ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРУППЫ ГЕНОВ микроРНК, ГИПЕРМЕТИЛИРОВАННЫХ В КАРЦИНОМЕ ЯИЧНИКОВ

Аннотация:

Определяли метилирование генов микроРНК в злокачественных опухолях яичников и новые диагностические и прогностические маркеры заболевания и эффективную систему маркеров. С применением метил специфичной ПЦР и представительной выборки из 54 образцов рака яичников определены 5 генов микроРНК (MIR-34b/c, MIR-9-1, MIR-124-3, MIR-129-2, MIR-107), гиперметилированных в большинстве образцов опухолей по сравнению с парными образцами гистологически неизмененной ткани (48-57% против 4-19%;/к0.001). С помощью ROC-анализа выбрана эффективная система из 4 маркеров для диагностики рака яичников (MIR-9-1, MIR-124-3, MIR-129-2, MIR-107), которая характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью — до 87-94% при AUC=0.92 — относительно условной нормы (54 парных образца гистологически неизмененной ткани) и абсолютной нормы (18 образцов ткани яичников умерших от неонкологических заболеваний). Показано также, что метилирование генов MIR-129-2, MIR-9-1 и MIR-34b/c значимо (р<0.01) ассоциировано с клинической стадией или наличием метастазов. Полученные результаты указывают на вовлеченность эпигенетических модификаций исследованных генов микроРНК в патогенез и прогрессию рака яичников и свидетельствуют об их диагностическом и прогностическом потенциале. Ключевые слова: гены микроРНК, гиперметилирование, рак яичников, система маркеров. Эпигенетические механизмы, включая метилирование промоторных CpG-островков и связывание микроРНК (миРНК) с мРНК генов-мишеней на посттранскрипционном уровне, характеризуются наиболее динамичным воздействием на регуляцию генов, белков и сигнальных путей. Метилирование CpG-островков вовлечено в регуляцию экспрессии генов миРНК, как и генов, кодирующих белки. Рак яичников представляет группу крайне агрессивных злокачественных опухолей, которых отличает высокая частота летальных исходов. При выявлении опухолей яичников на I-II клинических стадиях уровень 5-летней выживаемости достигает 70%, однако более 70% случаев рака яичников выявляют на поздних стадиях, и уровень 5-летней выживаемости в среднем составляет 30%. Главная причина этих проблем — отсутствие методов ранней диагностики. Эпигенетические маркеры, включая метилирование онкосупрессорных генов и профили экспрессии миРНК, перспективны в диагностике и прогнозе течения рака. К настоящему времени показана роль гиперметилирования широкого круга генов миРНК в патогенезе опухолей разных локализаций. Профили гиперметилирования генов миРНК также могут найти применение в качестве потенциальных маркеров для диагностики и прогноза рака легкого, молочной железы и других видов рака. В то же время анализ гиперметилирования генов миРНК в опухолях яичников ограничен единичными исследованиями, например, метилирование генов, кодирующих miR-130b и miR-9, выявлено при раке яичников, осложненном лекарственной резистентностью. Цель данного исследования—определение генов миРНК, гиперметилированных в злокачественных опухолях яичников, и отбор эффективной системы новых диагностических маркеров данного заболевания. Было изучено изменение метилирования CpG-островков группы генов миРНК (MIR-34b/c, MIR-9-1, MIR-124-3, MIR-129-2, MIR-107) на представительной выборке 54 образцов рака яичников. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Образцы рака яичников собраны и морфологически охарактеризованы в НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина Минздрава России. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с "Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан", получено разрешение этического комитета НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина, а также информированное согласие больных. Анализировали образцы рака яичников у больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Все опухоли яичников были классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза и гистологически верифицированы на основании критериев ВОЗ. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток (не менее 70-80%) проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (3-5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. В исследовании использованы парные образцы опухолей и гистологически неизмененных тканей (условная норма) яичников, полученные от 54 больных раком яичников, включая 37 образцов от пациенток без метастазов и 17 образцов от пациенток с метастазами в регионарных лимфатических узлах и/или в отдаленных органах. Кроме того, исследованы образцы тканей яичников 18 женщин, умерших от неонкологических заболеваний, получивших условное название "доноры". Образцы тканей хранили при -70°С. Замороженную в азоте ткань измельчали с помощью гомогенизатора-диспергатора "Silent Crusher S" ("Heidolph"). Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани по стандартной методике. Бисульфитную конверсию ДНК и метилспецифичную ПЦР (МС-ПЦР) проводили, как описано ранее. Модифицированную бисульфитом ДНК (1-2 мкг) очищали с помощью Centrifugal Filter Microcon, Ultracel YM-30 ("Millipore"), хранили при -20°C и использовали в качестве матрицы при проведении МС-ПЦР. ПЦР проводили на амплификаторе "DNA Engine Dyad Cycler Т-100" ("Bio-Rad") по программе: 1 цикл — 95°С, 5 мин; 35 циклов (95°С, 10 с; 1отж, 20 с; 72°С, 30 с); 1 цикл — 72°С, 3 мин. Праймеры, температура отжига (toтж) и размеры продуктов МС-ПЦР генов микроРНК взяты из работ. МС-ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержавшей 67 мМ трис-HCI рН 8.8, 16.7 мМ (NH4)2S04, 0.01% Твин-20; 1.5-2.5 мМ MgCI2,0.25 мМ каждого dNTP; 10-20 нг ДНК; 25 пмоль каждого праймера; 0.5 ед. Hot Start Taq-ДНК-полимеразы ("СибЭнзим"). Для каждого гена анализировали от 3 до 6 CpG-динукпеотидов. Ложноположительные результаты из-за неполной бисульфитной конверсии ДНК исключали на стадии подбора праймеров по отсутствию продукта МС-ПЦР на необработанной бисульфитом ДНК (для метилированного и неметилированного аплеля). Препарат метилированной ДНК человека (#SD1131, "Thermo Scientific") использовали как контроль для метилированного аплеля, а препарат неметилированной ДНК человека (Male, #G1471, "Promega") — как контроль для неметилированного аллеля. Продукты ПЦР от разных генов разделяли одновременно с использованием 2% агарозного геля. Для определения интенсивности люминесценции продукта ПЦР применяли "Gel DOC Ez Imager software" ("Bio-Rad"). Метилирование учитывали в образцах, в которых сигнал был эквивалентен маркеру (7 нг/мкл). МС-ПЦР повторяли трижды, и только образцы, на которых сигнал был всегда положительным, учитывали как метилированные. Статистический анализ полученных результатов проводили с применением точного критерия Фишера; изменения считали значимыми при р<0.05. Достоверность значений р проверяли с помощью поправки Бенджамини—Хохберга на множественное сравнение; результат считали значимым при FDR (false discovery rate) 0.05. Оптимальные системы маркеров выбирали по результатам ROC-анализа (http://www.biosoft.hacettepe.edu. tr/easyROC/). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выявлено значительное повышение частоты метилирования 5 исследованных генов в образцах опухолей по сравнению с парными образцами гистологически неизмененных тканей яичников: 48-57% против 4-19% (табл. 1). Различия между данными для образцов опухолей и условной нормы высоко статистически значимы для всех 5 генов миРНК (р<0.001, FDR=0.01; табл. 1). Эти результаты позволяют предположить связь гиперметилирования исследованных генов миРНК с патогенезом рака яичников. Для составления потенциальной системы маркеров с максимальной специфичностью выбраны 4 гена миРНК (кроме MIR-34b/c), частоты метилирования которых в ДНК парной условно нормальной ткани были достаточно низкими (4-9%). Методом анализа ROC-кривых показана эффективность системы маркеров (MIR-9-1, MIR-124-3, MIR-129-2, MIR-107), обладающей 87% чувствительностью и 83% специфичностью, при AUC=0.89 (табл. 2). При анализе этой группы генов с помощью ROC-кривых относительно абсолютной нормы (18 образцов яичников женщин, умерших от неонкологического заболевания) специфичность данной системы достигла 94% при AUC=0.92. Причем, согласно характеристике оптимального критерия (табл. 2), отобранная система позволяет диагностировать рак яичников на основании выявления метилирования уже одного из 4 генов системы. Данные по частотам метилировании исследованных генов миРНК, полученные на репрезентативной выборке 54 образцов рака яичников, были сопоставлены с клинико-гистологическими характеристиками пациенток (табл. 3). Выявлена связь между клинической стадией и метилированием гена MIR-124-3 (р< 0.05) и MIR-129-2 и MIR-9-1, для которых эта зависимость значима с учетом поправки Бенджамини—Хохберга на множественное сравнение (р<0.01, FDR=0.05). При сравнении 37 образцов опухолей, полученных от пациенток без метастазов, и 17 образцов от пациенток с метастазами выявлено существенное различие частот метилирования генов MIR-129-2 и MIR-34b/c. Однако с учетом поправки Бенджамини—Хохберга на множественное сравнение значимая ассоциация с наличием метастазов подтверждается только для MIR-34b/c (табл. 3). Важно отметить, что установленная связь гиперметилирования MIR-34b/c с метастазированием рака яичников может иметь прогностическое значение. Кроме того, определена потенциальная диагностическая система для выявления рака яичников, основанная на анализе метилирования генов миРНК. Ранее для диагностики рака яичников рассматривали главным образом профили экспрессии миРНК. Интересно также сообщение о гиперметилировании ряда генов миРНК при раке предстательной железы, в котором также предложено использовать эпигенетические модификации генов миРНК для диагностики и прогноза заболевания. Таким образом, нами идентифицированы гены миРНК, гиперметилированные при раке яичников, показана их роль в патогенезе и прогрессии заболевания и определена потенциальная система маркеров для диагностики рака яичников с высокой чувствительностью и специфичностью (87%, 94%, AUC>0.9).

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.213-217. Библ. 13 назв.
Просмотров: 46