ИЗМЕНЕНИЯ СТРОЕНИЯ И ФРАКТАЛЬНОЙ РАЗМЕРНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА (ИССЛЕДОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ)

Аннотация:

Цель - изучить морфометрические характеристики-эритроцитов и выявить их изменения после воздействия наноча-стиц магнетита. Материал и методы. Исследованы эритроциты крови 23 здоровых доноров обоего пола в возрасте от 20 до 40 лет с применением атомно-силовой микроскопии"до и после инкубации с наночастицами магнетита в течение 60 мин. Измеряли диаметр, высоту, фрактальную размерность эритроцитов. Результаты. Введение наночастиц магнетита вызывает изменение строения эритроцитов. Основные трансформированные формы - сфероциты, эхиноциты, кодоциты, стоматоциты. Небольшое количество трудно дифференцируемых форм имеют перфорации мембраны. Выводы. Наночастицы магнетита в сублетальной концентрации вызывают увеличение числа необратимо измененных форм эритроцитов. Наиболее чувствительным морфометрическим критерием, позволяющим дифференцировать нормоциты от трансформированных форм, является фрактальная размерность эритроцитов. Ключевые слова: эритроцит, атомно-силовая микроскопия, морфометрия, фрактальная размерность, наночастицы магнетита. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) позволяет получать изображения живых объектов с высоким разрешением и обладает целым рядом преимуществ: возможностью исследовать клетки в иативной среде в режиме реального времени, определять вязко-упругие свойства мембранно-цитоскелетных комплексов, адгезивные характеристики молекул, в перспективе — определять локальный потенциал клеточных мембран , Одним из существенных преимуществ АСМ является получение высокоточных морфо-метрических характеристик молекул, надмолекулярных комплексов и клеток. Измерения диаметра и высоты позволяют ориентироваться не только на субъективную информацию об изменении строения клеток, но и предоставляют точную количественную оценку этих изменений. В процессе выполнения основных физиологических функций эритроциты деформируются . Однако, наряду с физиологической деформацией клеток при ряде заболеваний и при воздействии неблагоприятных факторов, эритроциты трансформируются в патологические формы, которые в норме не встречаются. Цель настоящей работы — определить различия высоты, диаметра и фрактальной размерности трансформированных эритроцитов по данным, полученным методом АСМ; выявить основные изменения строения эритроцитов после воздействия наночастиц магнетита (НЧМ). Материал и методы. Исследовали 23 образца венозной крови здоровых доноров обоих полов в возрасте от 20 до 40 лет, полученных в Нижегородском областном центре крови им. Н. Я. Климовой. На проведение исследования получено разрешение комиссии по биоэтике Национального исследовательского Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского (№ 9 от 17.07.2017 г.), После однократного центрифугирования гепаринизирован-ной крови (50 ЕД/мл) при 200 G в течение 3 мин и декантирования плазмы и лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя эритроциты пятикратно отмывали забуференным изотоническим раствором хлорида натрия (ЗИРХН). Отбирали 20 мкл эритроцитов, разводили в 50 раз. начальная концентрация клеток составляла 1х10б к л/мл. Эритроциты инкубировали с НЧМ в соотношении 1: 1 (опыт) или с эквивалентным количеством ЗИРХН (контроль) в течение 60 мин при температуре 37 °С. Наночастицы магнетита (FeOFe.,0,), предоставленные кафедрой физики полупроводников Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского , получали методом химической преципитации из раствора солей двух-и трехвалентного железа |1|.На двуугловом анализаторе размеров частиц и молекул ZetasizerNano («Malvern Instruments Ltd.», Великобритания) измеряли гидродинамический диаметр и электрокинетический потенциал (^-потенциал) НЧМ. Показатели составили 20±4 нм и -13,09 мВ соответственно. НЧМ перед экспериментами взбалтывали в перемешивающем устройстве Vortex (EL.M1 Ltd., Латвия) в течение 10 мин, диспергировали в ультразвуковой ванне (РЭЛТЭК, Москва) продолжительностью 15 мин, добиваясь однородности, после чего использовали для инкубации с эритроцитами в конечной концентрации 0,0018 мг/мл. Эритроциты переносили на поверхность предметных стекол и фиксировали глутаровым альдегидом (2,5%; 20 мин; 24 "С), трижды отмывали и сканировали в полуконтактном режиме на воздухе с помощью ACM Ntegra Spectra (NT-MDT, Россия), Для обработки результатов сканирования использовали программный пакет Gwyddion (Чешский метрологический институт, Чехия). Использовали зонды DNP (Broker, США) с радиусом закругления кончика 20 нм, углом при вершине 15°, резонансной частотой около 65 кГц, константой жёсткости 0,35 Н/м. Измерения диаметра и высоты проводили по боковому сечению профиля клетки (рис. I). Фрактальную размерность клеток рассчитывали на основе данных сканирования с помощью метода подсчета кубов Графическим методом определяли СЦО (50% летальную концентрацию) для НЧМ. Она составила 1,712 мг/мл. Поскольку в биологических исследованиях и медицинской практике используются гораздо более низкие концентрации , для эксперимента брали 0,0018 мг/мл НМЧ, т. е. сублетальную концентрацию, вызывающую трансформацию эритроцитов, а не их гемолиз. Значимость различий между двумя выборками полученных количественных данных определяли методом непараметрической статистики с использованием двухвыборочного критерия Вилкоксона, Различия между выборками считали статистически значимыми при р<0,()5. Для статистического анализа использовали программу Origin Pro 8 (OriginLab Corporation, США). Результаты исследования. На рис. I представлен нормальный по форме эритроцит (нормоцит). Результаты измерений основных морфометрических характеристик эритроцитов представлены в таблице. Поскольку у большинства трансформированных форм зона пел-лора (центрального просвета) не оформлена, для измерения высоты всех эритроцитов, в том числе нормоцитов, брали самую высокую точку клетки (у нормоцита она находится в области тора). Воздействие НЧМ на эритроциты вызывало их трансформацию. Наиболее часто встречались такие измененные формы, как сфероциты, затем эхиноциты, кодоциты и наименее часто — стоматоциты. Сфероциты имели округлую, предгемолитическую форму, на микроструктуре их мембраны отчетливо визуализировались повреждения . Эхиноциты представляли собой сферические клетки, на поверхности которых располагались 30-50 сопоставимых по размеру спикул . Кодоциты — это мишеневидные клетки с куполообразным выбуханием в центре, часть поверхности которых в зоне тора могла быть повреждена . Стоматоциты — округлые клетки с щелевидной формой пеллора . Наряду с ними, крайне редко встречались дакриоциты, акантоциты и трудно дифференцируемые формы эритроцитов, в том числе эритроциты, имеющие перфорации на уровне мембраны и кексообразные эритроциты (ранее не описаны). Эритроциты, имеющие перфорации на мембране, не были гемолизированы. Однако они имели форму, отличную от торо-образной или сферической, но близкую к многограннику с тупыми углами, а глубина перфораций варьировала от 25 до 304 нм . Кексообразные эритроциты характеризовались выбуханием на вершине, характерным и для кодоцитов, однако, в отличие от последних, это выбухание имело многослойный характер, а пел-лорическая зона абсолютно отсутствовала . Общее количество редко встречаю щихся форм было менее 2 %, поэтому статистический анализ их морфометрических характеристик был невозможен. По высоте от нормоцитов значимо отливаются эхиноциты и стоматоциты (см. таблицу). Между трансформированными формами значимые различия по высоте клетки отмечались между сфероцитами и эхиноцитами, сфероцитами и стоматоцитами, эхиноцитами и кодоци-тами, кодоцитами и стоматоцитами. По диаметру значимо от нормоцитов отличались только эхиноциты. Между трансформированными формами значимые отличия по диаметру клетки отмечались между сфероцитами и стоматоцитами. эхиноцитами и стоматоцитами. По фрактальной размерности все трансформированные формы значимо отличались от нормоцитов (см. табл.). Между трансформированными формами значимые отличия во фрактальной размерности отмечались между сфероцитами и эхиноцитами, сфероцитами и кодоцитами. сфероцитами и стоматоцитами. эхиноцитами и стоматоцитами . Обсуждение полученных данных. Согласно литературным данным , к обратимым формам эритроцитов относят эхиноциты и стоматоциты, к необратимым — кодоциты и сфероци-ты. Эритрограмма в контроле (без воздействия) выглядит следующим образом: 88,9% — нормоцитов; обратимых форм 5,3% (из них 4,3% — эхиноцитов и 1 % — стоматоцитов); необратимых форм — 5,8% (из них 2,4% — сфероци-тов, 3,4% — кодоцитов). При воздействии НЧМ наблюдается смещение эритограммы в сторону необратимых форм: 51,4% — нормоцитов, общее количество обратимо трансформированных форм составляло 12% (из них 10% — эхиноцитов, 2% — стоматоцитов), необратимых форм — 36,6% (из них 30,6% — сфероциты, 6% — кодоциты). Альтерация эритроцитов под влиянием НЧМ проявляется в изменении формы эритроцитов, их морфометрических параметров и смещении эритрограммы в сторону необратимых форм (сфе-роцитов и кодоцитов). Однако морфометрический анализ трансформированных форм эритроцитов с последующей статистической обработкой, как правило, не позволяет выявить параметры, достаточно чувствительные для диагностического дифференцирования нормоцитов от трансформированных форм эритроцитов. Это связано, прежде всего, с крайне высокой вариабельностью всех параметров у трансформированных эритроцитов. АСМ является высокоразрешающим и высокоточным методом измерения, поэтому позволяет количественно выявить эти колебания. Полученные данные дают представление о том, что групповые различия нормоцитов с трансформированными формами наблюдаются не только в случае значительных различий средних значений выборок, но и в случае малых значений их коэффициентов вариации. Исключение составляет показатель фрактальной размерности, являющийся наиболее чувствительным критерием, позволяющим не только дифференцировать нормоци-ты от трансформированных форм, но и различить трансформированные формы между собой. Это обусловлено тем, что фрактальная размерность является мерой заполнения пространства исследуемой структурой. Поэтому любые изменения строения эритроцитов приводят к отклонению от «идеальной» торообразной формы эритроцитов и, как следствие, к уменьшению этого параметра. Фрактальная размерность является математической характеристикой формы клетки, составляющая максимальную величину у нормоцита. Для всех трансформированных форм эритроцитов фрактальная размерность статистически значимо уменьшается. Минимальное значение фрактальной размерности выявлено для предге-молитической формы — сфероцита. Это говорит о том, что все трансформированные формы эритроцитов имеют меньшую эффективную площадь поверхности, что снижает их функциональные возможности, например, нарушаются газообменная функция и функция транспорта веществ. Таким образом, даже низкая концентрация НЧМ (в 103 меньшая CL50) способна вызвать существенную трансформацию эритроцитов с выраженным смещением в сторону необратимых форм. Метод АСМ позволяет с высокой точностью измерить высоту, диаметр и фрактальную размерность клетки. Однако единственным высокочувствительным параметром, позволяющим на основе морфометрических измерений дифференцировать нормоциты от трансформированных форм эритроцитов, является фрактальная размерность.

Авторы:

Издание: Морфология
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.42-46. Библ. 8 назв.
Просмотров: 121