СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕРМАТОГЕННОГО ЭПИТЕЛИЯ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА

Аннотация:

Исследовали иммуногистохимические и морфометрические характеристики сперматогенного эпителия семенников крыс на фоне перорального введения наночастиц диоксида титана (ТiO2). Выявлены дистрофические изменения сперматогенного эпителия: уменьшение его толщины, дезорганизация слоев и отрыв сперматогенных клеток от базальной мембраны. Результаты иммуногистохимических исследований показали снижение пролиферативной активности эпителиальных клеток и их способности к дифференцировке, на что указывает изменение уровня экспрессии маркеров Ki-67 и c-kit. Полученные нами данные свидетельствуют о неблагоприятном влиянии наночастиц ТiO2 на структурно-функциональные характеристики репродуктивной системы самцов крыс и, как следствие, о нарушениях сперматогенеза. Ключевые слова: наночастицы, диоксид титана, токсичность, сперматогенный эпителий. Сперматогенез представляет собой сложный биологический процесс, который особенно чувствителен к любым токсическим воздействиям. Исследования последних лет убедительно доказывают, что действие различных неблагоприятных факторов на мужскую репродуктивную систему приводит к снижению фертильности, уменьшению количества сперматозоидов и негативным изменениям в гаметах. Среди появившихся в последнее время токсикантов серьезное внимание привлекают наноматериалы. Проведенные в последние годы в условиях in vitro и in vivo исследования показывают, что наночастицы (НЧ) после попадания в организм легко проходят через любые мембраны, в том числе эпителиальные, проникают сквозь тематические барьеры и могут оказывать влияние на различные его структуры, включая головной мозг и репродуктивные органы. Среди широкого спектра наноматериалов в настоящее время в наиболее значительных масштабах используются НЧ диоксида титана (ТЮ2). Результаты исследований показали, что НЧ TiO2 оказывают негативное влияние как на соматические, так и на половые клетки организма человека и животных. Так, в экспериментах in vitro было обнаружено, что НЧ ТiO2, мигрируя в клетки Лейдига семенников мыши, уменьшали их пролиферативный потенциал и жизнеспособность, а также увеличивали уровни экспрессии генов одного из ключевых антиоксидантных ферментов — маркера окислительного стресса гемоксигеназы-1 и стероидогенного острого регуляторного белка (StAR), контролирующего транспорт холестерина в митохондрии клеток Лейдига, что напрямую связано с синтезом андрогенов этими клетками. Подкожная инъекция НЧ Ti02 в организм беременных самок мышей вызывает у потомства мужского пола накопление НЧ в сперматидах, клетках Сертоли и Лейдига, что приводит к нарушению сперматогенеза. В работах внутрибрюшинная инъекция НЧ ТiO2 самцам мышей вызывала заметное снижение числа сперматозоидов, их подвижности и усиление процессов апоптоза сперматогенных клеток. Предполагается, что снижение подвижности сперматозоидов, вызванное воздействием НЧ ТiO2, может быть объяснено развивающимся окислительным стрессом. Поскольку мембрана сперматозоидов богата полиненасыщенными жирными кислотами, то это делает их чрезвычайно чувствительными к воздействию АФК. Подтверждением этого тезиса является исследование, в котором показано, что в клетках Сертоли НЧ ТiO2 вызывают повышенную генерацию АФК, усиление ПОЛ, повреждение ДНК, активацию ряда каспаз с последующей гибелью этих клеток. Негативное влияние НЧ Ti02 на репродуктивную систему не ограничивается влиянием на сперматогенез, но также затрагивает овогенез и эмбриональное развитие. Так, ранее нами показано, что НЧ ТiO2 оказывают токсическое влияние на репродуктивную систему самок крыс и эмбриональное развитие их потомства. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность токсического влияния НЧ ТiO2 на мужскую репродуктивную систему, клеточные механизмы, лежащие в основе нарушения сперматогенеза под влиянием НЧ, остаются малопонятными, что связано с низкой информативностью используемых ранее, в том числе и классических, методов исследования. Применительно к сперматогенному эпителию (СЭ) для описания морфологических характеристик целесообразно использование маркера стволовых клеток — c-kit, экспрессия которого позволяет выявить изменения в их количестве, и маркера пролиферации Ki-67. Целью данной работы являлось исследование иммуногистохимических и морфометрических характеристик СЭ крыс на фоне воздействия НЧ ТiO2. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовали половозрелых самцов крыс Вистар (n=38) массой 170-210 г. Всех животных содержали в одинаковых условиях вивария на стандартном сбалансированном рационе, при свободном доступе к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУН Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (протокол № 2 от 25.04.2016 г.). Влияние НЧ ТiO2 на морфофункциональные показатели семенников изучали после перорального введения крысам исследуемого соединения в дозе 50 мг/кг массы животного. В работе использовалась дисперсия диоксида титана (рутильная форма, 40-60 нм), полученная разведением порошка ТЮ2 в дистиллированной воде. Агрегацию НЧ предотвращали обработкой суспензии нанодисперсного ТЮ2 в ультразвуковой ванне. Контрольную группу составляли интактные крысы (n=18). Животных опытных групп выводили из эксперимента на 14-е сутки (1-я группа, n=10) и 30-е сутки (2-я группа, n=10) декапитацией с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в приложении 4 к "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ № 755 от 12 августа 1977 г. МЗ СССР "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных"). Для проведения гистологического исследования семенники фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Заливку в парафин осуществляли по общепринятой методике. После этого готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием микроскопа "Axiolmager Z1" ("Carl Zeiss"). Иммуногистохимические исследования осуществляли на парафиновых срезах толщиной 6-8 мкм. В качестве первичных поликлональных антител применяли c-kit и Ki-67 ("Santa Cruz Biotechnology"). Использовали поликлональную непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND ("Novocastra"). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антител. Клетки подсчитывали в 20 полях зрения каждого образца при увеличении 400 на поперечно ориентированных срезах. Пролиферативную клеточную активность оценивали по процентному соотношению позитивно окрашенных на Ki-67 клеток и негативно окрашенных клеток (на 100 просчитанных клеток). Морфометрические исследования заключались в оценке толщины СЭ и диаметра поперечного сечения извитых семенных канальцев (ИСК). Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе "Statistica 7.0" ("StatSoft Inc."). Для всех имеющихся выборок проводили анализ соответствия вида распределения количественных признаков закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро—Уилка. Сравнительный анализ групп осуществляли с помощью параметрических методов (t критерий Стьюдента), Количественные данные представлены в виде среднего значения+стандартная ошибка. Различия считали статистически значимыми при р< 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Морфологическая картина семенников крыс контрольной группы соответствовала стандартной для этих животных (рисунок, а). На гистологических препаратах четко визуализировались плотно расположенные ИСК округлой формы, пространство между которыми было заполнено интерстициальной тканью, в которой определялись клетки Лейдига. На базальной мембране СЭ определялись сперматогенные клетки на разных стадиях сперматогенеза, ассоциированные с клетками Сертоли. При исследовании семенников крыс, подвергшихся воздействию НЧ Ti02, были выявлены выраженные морфологические изменения. Так, к 14-м суткам эксперимента в ИСК отмечались дистрофические изменения СЭ, проявляющиеся в его деструкции: появление пустот в цитоплазме клеток Сертоли и отрыв СЭ от базальной мембраны. Возможно, вакуолизация косвенно свидетельствует о нарушении интегративных связей развивающихся гамет и сустентоцитов, причем к 30-м суткам экспериментального воздействия указанные морфологические изменения были более выраженными (рисунок, б). Следует отметить, что в этих условиях наблюдалось резкое уменьшение числа сперматид, в результате чего эпителиальный слой был представлен только тремя генерациями половых клеток: сперматогониями, сперматоцитами первого и второго порядка. Согласно существующим представлениям, толщина эпителия коррелирует с количеством клеток в его составе. Применительно к СЭ уменьшение его толщины может быть обусловлено в том числе редукцией числа герминативных клеток. Этот факт указывает на низкую регенерационную способность СЭ как тканевой системы, и в этих условиях сперматогенез, характеризующийся высокой пролиферативной активностью вовлеченных в него клеток, оказывается уязвимым. Отсутствие зрелых сперматид в семенниках животных опытных групп нашло отражение в изменении морфометрических параметров СЭ (таблица), В семенниках крыс обеих опытных групп снижалась толщина СЭ, что может быть следствием негативного воздействия НЧ ТiO2на структурные характеристики семенников, проявляющиеся в уменьшении общего количества клеток в эпителии. Естественно, что такие изменения не могут не сказаться на процессах сперматогенеза. На угнетение сперматогенеза косвенно указывает и уменьшение диаметра ИСК к 14-м суткам эксперимента. К 30-м суткам отмечалась тенденция к увеличению указанного параметра, что, по-видимому, связано с вакуолизацией клеток Сертоли, дезорганизацией слоев и отрыва сперматогенных клеток от базальной мембраны. Полученные нами данные о структурных характеристиках семенников крыс опытных групп хорошо соотносятся с результатами иммуногистохимического исследования. Иммуногистохимическое типирование позволило выявить максимальные изменения на 30-е сутки от начала эксперимента. В условиях воздействия НЧ ТiO2 в течение 30 сут наблюдалось снижение уровня экспрессии маркера пролиферации Ki-67 (рисунок), что свидетельствует о нарушении процессов пролиферации клеток СЭ. Аналогичная картина наблюдалась и при анализе экспрессии маркера стволовых клеток c-kit: к 30-м суткам от начала экспериментального воздействия количество клеток, содержащих этот маркер, существенно снижалось по сравнению с контролем (рисунок). Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что негативное действие НЧ ТiO2 на СЭ крысы затрагивает ключевые для этой структуры показатели — пролиферативную активность клеток и их способность к дифференцировке. Полученные нами данные необходимо учитывать при разработке мер безопасности в условиях производства и использования наноматериалов.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.241-245. Библ. 15 назв.
Просмотров: 66