ЭКТОПИЧЕСКИЙ ОРГАНОГЕНЕЗ ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ СВЕЖЕУДАЛЕННОГО ИЛИ КРИОКОНСЕРВИРОВАННОГО НЕОНАТАЛЬНОГО ЯИЧКА ПОД КАПСУЛУ ПОЧКИ КРЫС

Аннотация:

В опытах на белых беспородных крысах-самцах после билатеральной орхэктомии проводили пересадку под капсулу почки ткань свежеудаленного (20 опытов) или криоконсервированного (10 опытов) яичка новорожденных крысят (1-2 дня после рождения). В опытах с трансплантацией свежеудаленного яичка во всех случаях отмечено его приживление. К 3 мес при гистологическом исследовании выявлено формирование зрелых семенных канальцев, но с прекращением сперматогенеза на стадии сперматогоний, а также группы пролиферирующих клеток Лейдига в рыхлой соединительной ткани между канальцами. Через 6 и 12 мес состояние семенных канальцев сохранялось, но при этом выявлялись структуры, характерные для придатка яичка, а также формирующийся семявыносящий проток. Количество пролиферирующих клеток Лейдига возрастало. Исходно сниженная концентрация тестостерона в крови кастрированных самцов достоверно увеличивалась уже через 1 мес после пересадки и продолжала расти до 3 мес, оставаясь в дальнейшем на уровне примерно в 2 раза ниже нормы. Трансплантированная криоконсервированная неонатальная ткань семенников приживлялась в 60% случаев, однако прижившиеся трансплантаты, как и неконсервированные, сохраняли способность к органогенезу с формированием зрелых семенных канальцев, придатка яичка и групп пролиферирующих клеток Лейдига. Динамика концентрации тестостерона в крови крыс с прижившимися трансплантатами была такой же, как и в опытах с пересадкой неконсервированной ткани. Субкапсулярная трансплантация не оказывала негативного влияния на состояние почек, о чем свидетельствовала нормальная гистологическая картина почечной ткани и концентрация креатинина и мочевины в крови. Ключевые слова: регенеративная медицина, яичко, органогенез, криоконсервация, андрогенный дефицит. Проблема сохранения мужского здоровья, в частности половой функции, приобретает все большее значение в связи с возрастанием частоты развития эректильной дисфункции и мужского бесплодия. Наиболее часто это состояние связано с развитием андрогенного дефицита вследствие возрастных, профессиональных или медицинских причин. Процент бесплодных супружеских пар, в которых причиной бесплодия является нарушение сперматогенеза, достигает 15-20%. Частой причиной нарушений сперматогенеза также является андрoгенный дефицит. Наиболее распространенным способом лечения эректильной дисфункции и нарушений сперматогенеза является гормональная терапия с использованием различных препаратов тестостерона. Однако при длительном применении эффективность этой терапии снижается и часто развиваются побочные эффекты в виде метаболических нарушений и аллергических реакций, что заставляет отменять эту терапию. Развитие клеточных технологий с использованием трансплантации стволовых клеток или клеток-предшественников открывает новые возможности в лечении этих состояний. Изучается эффективность интратестикулярной трансплантации культивированных аллогенных и ксеногенных мезенхимных клеток костного мозга или жировой ткани, культуры клеток семенников плода, культивированных клеток Лейдига или их предшественников, комплекса клеток яичка, гипофиза и гипоталамуса. Однако культивирование клеток для получения необходимого количества клеточной массы весьма затратно. В то же время имеется возможность проведения тканевой терапии с использованием плодной или неонатальной ткани, содержащей большое количество низкодифференцированных клеток, обладающих высоким пролиферативным потенциалом. При этом сохранение межклеточных взаимодействий в пересаживаемой ткани ("ниши" стволовых клеток) позволяет надеяться на формирование полноценных органных структур. Рассматриваются возможности использования криоконсервированных трансплантатов ткани семенников, в том числе и в клинической практике, для восстановления фертильности. Целью данного исследования являлось изучение приживляемости, роста и гормональной активности фрагментов ткани удаленного у новорожденных крысят яичка, пересаженных под капсулу почки. Этот вариант трансплантации связан с тем, что субкапсулярное пространство почки является иммунопривилегированной зоной, что значительно уменьшает риск отторжения алло- или ксенотрансплантата. Дополнительно изучали, как влияет криоконсервация на приживляемость и функциональную активность трансплантатов. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах (n=30). У животных под эфирным наркозом выполняли билатеральную орхэктомию. Через 1 мес им пересаживали под капсулу почки фрагменты ткани свежеудаленного или криоконсервированного яичка новорожденных крысят (1 -2 дня после рождения) (рис. 1, а). Для этого в области наружного края с использованием микрохирургических инструментов надсекали капсулу, формировали тоннель в субкапсулярном пространстве и помещали туда фрагменты ткани неонатального яичка. Брюшную полость ушивали двухслойным обвивным швом атравматичной нитью Vicryl 4/0. В опытах с пересадкой свежеудаленной ткани (I серия, 20 экспериментов) свежеудаленные неонатальные яички промывали в физиологическом растворе, разрезали пополам и пересаживали в обе почки кастрированным крысам. В опытах с криоконсервированной тканью (II серия, 10 экспериментов) удаленные яички после промывания в физиологическом растворе помещали в криозащитную среду комнатной температуры следующего состава: 3.8 г/л К2НР04, 1.02 г/л КН2Р04, 0.57 г/л KCI, 0.43 г/л NaHC03,68.4 г/л сахарозы. После 5-ми-нутной инкубации в раствор добавляли криопротектор ДМСО сначала до концентрации 5%, через 10 мин—до 10%, еще через 10 мин—до 15%. После 10-минутной инкубации фрагменты ткани неонатального яичка помещали в сухую пластиковую пробирку и переносили в морозильную камеру с температурой -90°С, где они хранились до трансплантации от 2 нед до 1 мес. Перед пересадкой пробирки с тканью извлекали из морозильной камеры, помещали в водяную баню при 37°С и после полного оттаивания переносили в раствор, аналогичный криозащитному, но с концентрацией ДМСО 10%. Через 10 мин инкубации ткань переносили в раствор с концентрацией ДМСО 5%, а еще через 10 мин — в раствор без ДМСО. Еще через 10 мин ткань была готова к пересадке, которую осуществляли по описанной методике. В серии с пересадкой свежеудаленной тестикулярной ткани животных обследовали через 1,3, 6 и 12 мес, а в серии с пересадкой криоконсервированной ткани — через 1, 3 и 6 мес. При этом визуально оценивали наличие трансплантата под капсулой почки, удаляли почку с трансплантатом для гистологического исследования и брали пробы крови для определения тестостерона и биохимических показателей. Гистологическое исследование проводили по стандартной методике с окрашиванием парафиновых срезов гематоксилином и эозином. Концентрацию тестостерона в сыворотке крови определяли иммунохемилюминесцентным методом на иммунохимическом анализаторе "Access 2" ("Beckman Coulter"). Функциональное состояние почек оценивали по концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови, которые определяли с помощью стандартных реактивов на биохимическом анализаторе "ADVIA-2000" ("Siemens"). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р<0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. При трансплантации свежеудаленной ткани неонатального яичка (I серия) во всех опытах наблюдалось приживление трансплантата. Через 1 мес он выглядел белесым образованием под капсулой почки (рис. 1, б). Через 3,6 и 12 мес размер трансплантата значительно увеличивался. Он выступал над поверхностью почки (рис. 1, в) и вдавался в паренхиму почки (рис. 1, г). В ряде опытов через 6 и 12 мес определялась четкая неоднородность новообразованной ткани, возможно, связанная с формированием придатка яичка (рис. 1, в). При гистологическом исследовании имплантата через 1 мес после пересадки примерно треть новообразованной ткани яичка была представлена рыхловолокнистой соединительной тканью с небольшими скоплениями клеток Лейдига, содержащей также незначительное количество эозинофильных лейкоцитов. Остальную часть составляли формирующиеся канальцы разной степени зрелости, выстланные сперматогенным эпителием (рис. 2, а). В отдельном участке располагались формирующиеся структуры придатка яичка. Ткань почки выглядела малоизмененной. Структура клубочков и канальцев была сохранена. На границе почки и новообразованной тестикулярной ткани наблюдалась диффузная инфильтрация лимфоидными клетками. Через 3 мес после пересадки новообразованная ткань яичка была представлена преимущественно зрелыми канапьцевыми структурами и элементами придатка яичка. Базальная мембрана канальцев была выстлана клетками Сертоли, в эпителии канальцев выявлялись признаки активного сперматогенеза до стадии сперматогоний, в межканальцевой соединительной ткани—комплексы пролиферирующих клеток Лейдига (рис. 2, б). В почке обнаруживалась нормальная структура с воспалительной инфильтрацией, включающей плазматические клетки, в прилежащей к новообразованной ткани яичка области. Через 6 и 12 мес новообразованная ткань также была представлена преимущественно семенными канальцами, однако в большинстве канальцев отмечалась остановка сперматогенеза на стадии сперматогоний. Через 6 мес в препаратах обнаруживались структуры, типичные для придатка яичка (рис. 2, в), а через 12 мес— элементы придатка и новообразованный семявыносящий проток (рис. 2, г). В межканальцевой соединительной ткани новообразованного яичка наблюдалась нерезко выраженная инфильтрация эозинофилами. Прилежащая ткань почки выглядела неизменной. В опытах с пересадкой криоконсервированной ткани неонатального яичка (II серия) трансплантаты были выявлены в 12 из 20 почек опытных крыс. При этом прижившиеся трансплантаты выглядели как и неконсервированные. Через 3 и 6 мес размеры новообразованной криоконсервированной тестикулярной ткани были такими же, как и в опытах с неконсервированной тканью. Через 6 мес визуально также наблюдалась гетерогенность новообразованного яичка с наличием участка, похожего на придаток яичка (рис. 3, а). Гистологическое исследование выявило картину, близкую к таковой при пересадке неконсервированной ткани. Новообразованные семенные канальцы были выстланы сперматогенным эпителием с остановкой сперматогенеза на стадии сперматогоний. Часть канальцев была выстлана только клетками Сертоли. В интерстиции определялись комплексы пролиферирующих клеток Лейдига. Помимо семенных канальцев в препаратах обнаруживались структуры придатка яичка. Соединительнотканная капсула, окружающая трансплантат, была резко выражена (рис. 3, б). Определение динамики тестостерона крови показало, что через 1 мес после кастрации уровень гормона снижался (таблица). В обеих сериях эксперимента уже через 1 мес отмечалось достоверное повышение концентрации тестостерона, продолжающееся до 3 мес наблюдения. В дальнейшем он оставался примерно на том же уровне до конца сроков наблюдения. Уровни креатинина и мочевины крови после трансплантации ткани яичка на всех сроках наблюдения не отличались от нормы, что свидетельствовало об отсутствии негативного влияния субкапсулярной трансплантации на функцию почек. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что пересаженная в иммунологически привилегированную зону (под капсулу почки) ткань аплогенного неонатального яичка способна не только приживаться, но и формировать структуры, типичные для зрелого органа: семенные канальцы, содержащие клетки Сертоли и сперматогенный эпителий, комплексы клеток Лейдига в интерстициальной ткани, элементы придатка яичка и семявыносящий проток. Это позволяет полагать, что стволовые клетки и клетки-предшественники, которыми богата неонатальная ткань, способны к направленной дифференцировке, несмотря ее на пересадку в чужеродную область. Возможно, при пересадке тканевых фрагментов играет роль сохранение межклеточной кооперации (так называемой "ниши"), что отсутствует при трансплантации культивированных клеток. При этом новообразованное яичко способно активно синтезировать тестостерон клетками Лейдига, образовавшимися в результате активной пролиферации, способствуя повышению его уровня в крови. Однако через 3 мес рост концентрации гормона прекращается, оставаясь в дальнейшем на уровне примерно в 2 раза ниже нормы, что может быть связано с ограничением возможности увеличения массы новообразованного органа в субкапсулярном пространстве, а следовательно, и массы клеток Лейдига. На начальных сроках после пересадки неонатальной ткани яичек гистологически выявляли признаки активного сперматогенеза, однако в более поздние сроки наблюдения сперматогенез тормозился, блокируясь на стадии сперматогоний. Незавершенность сперматогенеза в новообразованных семенных канальцах может быть связана с несколькими причинами: отсутствием связи с другими органами половой системы (предстательная железа, семенные пузырьки), сохраняющимся сниженным уровнем тестостерона и наличием вялотекущего иммунного конфликта, о чем свидетельствует формирование соединительнотканной капсулы вокруг имплантата и нерезко выраженная эозинофильная инфильтрация стромы, наблюдаемая в ряде опытов. При гетеротопической трансплантации ткани плодного яичка свиньи голым мышам также происходило формирование зрелых семенных канальцев с остановкой сперматогенеза на стадии сперматогоний при наблюдении до 1 года. В отдельной серии мы исследовали способность к эктопическому органогенезу и гормональной активности неонатальной ткани семенников после криоконсервации, что важно в плане оценки возможности создания банка неонатальныхтканей. Оказалось, что криоконсервация уменьшает вероятность приживления трансплантата до 60%. Однако прижившиеся трансплантаты оказались в той же степени полноценны, что и в опытах с неконсервированной тканью. Гистологическая картина в обеих сериях оказалась практически одинаковой. Также сохранялась гормонпродуцирующая активность: концентрация тестостерона в крови возрастала в той же степени, что и в I серии. Сохранение после трансплантации функциональной полноценности криоконсервированной ткани яичка подтверждено в работах. Трансплантация ткани под капсулу почки не наносила вреда функциональному состоянию органа. Гистологически и по данным биохимического исследования крови состояние почки не нарушалось. Таким образом, трансплантация фрагментов ткани неонатального яичка под капсулу почки показала возможность формирования новообразованного органа со структурой, характерной для нативного семенника с его эндокринной функцией и функционированием в течение длительного времени. Хотя в новообразованной ткани наблюдается незавершенный сперматогенез, но сама способность гетеротопически пересаженной неонатальной ткани к органогенезу свидетельствует о перспективности дальнейших исследований в этом направлении. В дальнейшем мы продолжили исследования с пересадкой неонатальной тестикулярной ткани в другую иммунопривилегированную зону — под белочную оболочку яичка—для оценки стимуляции нарушенного сперматогенеза и коррекции андрогенного дефицита.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.230-235. Библ. 15 назв.
Просмотров: 70