. прирост заболеваемости РЩЖ населения России составил 18.47%, что позволяет отнести его к самой распространенной злокачественной опухоли эндокринных желез. Известно, что у женщин уровень стероидных гормонов в ткани щитовидной железы выше, чем у мужчин. Также при диагностике данного заболевания распространенные формы опухолевого процесса чаще встречаются у женщин. Их уровень может рассматриваться в качестве критериев адекватности терапии. Рецепторы стероидных гормонов входят в большое семейство ядерных транскрипционных факторов, которые активируются под действием соответствующих лигандов. Эстрогеновые (ER) и андрогеновые (AR) рецепторы являются их основными представителями. ER имеют два подтипа: ERa и ERбета. Каждый из них кодируется отдельным геном, при этом имеются сведения о преимущественной экспрессии того или иного подтипа рецептора в разных тканях. Для РЩЖ положительный статус ERa при негативном статусе AR ассоциирован с агрессивным течением опухоли. Известно, что ERp часто называют онкосупрессором, однако его роль в развитии злокачественных новообразований щитовидной железы практически не исследована. Большой интерес представляет изучение регуляции половых стероидных гормонов. Известно, что в развитии гормонозависимых опухолей человека важную роль играют транскрипционные факторы POU4F1, также известные как нейрогенные факторы Brn-3a. Выявлены ассоциации Brn-3a с рецепторами половых гормонов: эстрогенов (ER) и андрогенов (AR). Другим ядерным белком, воздействующим на рецепторы эстрогенов, является TRIM16, или EBBP (Estrogen-responsive В box protein). Он обладает "антиэстрогенным" действием и способен снижать содержание рецепторов эстрогенов. Целью данного исследования являлось изучение экспрессии андрогеновых (AR) и эстрогеновых (ER) рецепторов при папиллярном РЩЖ и в доброкачественной опухоли в ассоциации с уровнем мРНК и содержанием ядерных факторов Brn-За и TRIM 16. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. В исследовании участвовали 40 больных папиллярным РЩЖ (7 мужчин, 33 женщины) в возрасте от 33 до 66 лет (средний возраст — 52.0±2.6 года) со стадией опухолевого процесса Т1-4N0-2M0, проходивших оперативное лечение в клиниках НИИ онкологии Томского НИМЦ. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Группу сравнения составили 22 больных с доброкачественными новообразованиями щитовидной железы: фолликулярными аденомами (4 мужчины, 18 женщин в возрасте от 38 до 66 лет; средний возраст — 53.0±4.4 года), которые получали лечение в клиниках НИИ онкологии Томского НИМЦ. Объемы диагностики и лечения больных соответствовали рекомендуемым алгоритмам, утвержденным Министерством здравоохранения РФ. Проведение исследования одобрено этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ (протокол № 5 от 24 апреля 2015 г.). Процедуры с вовлечением больных были проведены в соответствии с Протоколом Хельсинкской декларации Всемирной медицински ассоциации (1964 г.) Все больные подписывали информированное согласие на участие в исследовании. Материалом исследования служила опухолевая и гистологически неизмененная ткань щитовидной железы, полученная от больных папиллярным РЩЖ и доброкачественными опухолями после оперативного вмешательства. Образцы тканей замораживали и хранили при -80°С. Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспензировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCI буфера рН 7.5, содержавшего 2 мМ АТФ, 5 мМ MgCI2,1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCI. Гомогенат центрифугировали в течение 60 мин при 10 000д и 4°С. Электрофорез проводили по Лэммли в 13% ПААГ. После электрофореза полипептиды переносили на PVDF-мембрану ("Immobylon", "Millipore"). Иммунодетекцию проводили с антителами к Вгп-За ("Abeam") и TRIM16 ("Thermo Fisher Scientific"). Затем мембрану подвергали обработке системой хемилюминесцентной детекции ECL ("GE Healthcare"). Результаты анализировали с использованием системы визуализации "ChemiDocTMTouch Imaging System", а их плотность оценивали с помощью компьютерной программы "ImageLab" ("Bio-Rad"). Стандартизация проводилась относительно бета-актина. Результаты выражали в процентах от значений исследуемых показателей в неизмененной ткани. РНК выделяли с помощью набора "RNeasy mini Kit", содержащего ДНКазу I ("Qiagen"). Для оценки количества выделенной РНК на спектрофотометре "NanoDrop-2000" ('Thermo Scientific") оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280=1.95-2.05, А260/А230=1.90-2.31. Целостность РНК оценивалась с помощью капиллярного электрофореза на приборе 'TapeStation" ("Agilent Technologies") и набора "R6K ScreenTape" ("Agilent Technologies"). RIN составил 5.6-7.8. Уровень экспрессии генов оценивали с помощью количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе "iCycler" ("Bio-Rad"). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора обратной транскрипции m-MuLV-RH ("БиоЛабмикс") со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР ставили в 3 репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12.5 мкл готовой реакционной смеси "БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue" ("БиоЛабмикс"), 300 нМ прямого и обратного праймера и 50 нг кДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл (94°С, 10 мин — предварительная денатурация); 40 циклов (1-й шаг — 94°С, 10 с; 2-й шаг —20 с 60°С). Праймеры были подобраны с использованием программы "Vector NTI Advance 11.5" и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore) (табл. 1). В качестве референсного гена использовали GAPDH и уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии GAPDH. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе "Statistica 8.0". Результаты определения экспрессии генов представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение. Значимость различий оценивали с помощью критерия Манна—Уитни. Различия считали значимыми при р<0.05. Существование связи между показателями определяли с использованием корреляционного анализа, силу связи между переменными оценивали, рассчитывая коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ткани папиллярного РЩЖ происходило увеличение экспрессии AR и ER(5 в 2.3 и 55.3 раза соответственно по сравнению с тканью доброкачественной опухоли на фоне высоких значений ERa (табл. 2). Вероятно, высокие уровни экспрессии ERa в тканях с патологией щитовидной железы, как доброкачественной, так и злокачественной, обусловлены тем, что большинство пациентов в исследовании составляли женщины. В работе показано, что экспрессия AR и онкосупрессора р53 имеет решающее значение в развитии злокачественных опухолей щитовидной железы. Кроме того, в злокачественных опухолях щитовидной железы возрастала экспрессия AR. Имеются данные о том, что у пациенток прогрессирование заболевания связано с увеличением уровня ERa на фоне отсутствия изменений ERбета. В проведенном исследовании отмечено повышение экспрессии ERбета, онкосупрессорная роль которого для РЩЖ не подтверждена. Вероятно, это объясняется биологическими особенностями опухоли, которые могут определять не только прогноз заболевания, но и эффективность противоопухолевой терапии и выживаемость больных. В ранее проведенных исследованиях показана роль Brn-3a в развитии гормонозависимых опухолевых процессов. Экспрессия и содержание ядерного фактора Brn-За, влияющего как на AR, так и ER при папиллярном РЩЖ, имели разнонаправленную динамику (рисунок, табл. 3). Так, в опухолевой ткани мРНК Brn-За увеличивалась в 5 раз, а содержание его белка уменьшалось в 3.2 раза по сравнению с тканью доброкачественной опухоли. Аналогичную динамику наблюдали при экспрессии ядерного фактора TRIM16 — уровень его мРНК повышался в 7.5 раза, а содержание белка снижалось 47.6 раза в тканях доброкачественных и злокачественных опухолей. Наличие подобных закономерностей было подтверждено с помощью непараметрического корреляционного анализа: Brn-3ar=-0.52 (р=0.05); TRIM16 r=-0.52 (р=0.05). А динамика изменений экспрессии и содержания обоих факторов имела прямую положительную связь. Так, выявлены ассоциации между экспрессией Brn-За и TRIM16 (r=0.78; р=0.0005) и между содержанием их белковых продуктов (r=0.46;р=0.006). Существование тесных и значимых закономерностей между ядерными факторами и экспрессией стероидных рецепторов было показано для TRIM16. Известно, что эстрогены способны увеличивать содержание TRIM16 и усиливать экспрессию эстрогеновых рецепторов. Согласно полученным нами данным, содержание белка TRIM16 было связано с экспрессией ERбета (r=-0.56; р=0.002). То есть TRIM16 оказывает антиэстрогенное действие на бета-подтип рецепторов. Вероятно, в случае папиллярного рака регуляция эстрогеновых рецепторов посредством ядерных факторов менее эффективна и уступает другим молекулярным механизмам, сигнальным каскадам. Таким образом, папиллярный РЩЖ характеризуется повышенным уровнем экспрессии ERбета, AR, что связано с особенностями экспрессии и содержания ядерных факторов Brn-3a, TRIM16. Доказательством этому служит снижение содержания обоих факторов в опухолевой ткани, которое может быть связано с дальнейшим прогрессированием заболевания. Антиэстрогенный эффект TRIM 16 больше связан с ERбета, значение которого в развитии опухоли в настоящее время не выявлено.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.195-199. Библ. 11 назв.
Просмотров: 69