Ростстимулирующие свойства тромбоцитов человека, стабилизированных наночастицами серебра

Аннотация:

Исследовали пролиферативную активность мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в составе коллагеновых повязок с тромбоцитами, стабилизированными наночастицами серебра. При количестве стабилизированных тромбоцитов с гранулами 20-120 млн на 100 тыс. высеянных клеток наблюдалась выраженная дозозависимая стимуляция роста стромальных клеток без нарушения их структуры. Аналогичные дозы нестабилизированных тромбоцитов давали гораздо меньший ростовой эффект. При количестве стабилизированных тромбоцитов 180 млн и выше отмечено ингибирование роста клеток, а также их повреждение. В опытах со стабилизированными тромбоцитами стромальные клетки проявляли повышенную миграционную активность, после формирования монослоя на поверхности они активно перемещались вглубь коллагеновой повязки. Сформированный монослой сохранялся в течение 14 сут без видимых повреждений клеток в его составе. Ключевые слова: тромбоциты с гранулами, стабилизация, наночастицы серебра, индекс пролиферации Тромбоциты человека содержат большое количество факторов тканевой репарации и регенерации, способны адгезировать на разных субстратах и поэтому могут быть востребованы в разработке и производстве комбинированных биотрансплантатов и тканеинженерных конструкций. При этом адгезия сопровождается выбросом тромбоцитарных компонентов — в растворенном виде или в составе цельных секреторных везикул (гранул). Свободные тромбоцитарные гранулы также способны связываться с некоторыми органическими матриксами. Однако в условиях смены среды, при дополнительных обработках трансплантата возникает риск потери большей части или даже всех гранул тромбоцитов, первоначально адгезировавших на трансплантате. Таким образом, при создании насыщенных тромбоцитами трансплантатов актуальной становится стабилизация гранул в составе биологически полноценных тромбоцитов, препятствующая преждевременному выбросу ростстимулирующих факторов. Ранее было показано, что наночастицы серебра в концентрации 1-5 мкМ способны стабилизировать тромбоциты человека на ранних стадиях адгезии, препятствуя их массовой дегрануляции. При этом значительная часть от общего объема гранул (50-75%) сохраняется в адгезирующих тромбоцитах в течение длительного времени, следовательно, их биологический потенциал может быть исследован in vitro. Целью данной работы являлось исследование пролиферативного эффекта коллагеновых повязок, насыщенных стабилизированными тромбоцитами в разной концентрации. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовали тромбоциты, выделенные из цельной крови доноров (консервант—цитрат). Для стабилизации тромбоцитов использовали препарат с коллоидными наночастицами серебра "Адбион 2" ("Наноиндустрия"). Исходный препарат разводили 0.9% NaCI для получения раствора с концентрацией наносеребра 15 мкМ, который затем вносили в среду с тромбоцитами в необходимой пропорции. Для стабилизации тромбоцитов наночастицами серебра использовали два способа. Первый способ — предварительная инкубация тромбоцитов в присутствии наносеребра. Для этого в исходную суспензию с тромбоцитами добавляли раствор наносеребра до достижения концентрации 2.5 мкМ и инкубировали при 22°С в течение 1 ч. Затем суспензию с тромбоцитами и наносеребром наносили на коллагеновый матрикс. Второй способ — стабилизация тромбоцитов на ранней стадии адгезии. Суспензию с тромбоцитами сначала наносили на матрикс и экспонировали в течение 10 мин при 37°С, затем добавляли раствор наносеребра до достижения конечной концентрации 5 мкМ и инкубировали еще 30 мин при 37°С. Указанные концентрации наночастиц были ранее определены как наиболее оптимальные. В качестве матрикса использовали повязки на основе коллагена I человека площадью 4-5 см2. Во всех опытах общий объем суспензии тромбоцитов составлял 0.5 мл. После нанесения тромбоцитов на матрикс повязки экспонировали в течение 30 мин при 37°С, затем из лунок удаляли всю жидкую фракцию с неадгезировавшими тромбоцитами. Выделение компонентов гранул за пределы стабилизированных тромбоцитов осуществляли с помощью криодеструкции. Для этого готовые повязки хранили при -40°С и размораживали непосредственно перед посевом клеток. В работе использовали повязки без тромбоцитов (контроль), повязки с нестабилизированными тромбоцитами, без обработки наночастицами серебра (1-я опытная группа), повязки с тромбоцитами, предварительно инкубированными с 2.5 мкМ наносеребра (2-я опытная группа), повязки с тромбоцитами, стабилизированными на ранней стадии адгезии (3-я опытная группа). Оценку качества тромбоцитов проводили с помощью оригинального морфофункционального метода, основанного на витальном окрашивании. Для оценки содержания тромбоцитов с гранулами в составе коллагеновых повязок определяли исходное содержание тромбоцитов с гранулами в дозе (млн) и содержание тромбоцитов с гранулами в остаточном объеме после экспозиции на коллагеновой повязке (млн); количество тромбоцитов с гранулами, адгезировавших на повязке, определяли как разность числа тромбоцитов с гранулами в дозе до и после экспозиции. Ростстимулирующий эффект исследовали на примере культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) доноров. После размораживания коллагенового матрикса в каждую лунку 6-луночного планшета вносили суспензию, содержавшую 50 тыс. ММСК. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ЭТС ("Gibco") при 37°С и 5% СО2 в течение 3-14 сут. Анализ ММСК в составе коллагеновых повязок проводили оригинальными методами, основанными на витальном окрашивании клеток и их исследовании во флюоресцентном микроскопе. Оценивали общее количество клеток на повязке (тыс/см2) через 3 сут культивирования, также анализировали общую морфологию витально окрашенных клеток. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета программ "Microsoft Excel 2000". Вычисляли средние арифметические значения (М) и среднеквадратичные отклонения (о). Для оценки различий использовали t критерий Стьюдента и критерий %2 для малых выборок. Различия считали достоверными при уровне значимости более 95% (р<0.05). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ На 1-3-и сутки культивирования во всех случаях основная часть ММСК адгезировапа за пределами коллагенового матрикса. На котрольных повязках (без тромбоцитов) содержание ММСК составило в среднем 6.5±1.1 тыс/см2. В опытах без стабилизации в диапазоне 40-120 млн тромбоцитов с гранулами на 100 тыс. высеянных ММСК общее количество клеток через 3 сут культивирования составляло 9.2-10.6 тыс/см2, т.е. даже при различии концентрации тромбоцитов с гранулами в 2 раза и более ростовой эффект значимо не менялся. В среднем использование 40-120 млн нестабилизи-рованных тромбоцитов с гранулами увеличивало пролиферативную активность ММСК в 1.5 раза. При стабилизации тромбоцитов с гранулами в диапазоне от 20 до 120 млн на 100 тыс. ММСК ростстимулирующий эффект заметно усиливался (таблица, рисунок). При этом в условиях предварительной инкубации тромбоцитов с 2.5 мкМ наночастиц серебра максимальный рост пролиферативной активности ММСК отмечен при концентрации тромбоцитов с гранулами 61-80 млн (в 2.6 раза по сравнению с контролем). В то же время при стабилизации тромбоцитов наиболее интенсивный рост ММСК наблюдали при содержании тромбоцитов с гранулами 101-120 млн (в 2.5 раза по сравнению с контролем). В целом в диапазоне 20-120 млн стабилизированных тромбоцитов на 100 тыс. ММСК наблюдался выраженный дозозависимый эффект стимуляции роста in vitro (таблица) при сохранении структурной целостности клеток. При 130-170 млн тромбоцитов с гранулами ростовой эффект заметно снижался при обоих способах стабилизации, а при 180-240 млн количество ММСК было уже меньше, чем в контроле, т.е. данные концентрации оказывали ингибирующее действие на рост культуры. Максимальное подавление роста отмечено в опытах с 500-550 млн стабилизированных тромбоцитов, где число ММСК на повязках было в 3-4 раза ниже, чем в контроле; в опытных образцах у многих клеток наблюдалось нарушение адгезивной и секреторной активности. При этом на дне чашки Петри (вне повязки) ингибирование роста было выражено заметно меньше. Оба способа стабилизации увеличивают рост-стимулирующий эффект тромбоцитарного материала в составе повязок, однако предварительная инкубация с наночастицами представляется более удобной и эффективной. Поэтому такой способ стабилизации использовался и при более длительном культивированнии ММСК. Через 7 сут в опытах с 90-100 млн стабилизированных тромбоцитов (стабилизация путем предварительной инкубации с 2.5 мкМ наночастиц серебра) на поверхности коллагеновой повязки формировался выраженный конфлюэнтный монослой, содержавший в среднем 24.1±0.5 тыс ММСК/см2, параллельно наблюдалась миграция клеток вглубь матрикса и на его противоположную сторону. В то же время в контрольных образцах (без тромбоцитов) содержание ММСК через 7 сут составило всего 8,0+0.9 тыс/см2, в опытах с 90-100 млн тромбоцитов без стабилизации — 16.5±0.4 тыс/см2, причем в обоих случаях клетки на противоположной стороне матрикса отсутствовали. Через 14 сут культивирования в контроле был выявлен субконфлюэнтный монослой (15.5±0.7 тыс/см2), тогда как во всех опытах с 90-100 млн тромбоцитов образовывался конфлюэнтный монослой, содержавший 24-25 тыс. ММСК/смг, без видимых структурных повреждений клеток. Однако миграция ММСК в матриксе была гораздо более выраженной в опытах с предварительно стабилизированными тромбоцитами — в этом случае содержание ММСК на обратной стороне матрикса составило 6.0±0.2 тыс/см2, тогда как в опыте без стабилизации — 1,6±0.1 тыс/см2. Таким образом, использование наночастиц серебра позволяет заметно увеличить сохранность биологического потенциала тромбоцитов в составе трансплантата в условиях смены или удаления жидкой среды. Следует отметить, что при предварительной инкубации тромбоцитов с наносеребром максимальный рост пролиферативной активности ММСК отмечен при более низкой концентрации тромбоцитов с гранулами по сравнению со стабилизированными на ранней стадии адгезии тромбоцитами. Это может быть связано с тем, что при разных способах стабилизации сохраняется разное количество гранул в расчете на 1 тромбоцит; кроме того, стабилизация тромбоцитов на ранней стадии адгезии не препятствует формированию ими уплощенных агрегатов, в составе которых тромбоциты дегранулируют более активно, чем при адгезии одиночных клеток. С другой стороны, 101-120 млн тромбоцитов с гранулами, стабилизированных в начале их адгезии, обладают высоким ростстимулирующим эффектом, что подтверждает полученные нами ранее данные. В целом концентрация стабилизированных тромбоцитов 60-80 млн (при предварительной инкубации с наносеребром) и 100-120 млн (при стабилизации на ранних стадиях адгезии) в расчете на 100 тыс. высеянных ММСК позволила в среднем в 2.6 раза повысить пролиферативную активность клеток на коллагеновых повязках. Однако при этом нельзя точно определить долю ростовых факторов, которая теряется стабилизированными тромбоцитами в процессе их контакта с матриксом. Для оценки общего биологического потенциала стабилизированных тромбоцитов необходимо исследовать обе фракции гранул — как вышедшие из клетки, так и сохранившиеся в цитоплазме при разной концентрации наносеребра. Не исключено, что применение наночастиц серебра позволит не только увеличить сохранность тромбоцитарных компонентов в составе трансплантатов, но также проводить селективную дегрануляцию тромбоцитов, т.е. выделять из них гранулы с определенным химическим составом.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.221-225. Библ. 12 назв.
Просмотров: 43