ВЫЯВЛЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ДЕГРАНУЛЯЦИИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК СОСУДИСТОГО СПЛЕТЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ОКРАСКИ И ИММУНОГИСТОХИМИИ

Аннотация:

Цель - определение признаков дегрануляции тучных клеток сосудистого сплетения головного мозга человека при использовании окраски толуидиновым синим, гистохимической реакции на гликозаминогликаны и сульфаминогликаны с помощью апьцианового синего и иммуногистохимической реакции на триптазу тучных клеток. Материал и методы. Исследование проведено на образцах сосудистого сплетения головного мозга 29 людей в возрасте от 14 до 73 лет. Для оценки числа и локализации тучных клеток часть препаратов окрашивали толуидиновым синим и аль-циановым синим с докраской ядерным прочным красным. Также была проведена иммуногистохимическая реакция с использованием антител к триптазе тучных клеток человека. Результаты. Все три метода окраски показали разную степень эффективности при выявлении тучных клеток и их дегрануляции. Наилучшим методом визуализации тучных клеток (как гранулированных, так и в процессе дегрануляции) в сосудистом сплетении оказалась иммуногистохимическая реакция на триптазу. Около 60% тучных клеток в сосудистом сплетении головного мозга в исследуемых образцах были представлены дегранулирующими клетками, окруженными иммунопози-тивным ореолом, демонстрирующим перицеллюлярную локализацию триптазы. Выводы. Иммуногистохимическая реакция на триптазу значительно эффективнее выявляет тучные клетки в сосудистом сплетении мозга человека по сравнению с классическими методами окраски толуидиновым синим и апьциано-вым синим. Дегрануляция тучных клеток в сосудистом сплетении мозга человека относится к разновидности постепенной дегрануляции, перманентно влияющей на функциональную активность сплетения и гематоликворного барьера. Ключевые слова: тучные клетки, триптаза тучных клеток, дегрануляция, сосудистое сплетение головного мозга, головной мозг. Тучные клетки (ТК) — это клетки соединительной ткани, которые участвуют в иммунной защите организма и аллергическом воспалении, а также контролируют локальную гемодинамику и целостность тканевых структур . Отличительной особенностью этих клеток является наличие плотных гранул, заполняющих до 40% цитоплазмы, в которых хранятся синтезируемые ими биогенные амины (гистамин и серо-тонин), цитокины, ферменты (триптаза, химаза, кислые гидролазы и ряд других), простагландины, лейкотриены, аденозинтрифосфат, нейропепти-ды (вазоинтестинальный пептид и гонадотропин-рилизинг-гормон) . ТК происходят от плю-рипотентных стволовых клеток костного мозга, откуда распространяются по всему организму, где в местах окончательной локализации завершается их дифференцировка. Они присутствуют почти во всех органах и тканях (за исключением костной и хрящевой ткани). ТК до последнего времени стандартно выявляются с помощью окрашивания катионными тиазиновыми красителями , такими как тионин, толуидиновый синий, азур А, благодаря эффекту метахромазии — окрашиванию в цвет, отличный от цвета самой краски. Метахромазия проявляется при связывании красителя с содержащимися в тучных клетках протеогликанами (в первую очередь, гепарином и хондроитинсульфатом). В центральной нервной системе с помощью данного метода тучных клеток долгое время выявить не удавалось. Лишь к 1920-м годам ТК были описаны в сосудистом сплетении мозга некоторых животных, а в отдельных структурах мозга (гипоталамусе, таламусе, поводке, а также мозговых оболочках) они были обнаружены только в 1960-1970-е годы . При активации ТК под действием иммунных механизмов (IgE-зависимых и IgE-независимых), а также внешних и внутренних химических факторов (гормоны, тканевые протеазы, токсины) содержимое клеток выбрасывается путём экзоцитоза — процесса, который в данном случае называется дегрануляцией . Биоактивные компоненты гранул при дегрануляции оказывают локальное действие на близлежащие клетки, в первую очередь — на клетки сосудистой системы , а в головном мозгу —- в том числе на нервные и глиальные клетки , что определяет реакцию ткани головного мозга на повреждающие факторы. Таким образом, тучные клетки (в кооперации с глиальными и нервными клетками) участвуют в развитии нейровоспаления. которое, как установлено в последнее время, лежит в основе или, по меньшей мере, сопровождает практически все нейродегенеративные и многие психические заболевания . Вследствие этого большое значение имеют методические подходы к выявлению и описанию тучных клеток в головном мозгу и их дегрануляции. Цель настоящего исследования состояла в определении возможностей выявления признаков дегрануляции тучных клеток сосудистого сплетения головного мозга человека при использовании окраски толуидиновым синим, гистохимической реакции на аминогликозогликаны и сульфамино-гликаны и иммуногистохимической (ИГХ) реакции на триптазу тучных клеток. Материалом для исследования служили фрагменты сосудистого сплетения головного мозга 29 людей в возрасте 14-73 года из архива отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Соблюдение этических норм при архивации биологического материала подтверждается положительным заключением локального этического комитета ИЭМ № 58-9/1-684 от 11.12.2009 г. Материал был фиксирован в этаноле и смеси спирта и формальдегида, обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 6-7 мкм. Для оценки присутствия и локализации тучных клеток часть препаратов окрашивали толуидиновым синим (BioVitrum, Россия) и альциановым синим (BioVitrum, Россия) с докраской 05% раствором ядерного прочного красного (Nuclear Fast Red, Sigma Aldrich, США). Дополнительно были проведены ИГХреакции с использованием антител к триптазе ТК человека (мышиные моноклональные — клон АА1), разведение производителя (BioGenex, США). В качестве вторичных антител использовали набор МАСН2 Universal HRP Polymer Kit for mouse and rabbit (Biocare Medical, США). Для визуализации продукта ИГХ-реакции применяли 3'3-диаминобензидин (набор реагентов DAB+, Dako, Дания). Просматривали не менее 10 срезов в каждом из случаев. Выявляли ТК с выраженной грануляцией (наличие плотно расположенных цитоплазматических гранул) и ТК с дегрануляцией (частичное опустошение цитоплазмы и выход отдельных гранул за ее пределы). Анализ полученных препаратов и фотосъемку выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и цифровую фотокамеру ICC50 (Leica, Германия). Подсчет ТК производили на препаратах, окрашенных альциановым синим и ИГХ-методом. Определяли количество ТК на последовательных срезах одного и того же случая, окрашенных альциановым синим или ИГХ на триптазу, и вычисляли соотношение количества ТК, выявляемых после двух разных способов окраски. При проведении ИГХ-реакции оценку степени дегрануляции ТК производили по площади ореола (продукт иммуногистохимической реакции к триптазе) вокруг ТК. Измерения осуществляли в программе ImageJ (NIH, США). Для каждого случая анализировали по 5-10 клеток. Сравнение данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Исследование 29 образцов сосудистого сплетения мозга человека после их окраски толуидиновым синим и альциановым синим показало, что в 13 случаях (45%) ТК выявить не удалось. Вследствие этого для дальнейшего изучения были использованы только образцы ткани с обнаруженными ТК (16 наблюдений). При окраске препаратов толуидиновым синим в сосудистом сплетении встречались единичные метахроматически окрашенные ТК. Они были полиморфными, имели круглую, реже вытянутую форму. Для них характерно наличие отчётливо видимых гранул, заполняющих всю цитоплазму (рисунок, а). Дегранулирующие ТК выявлялись редко (см. рисунок,б). При окраске альциановым синим в сосудистом сплетении идентифицировали значительно больше ТК. ТК без признаков дегрануляции имели четкие границы (см. рисунок, в), а при дегрануляции клетки границы цитоплазмы неотчётливы, при этом наблюдались группы гранул, расположенных вне цитоплазмы ТК. Цитоплазма деграну-лирующих ТК заметно светлее, чем у клеток без дегрануляции (см. рисунок, 1). При подсчете ТК на препаратах, окрашенных альциновым синим, на долю клеток без дегрануляции приходилось 40%, а с дегрануляцией — 60%. ИГХ-реакция на триптазу визуализирует существенно больше ТК в сосудистом силе-тении, чем после окраски альциановым синим. Нередко в одном поле зрения видны по несколько триптазо-иммунореактивных клеток, при этом неспецифического окрашивания ткани сосудистого сплетения не наблюдалось. Обращает на себя внимание частая встречаемость ТК в непосредственной близости к сосудам (см. рисунок, е). Дегранулирующие ТК имели более слабое ИГХ-окрашивание (см. рисунок, е), чем недегранулирующие (см. рисунок, д), и находились в окружении слабоокрашенной области с размытыми границами (своего рода «ореод»). Было выявлено, что доля клеток без дегрануляции составляла 45%, с дегрануляцией — 55%. При подсчёте ТК при ИГХ-реакции выявлялось в 3,5 раза больше клеток (максимум 46 клеток на одном препарате), чем после окраски альциановым синим (максимум — 12 клеток на одном препарате). В среднем, альциановый синий выявлял 35% от количества ТК, определяемых с помощью ИГХ-реакции на триптазу. Было обнаружено, что размеры ТК в процессе дегрануляции (84,0+7,4 мкм2) и в состоянии покоя (88,3±15,1 мкм2) значимо не различались (р<0,5). Площадь образующегося «ореола» при дегрануляции примерно в 9 раз превышает размеры самой клетки (740,4±21,3 мкм2). Интересно отметить, что, несмотря на разное число выявляемых ТК при ИГХ-реакции и окраске альциановым синим, соотношение ТК с признаками дегрануляции (55-60%) и без дегрануляции (40-45%) было одинаковым. В ходе предварительного исследования в 45% анализируемых образцов сосудистого сплетения нам не удалось выявить ТК при использовании не только толуидинового синего, но и альциано-вого синего, который в целом позволяет выявить большее число ТК, чем толуидиновый синий. Ранее нами также было продемонстрировано, что ТК не удаётся выявить в сосудистом сплетении у 60-63% детей и 20% взрослых [3, 4]. Другими исследователями в работе, проведённой на области мозга человека, называемой самым задним полем (area postrema), эти клетки также не выявлялись в 31% препаратов, окрашенных толуидиновым синим, в 25% — альциановым синим и в 10% препаратов с ИГХ-реакцией на триптазу . Эти данные указывают на особую сложность выявления ТК, особенно в центральной нервной системе, на неоднозначность результатов, получаемых разными методами, и важность нахождения наиболее эффективных и адекватных методов выявления ТК и их дегрануляции. В настоящем исследовании были использованы три метода идентификации ТК: классический метод окраски толуидиновым синим (визуализация опосредуется за счёт их метахромазии), гистохимическое окрашивание на гликозамино-гликаны и сульфаминогликаны с помощью аль-цианового синего и ИГХ-реакцию на триптазу — фермент, характерный для ТК. Все три метода с разной степенью эффективности выявляли данный тип клеток в сосудистом сплетении человека. Наилучшие результаты были получены при использовании ИГХ-реакции на триптазу. тогда как меньше всего ТК выявлялось при окраске толуидиновым синим. Полученные нами результаты сходны с данными исследования ТК в самом заднем поле (area postrema) человека. В желудке, тонкой кишке и печени человека ИГХ-реакция на триптазу позволяла выявить вдвое больше ТК, а в коже — на 40 % больше, чем окраска толуидиновым синим . При выявлении двух фенотипов ТК — слизистых оболочек и соединительнотканных — было показано, что ИГХ-реакция на триптазу в желудке мыши выявляет вдвое больше слизистых оболочек ТК по сравнению с окраской толуидиновым синим. Однако выявляемость соединительнотканных ТК в желудке и коже мыши, а также в желудке и печени монгольской песчанки была одинаковой при использовании обоих методов, а в тонкой кишке монгольской песчанки эффективность выявления ТК была одинаковой при использовании толуидинового синего, алыщанового синего и ИГХ-реакции на триптазу . Сопоставление полученных нами результатов и данных из приведённых выше работ свидетельствует о сходстве гисто-и ИГХ-характеристик ТК разных структур мозга и желудочно-кишечного тракта человека и различии с ТК других видов животных, у которых наблюдается вариативность химических характеристик ТК разных органов, что согласуется со сведениями о значительной гетерогенности популяции ТК — как межвидовой, так и межорганной в пределах одного вида. Эти различия связаны со значительными отличиями биохимических, гистохимических и функциональных характеристик разных видов ТК [17]. Этот факт свидетельствует о необходимости соблюдать осторожность при попытках механически экстраполировать какие-либо данные о ТК, полученные на одном виде организмов, на другие виды, а в пределах одного вида — данные, полученные на одних органах и тканях, — на другие органы и ткани. Независимо от метода, которым выявлялись ТК, в них визуализировались многочисленные гранулы. Большое число ТК (55-60 %) в сосудистом сплетении мозга человека были зафиксированы в состоянии дегрануляции — выделения их содержимого. При этом окрашенные толуидиновым синим или альциановым синим гранулы расположены вблизи ТК, но за пределами их цитоплазмы либо в случае ИГХ-реакции на триптазу — окрашенной области вокруг ТК, в которой нередко видны тёмноокрашенные гранулы. В литературе описаны определённые критерии, с помощью которых на препаратах, окрашенных толуидиновым синим, отличают дегра-нулирующие ТК от гранулированных. Помимо наблюдаемых около ТК гранул, особое внимание обращается на то, имеются ли в цитоплазме клеток гранулы, отчетливо отделенные друг от друга. Это расценивается как показатель дегранулирую-щих клеток. Невозможность обнаружения отдельных гранул внутри ТК из-за их плотной упаковки расценивается как показатель гранулированной клетки . Нельзя не признать, что определение дегранулирующих ТК с помощью ИГХ-реакции на триптазу значительно более наглядно и удобно для исследования. В полученных нами данных обращает на себя внимание значительная доля дегранулирующих ТК в сосудистом сплетении мозга человека. Известно, что, помимо дегрануляции, вызванной определёнными стимулами, существует так называемая постепенная дегрануляция ТК («piecemeal degranulation»), которая была описана для ТК разных органов и у разных видов животных . По-видимому, тот факт, что наблюдаемые нами ТК в сосудистом сплетении человека в большинстве своём находятся в состоянии дегрануляции, свидетельствует именно о таком характере выделения продуктов ТК, которые оказывают перманентное влияние на окружающую ткань сосудистого сплетения, регулируя его функциональную активность. Суммируя полученные результаты, следует подчеркнуть, что выявление ТК в сосудистом сплетении мозга человека, как и в целом в центральной нервной системе, а также в других органах, представляет собой сложную задачу. Использованные нами три метода окраски позволили с разной степенью эффективности выявить ТК сосудистого сплетения. Полученные данные свидетельствуют, что наилучшим методом визуализации ТК сосудистого сплетения и процесса их дегрануляции является ИГХ реакция на триптазу в сравнении с окраской толуидиновым синим и альциановым синим. Обнаружение преимущественно дегранулирующих ТК свидетельствует о том, что дегрануляция ТК в сосудистом сплетении мозга человека относится к разновидности постоянной дегрануляции, перманентно влияющей на функциональную активность сплетения и более широко — на проницаемость гема-толикворного барьера в целом.

Авторы:

Издание: Морфология
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.70-75. Библ. 18 назв.
Просмотров: 221