РАННИЕ СТАДИИ РЕГЕНЕРАЦИОННОГО ГИСТОГЕНЕЗА В ПЕРИОСТАЛЬНОЙ ЧАСТИ КОСТНОЙ МОЗОЛИ У ЧЕЛОВЕКА

Аннотация:

Цель - изучить межклеточные молекулярные взаимодействия на ранних стадиях репаративного остеогистогенеза. Материал и методы. Объектом исследования являлись лараоссальные гематомы, которые были получены от пациентов обоего пола в возрасте от 15 до 84 лет в ходе реконструктивного лечения в течение 12 сут после перелома. Результаты. Наиболее ранним событием остеорепарации является миграция в область повреждения гетерогенной популяции макрофагов с активной цитокин-синтетической функцией, что приводит к формированию в гематоме локального пула клеток-продуцентов VEGF и предшествует появлению среди тканевого детрита первых тонкостенных сосудов. Высокая митотическая активность клеточных элементов эндотелиального дифферона в совокупности с мембранной экспрессией Flk-1 отражает тесные молекулярные взаимодействия между эндотелиоцитами и цитокин-продуцирующими макрофагами. Активный процесс ангиогенеза происходит параллельно со стремительным увеличением содержания соединительной ткани. К 12-м суткам отмечается достоверное снижение общего числа сосудов, что в совокупности с уменьшением мито-тической активности эндотелиоцитов отражает снижение активности ангиогенеза к моменту формирования структур гру-боволокнистой костной ткани. Экспрессия рецепторов Flk-1 и Flt-4 в клетках остеобластического дифферона свидетельствует о цитокиновой регуляции процессов гистогенеза костной ткани. Выводы. На ранних стадиях репаративного остеогенеза регуляторная ось VEGF-VEGFR играет ключевую роль в координации межклеточных молекулярных взаимодействий, что обеспечивает последовательную смену клеточно-тканевых дифферонов в параоссальной гематоме. Ключевые слова: параоссальная гематома, репаративный остеогенез, ангиогенез, VEGF. Несмотря на внедрение в клиническую практику современных методов хирургического лечения переломов и костных дефектов, нарушение их консолидации различной степени выраженности развивается у 5Н-8% пациентов .Это обуславливает необходимость проведения фундаментальных исследований регенерации костной ткани, направленных на определение «мишеней» для терапевтической коррекции нарушения консолидации . Известно, что одним из основных этапов восстановления костной ткани является ангиогенез — формирование и рост сосудов, обеспечивающих оксигенацию, миграцию и хоуминг в зоне повреждения клеток-предшественниц, способных к диф-ференцировке в остеобластаческом направлении. Низкий уровень перфузии является одним из основных факторов развития «остеогенной недостаточности» — состояния, при котором собственный камбиальный резерв остеогенных клеток не в состояйии обеспечить процесс остеорепарации. Таким образом, регенерационный остео- и ангиогенез является взаимосвязанным процессом, молекулярные механизмы регуляции которого изучены недостаточно. В связи с этим целью настоящей работы является исследование межклеточных молекулярных механизмов репаративной регенерации.костной ткани при её травматическом повреждении с позиции современной концепции о регенера-ционном гистогенезе. Материал и методы. Материал исследования составили параоесальные гематомы, полученные от 12 пациентов в возрасте от 15 до 84 лет (из них 4 — мужчины) с переломами костей верхней конечности . Материал получен в процессе реконструктивного хирургического вмешательства в условиях травматологического отделения НУЗ «Дорожная клиническая больница» им. Н. А. Семашко на !-, 3-8-, 10-е и 12-е сутки после травмы. Пациенты были информированы о целях и задачах исследования, потенциальной пользе от участия и возможных рисках, связанных с предоставлением биологического материала. Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие. Регистрационный номер исследования в международном регистре ClinicalTrials.gov: NCT03244969. Образцы гематом фиксировали в забуференном формалине, декальцинировали в Биодек R (Биовитрум, Россия) и заливали в парафин по стандартной методике. Препараты толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, трёхкомпонентным красителем для элективного выявления соединительной ткани по Маллори, а также импрегнировали серебром по Футу с целью выявления ретикулярных (аргирофильных) волокон. Для селективной оценки различных молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий применяли антитела к эндотелиальному сосудистому фактору роста — Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). рецептору эндотелиальиого сосудистого фактора роста 1-го типа — Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 (VEGFR1. или Flt-1), рецептору эндотелиальиого сосудистого фактора роста 2-го типа — Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 (VEGFR2, или KDR/Fik-Г), рецептору эндо-телнального сосудистого фактора роста 3-го типа — Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 (VEGFR3. или Flt-4), альфа-гладкомышечному актину — «-smooth muscle actin (cx-SMA), подоапанину, нейрофиламентам, CD31, CD163, а также PCNA. Характеристика используемых антител приведена в табл. 2. С целью количественной оценки различных компонентов репаративной регенерации выполняли расчёт морфо-метрических показателей, в том числе: площадь соединительной ткани (%), индекс пролиферации (ИП), индекс VEGF-положительных клеток (%), индекс экспрессии Fit-1 (VEGFR1), индекс экспрессии Flk-1 (VEGFR2), индекс экспрессии Flt-4 (VEGFR3). Изображения для морфометрии были выполнены на микроскопе Zeiss Axio Imager Z2 (Zeiss AG, Германия) с видеокамерой и программным обеспечением AxioVision. Для анализа изображений применяли программу ImageJ, National Institutes of Health (США). Математическая обработка включала вычисление средней величины каждого показателя и стандартного отклонения. Результаты исследования. В пост-травматической регенерации костной ткани принято выделять три фазы: ранних посттравматических изменений, регенерации и функциональной адаптации. Исследованный материал позволил проанализировать гистогенетические процессы в первую фазу и в начале второй. Фаза ранних посттравматических изменений (1-4-е сутки). В 1-е сутки после перелома на препаратах параоссальной гематомы определяются фибрин и скопления эритроцитов, среди которых встречаются единичные макрофаги, а также отдельные сегментоядер-ные лейкоциты. В область повреждения наблюдается миграция гетерогенной популяции макрофагов. К 4-м суткам среди массивных пучков нитей фибрина и множества гибнущих эритроцитов отмечается нарастание числа макрофагов с 0,6±0,1 до 5,2±2,1, которые становятся ведущим клеточным диффероном на этом сроке. В цитоплазме части из них отчётливо видны фагоцитированные фрагменты эритроцитов. В 91 % клеток макрофа-галъного дифферона определяется цитоплазма-тическая реакция с антителами к VEGF различной степени выраженности, что свидетельствует об активной цитокин-синтетической функции клеток. Экспрессия рецепторов Fit-1 и Flt-4 отмечается на мембране 70,5 и 69,4% клеточных элементов регенерата соответственно. Формирование к 4-м суткам в гематоме локального пула клеток-продуцентов VEGF предшествует появлению среди тканевого детрита первых тонкостенных сосудов со средним диаметром 11,7±3,5 мкм, число которых составляет 4,4+0,6. Сосуды располагаются неравномерно, преимущественно одиночно, в отдельных полях зрения — плотно друг к другу по 3-4 капилляра, что может быть проявлением расщепления. В этом случае новые капилляры образуются вследствие формирования перегородки в исходном сосуде с последующим его раздвоением. Стенка большинства сосудов представлена одним слоем эндотелио-цитов, расположенных на базальной мембране. В 83 % из них в составе стенки имеются cx-SMA-положительные клеточные элементы. Возможно, ими являются перициты, обеспечивающие стабилизацию структуры новообразованного сосуда. Появление первых сосудов коррелирует с высокой митотической активностью эндотелиоцитов, ИП которых составляет 77,5 %, что является проявлением интенсивного ангиогенеза. Отмечается высокая плотность рецепторного поля VEGF — экспрессия Pit-1 и Flk-1 определяется в 84,5% и 86,9% клеток эндотелиальиого дифферо-на соответственно, что отражает тесное межклеточное молекулярное взаимодействие с цитокин-продуцирующими макрофагами. В части клеток определяется ядерная локализация Flt-4, что может являться следствием процесса материализации, при котором рецептор после связывания с лиган-дом путём эндоцитоза доставляется внутрь ядра и выполняет в нём роль транскрипционного фактора, обеспечивающего регуляцию собственной экспрессии и других ангиогенных цитокинов. На 4-е сутки преимущественно в перикапил-лярном пространстве определяются немногочисленные клетки фибробластического диффе-рона, а также овальные одноядерные клетки, богатые слабооксифильной цитоплазмой. ИП в перикапиллярных зонах составляет 66.6%, что свидетельствует об активном митотическом процессе клеточных элементов, мигрирующих в зону повреждения из новообразованных капилляров. Среди клеток фибробластического диф-ферона отмечается умеренная неоднородность уровня экспрессии рецепторов к VEGF: антитела к Flk-1 маркируют 52% клеточных элементов. Также отмечается формирование небольших фокусов незрелой соединительной ткани, представленной молодыми аргирофильными волокнами, что отражает начало процесса формирования соединительнотканного матрикса. Таким образом, в ходе первых 4 сут наблюдаются изменение клеточно-дифферонной организации регенерата, формирование регенерационного макрофагально-фибробласто-эндотелиального регенерационного гистиона, морфофункциональное становление которого происходит при участии VEGF-VEGFR-регуляторной оси [рисунок). Фаза регенерации. Период активного ангиогенеза и формирования соединительнотканного матрикса (4-10-е сутки). К 5-7-м суткам количество клеточного детрита заметно уменьшается. В центральных зонах гематомы встречаются лишь островки лизированных эритроцитов и нитей фибрина, что сопровождается нарастанием числа клеток макрофагального диф-ферона до 7.2±3,4 к 6-м суткам. Доля VEGF-положительных клеток к 10-м суткам уменьшается с 91 до 73%, что, по-видимому, отражает снижение активности цитокин-синтетической функции и смену полуляционного состава макрофагов. К 7-м суткам плотность сосудов в гематоме увеличивается в 2,5 раза и достигает 11,4±0,9, а их диаметр — 8,2±2,3 мкм. Стабильно высокий ИП эндотелиоцитов остаётся в интервале от 77,5 до 88,5%. Антитела к Flk-1 и FIt-4 маркируют 86 и 74% клеток соответственно, что отражает высокую плотность рецепторного поля клеток эндотелиального дифферона и обеспечивает реализацию сигнала VEGF. Таким образом, в период с 5-х до 10-х суток определяется наибольшая активность ангиогенеза. В мембране эндотелиоцитов единичных тонкостенных сосудов на 6-е сутки отмечается умеренно интенсивная экспрессия подопланина, что свидетельствует о формировании в посттравматической гематоме немногочисленных лимфатических сосудов диаметром до 76 мкм, что отражает процесс лимфан-гиогенеза. Активный процесс ангиогенеза происходит параллельно с увеличением объёма соединительной ткани разной степени зрелости. к 6-м суткам составляющего 63,8%. Клетки фибробластического дифферона распределены относительно равномерно по всей площади препарата, что может являться проявлением активного процесса их миграции из перикапилляр-ной зоны. Их ИП в этом периоде увеличивается и к 10-м суткам составляет 74%, что в корреляции с мембранной экспрессией 89 % клеток Flk-1 определяет важную роль VEGF-VEGFR-регуляторной оси в формировании зрелого соединительнотканного матрикса. Плотный каркас коллагеновых волокон, по-видимому, обеспечивает оптимальные условия для нейрогенеза: на 8-е сутки отмечается прорастание первых нервных волокон диаметром до 68 мкм. Период раннего остеогистогенеза (10-12-е сутки). К 10-м суткам весь объём пара-оссальной гематомы представлен соединительной тканью разной степени зрелости, доля которой составляет 80.3. Реактивно изменённая соединительная ткань становится более дифференцированной, фибробласты активно синтезируют коллаген, коллагеновые волокна объединяются в пучки различной ориентации, фибробласты дифференцируются в фиброциты. Снижение к 12-м суткам ИП фибробластов до 54% отражает преобладание дифференцировки над пролиферацией. Экспрессия Flk-1 и Flt-4 составляет 80 и 82% соответственно, что свидетельствует о значимой роли VEGF не только в процессе пролиферации клеток фибробластического дифферона, но и в процессе их дифференцировки. К 12-м суткам общее число сосудов снижается с 11,4±0,9 до 4,5±0,5, из которых 73% содержат в стенке a-SMA-положительные клетки. Снижение митотической активности эндо-телиоцитов до 57 % коррелирует со снижением Flk-1-позитивных клеток на 15%. Также уменьшается число клеток макрофагального дифферона с 7,2+3,4 до 2,1 ±1,1, из которых 74% положительно маркируются антителами к VEGF. Число сосудов, достигнув максимума на 7-8-е сутки, начинает снижаться, что обусловлено гибелью клеточных элементов части капилляров путём апоптоза. На 10-12-е сутки в параоссальной гематоме формируются структуры грубоволокнистой костной ткани, внутри и по периметру которых залегают дифференцирующиеся остеобласты. Синтезируя коллагеновую основу межклеточного вещества, остеобласты образуют тонкие ажурные трабекулы и по мере увеличения объёма сами включаются в их структуру, приобретая черты остеоцитарной дифференцировки. Антитела к PCNA маркируют ядра 30% клеток остеобла-стического дифферона, которые располагаются преимущественно по периферии структур грубо-волокнистой костной ткани, что отражает их снижающуюся митотическую активность. Наличие экспрессии Flt-lH Flk-4 у более чем 90% клеток остеобластического дифферона подтверждает роль VEGF-VEGFR-регуляторной оси в процессах их гистогенеза. Положительное маркирование части остеобластов антителами к a-SMA отражает наличие сократительного аппарата, который обеспечивает их миграцию в соединительнотканном матриксе. Обсуждение полученных данных. Формирование параоссальной гематомы является самым ранним этапом репаративного остеогистогенеза. В эксперименте показано, что уже на 4-е сутки после перелома параоссальная гематома обладает остеогенным потенциалом. Процессы репаративного остеогенеза в гематоме начинаются сразу после её формирования, а удаление гематомы на 2-е и 4-е сутки после перелома сопровождается увеличением продолжительности заживления . Одним из ранних событий остеорепарации является миграция в область повреждения популяции макрофагов, большая часть которых экс-прессируют VEGF. Наибольший уровень экспрессии ангиогенных факторов роста обеспечивают Ml-макрофаги, относящиеся к провоспалитель-ной фракции, в то время как М2с-макрофаги обеспечивают продукцию ММР9 — белка, который играет важную роль в процессе ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса на этапе «созревания» грануляционной ткани . Как и в кожной ране, репаративный остеогистогенез сопровождается последовательной сменой популяционно-го состава макрофагов — М1-макрофаги, преобладающие на ранних этапах, постепенно сменяются популяцией М2-макрофагов, которые синтезируют антивоспалительные цитокины, такие как IL-1Q. Наличие экспрессии Flk-1 на мембране большей части клеток макрофагального дифферона, по нашим данным, также подтверждает гипотезу о том, что действие цитокина осуществляется по принципу ауто- и паракринной регуляции с участием VEGF-VEGFR-регуляторной оси.Нарушение кровоснабжения области повреждения является одним из основных лимитирующих факторов восстановления целостности костной ткани. В эксперименте было показано, что введение в область репаративной регенерации VEGF индуцирует ангиогенез и сокращает сроки формирования костной мозоли . Нами установлено, что экспрессия рецепторов VEGF имеется не только на мембране подавляющей части эндотелиоцитов, но и у других видов клеток, включая остеобласты. Таким образом, полученные результаты анализа посттравматического остеогистогенеза в параоссальных гематомах у человека создают предпосылки к разработке новых средств оптимизации репаративной регенерации костной ткани. С помощью антител к подоцланину нам удалось селективно выделить единичные лимфатические сосуды в составе параоссальной гематомы, источником которых могут являться лимфатические сосуды периоста. Их направленный рост в область повреждения может обеспечиваться высокой локальной концентрацией VEGF, который реализует свой сигнальный путь при взаимодействии с рецептором VEGFR2 . Исследования последних 10-15 лет показали, что кость является хорошо иннервируемым органом — процессы резорбции и остеогенеза регулируются рядом биологически активных пептидов .. В настоящей работе применение антител к нейрофиламентам позволило продемонстрировать появление первых нервных волокон в составе гематомы уже на 8-е сутки, что интересно в связи с данными о том, что VEGF индуцирует пролиферацию шванновских клеток, рост нейритов и является важным регулятором регенерации периферических нервов . Таким образом, на ранних стадиях репаративного остеогенеза одним из ключевых компонентов регуляции является регуляторная ось VEGF-VEGFR. Межклеточные молекулярные взаимодействия в рамках этой регуляторной оси обеспечивают последовательную смену клеточно-тканевых дифферонов в параоссальной гематоме и контролируют такие компоненты гистогенеза, как миграция, пролиферация и дифференциров-ка клеточных элементов. Понимание значимой роли VEGF-VEGFR-регуляторной оси может быть использовано для разработки новых таргетных препаратов, направленных на коррекцию репаративного остеогистогенеза и остеопластических материалов, которые обладали бы хорошей остеоиндуктивностью и были бы максимально приближены к понятию «идеальный» костно-замещаюший материал.

Авторы:

Издание: Морфология
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.63-69. Библ. 13 назв.
Просмотров: 66