ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА И КВАНТОВЫХ ТОЧЕК НА ЭКСПРЕССИЮ РЕФЕРЕНСНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Аннотация:

Исследовано воздействие наночастиц магнетита (Fe0Fe203) и квантовых точек (CdSe/ZnS, покрытых меркаптопропионовой кислотой) на экспрессию пяти часто используемых референсных генов (ВА, В2М, PPIA, UBC и YWHAZ) клетками периферической крови 20 доноров методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Установлено, что стабильность экспрессии референсных генов варьирует в зависимости от типа клеток и химической структуры наночастиц. Уровень мРНК YWHAZ показал наибольшую стабильность в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах после воздействия наночастиц. Стабильность экспрессии YWHAZ была подтверждена методом вестерн-блоттинга. Полученные данные свидетельствуют о том, что YWHAZ является наиболее подходящим референсным геном. Ключевые слова: наночастицы, квантовые точки, референсный ген, лейкоциты, периферическая кровь. Наноразмерные материалы обладают уникальными характеристиками поверхности и физико-химическими свойствами, которые обусловливают их широкое применение для решения актуальных медицинских и биологических задач. Наночастицы магнетита и квантовые точки активно используются в диагностике и терапии заболеваний, таргетной доставке диагностического или лекарственного препарата в различные компартменты организма, например, к опухоли. Однако для большинства наноматериалов зафиксирован высокий уровень токсичности. Одной из основных проблем использования наноразмерных материалов является недостаточная изученность механизмов их альтерирующего действия на организменном, клеточном, молекулярном уровне, в частности, влияния на экспрессию генов. Наиболее распространенным методом изучения экспрессии генов является обратная транскрипция ПЦР (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени. Данный метод надежен и высокоточен, но требует нормализации получаемых данных для выравнивания разницы в исходном количестве мРНК между образцами. Для нормализации наиболее часто используют референсные гены, однако стабильность их экспрессии зависит как от типа ткани или клеток, так и от внешних и других факторов, воздействующих на объект исследования. Выбор оптимального референсного гена — необходимое условие при исследовании изменений экспрессии таргетных генов методом ПЦР в реальном времени. Цель данного исследования — определение стабильности экспрессии референсных генов убиквитина С (UBC), бета-2-микроглобулина (В2М), тирозин-З-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы, активационного протеина зета (YWHAZ), бета-актина (ВА) и пептидилпролилизомеразы А (PPIA) при воздействии на лейкоциты периферической крови наночастиц магнетита и квантовых точек. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследование одобрено комиссией по биоэтике ННГУ им. Н.И.Лобачевского (протокол № 9 от 17.07.17 г.). В работе использовали периферическую кровь 20 доноров из Нижегородского областного центра крови им. Н.Я.Кпимовой. Клетки периферической крови разделяли в градиенте плотности фиколл-верографин (р=1.076 и р—1.116,200д, 40 мин) на лимфоцитарную и нейтрофильную фракции. Лимфоцитарную фракцию использовали для выделения моноцитов методом иммуномагнитной сепарации с помощю набора "CD14 MicroBeads, human" ("Miltenyi Biotec GmbH"). Во всех экспериментах с наночастицами использовали клетки в конечной концентрации 106/мл, которые инкубировали (60 мин, 37°С) с наночастицами, как описано ранее. Использовали наночастицы магнетита (НЧМ) с эффективным диаметром 20±4 нм в конечной концентрации 0.18 мг/мл и квантовые точки CdSe/ZnS, покрытые меркаптопропионовой кислотой (QD-MPA), с эффективным диаметром 11,0±1.1 нм (ООО НТИЦ "Нанотех-Дубна") в конечной концентрации 0.025 мг/мл. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Нуклеиновые кислоты выделяли методом фенол-хлороформной экстракции и обрабатывали DNase I, RNase-free ("Thermo Fisher"). На матрице РНК синтезировали кДНК с использованием ре-вертазы RevertAid и гексапраймеров ("Thermo Fisher"). Проводили дуплекс ПЦР в реальном времени в амплификаторе CFX96 ("Bio-Rad") при температурных условиях: 94°С — 10 мин (94°С — 30 с, 55°С — 30 с, 72°С — 30 с)х50. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для детекции мРНК генов UBC, В2М, YWHAZ и ВА были представлены ранее. Для обнаружения мРНК PPIA использовали следующие олигонуклеотиды: 5'-CGCGTCTCCTTTGAGCTGTT-31, 5'-TGTGAAGT CACCACCCTGAC-3', 5'-HEX-AAGCAGGAACCC TTATAACCAAATCC-BHQ-2-З'. Оценку стабильности экспрессии генов проводили с использованием компьютерной программы "NormFinder". Уровни мРНК рассчитывали по пороговым циклам с учетом эффективности реакции. Для сравнения уровней белка клетки лизировали замораживанием-оттаиванием и нормализовали по концентрации общего белка. Вестерн-блоттинг проводили с первичными антителами к YWHAZ, ВА и GAPDH, а также со вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена ("Cloud-clone Corp."). Результаты реакции проявляли набором ECL Western Blotting Substrate ("Promega") и визуализировали блот-сканером C-DiGit ("LI-COR Biotechnology"). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Стабильность пяти часто используемых референсных генов под действием наноразмерных материалов оценивали в лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах периферической крови с помощью математической модели "NormFinder". Данный алгоритм позволяет определить оптимальный референсный ген среди нескольких кандидатов на основе комбинированной оценки вариации экспрессии генов между и внутри исследуемых групп, а также идентифицирует любые систематические различия между группами. Наиболее устойчивый ген характеризуется наименьшим значением уровня вариаций. Стабильность экспрессии референсных генов варьировала в зависимости от типа клеток и химической структуры наноразмерных материалов. Под действием НЧМ в лимфоцитах и моноцитах самым низким уровнем вариаций характеризовались мРНК YWHAZ, в нейтрофилах — мРНК YWHAZ и PPIA (рис. 1). Под действием QD-MPA в лимфоцитах наибольшей стабильностью обладали уровни мРНК ВА и YWHAZ, в нейтрофилах — мРНК YWHAZ, а в моноцитах — уровни мРНК UBC, YWHAZ и ВА, Таким образом, в клетках периферической крови наибольшей устойчивостью к действию наночастиц характеризовался уровень мРНК YWHAZ. Для остальных референсных генов наблюдались более значительные флуктуации мРНК. Для оценки направленности изменений экспрессии исследуемых генов под действием наноразмерных материалов рассчитывали уровни мРНК В2М, YWHAZ и ВА относительно мРНК PPIA и UBC. В лимфоцитах зафиксировано повышение уровня мРНК UBC под действием обоих типов наноразмерных материалов, в нейтрофильной фракции крови наоборот — снижение. Действие НЧМ приводило к увеличению экспрессии В2М в нейтрофилах, в то время как QD-MPA вызывали снижение уровня экспрессии В2М во всех клетках крови. Уровень мРНК ВА снижался в лимфоцитах под действием как НЧМ, так и QD-MPA. Присутствие QD-MPA приводило к повышению уровня мРНК PPIA в моноцитах. Инкубация клеток с НЧМ и QD-MPA приводила к незначительному снижению или повышению уровня мРНК YWHAZ в лейкоцитах периферической крови. Следует отметить, что статистически значимых различий в уровнях мРНК исследуемых генов после инкубации с НЧМ и QD-MPA не обнаружено. Для подтверждения результатов ПЦР в реальном времени анализировали изменения уровня белка в лимфоцитах периферической крови после инкубации с наночастицами методом вестерн-блоттинга. Оценивали изменение относительного количества белка YWHAZ, показавшего наибольшую стабильность уровня мРНК, и белка ВА, характеризующегося наибольшей нестабильностью в лимфоцитах после воздействия НЧМ. Установлено, что относительный уровень белка YWHAZ был слабо подвержен изменениям при инкубации лимфоцитов с НЧМ и QD-MPA. В то же время регистрировалось двукратное повышение уровня ВА под действием НЧМ (рис. 2). Полученные нами результаты согласуются с данными литературы. Показана стабильность экспрессии генов YWHAZ\л HSP90 клетками линии BEAS-2B в ответ на действие наночастиц золота. Стабильная экспрессия гена YWHAZ в периферической крови отмечена у здоровых людей и больных рассеянным склерозом. Следует отметить, что сообщалось и о низкой стабильности экспрессии гена YWHAZ в активированных ЛПС и неактивированных Т-лимфоцитах и нейтрофилах. Мы также регистрировали вариации уровня мРНК YWHAZ в присутствии НЧМ или QD-MPA. Наибольший уровень вариаций мРНК был в лимфоцитах, однако эти вариации были ниже, чем у мРНК других генов. В присутствии НЧМ или QD-MPA уровни мРНК ВА, В2М, PPIA и UBC показали меньшую стабильность в клетках крови. Экспрессия В2М была в большей степени подвержена действию QD-MPA, чем НЧМ. По данным работы, экспрессии В2М нестабильна в моноцитах. Уровень мРНК ВА изменялся при действии обоих типов наноматериалов в лимфоцитах, тогда как в моноцитах и нейтрофилах — существенно не менялся. Однако в литературе описана низкая стабильность экспрессии ВА неактивированными и активированными ЛПС моноцитами крови, NK-клетками, стимулированными ИЛ-2 и ФНО, и В-лимфоцитами. Стабильность уровня мРНК PPIA наблюдалась лишь при воздействии НЧМ на нейтрофилы. В лимфоцитах и моноцитах уровень мРНК PPIA характеризовался низкой стабильностью, что согласуется с данными литературы. Известно, что экспрессия PPIA не стабильна в NK-клетках и Т-лимфоцитах, что может быть связано с низким уровнем мРНК PPIA на неактивированных CD4+ Т-лимфоцитах. Уровень мРНК UBC был постоянным только в моноцитах в присутствии QD-MPA. Также показана нестабильность уровня мРНК UBC в В-лимфоцитах и моноцитах, стимулированных ЛПС. Таким образом, уровень мРНК YWHAZ показал наибольшую стабильность в клетках периферической крови в ответ на воздействие наноразмерных материалов по сравнению с ВА, В2М, PPIA и UBC, что делает его наиболее подходящим референсным геном для оценки влияния НЧМ и QD-MPA на клетки периферической крови. Авторы выражают благодарность сотрудникам Саратовского национального исследовательского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского докт. хим. наук, проф. Д.А.Горину и канд. хим. наук С.В.Герману за синтез и предоставление наночастиц магнетита.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.226-229. Библ. 15 назв.
Просмотров: 87