МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ТКАНЕВОЙ РЕАКЦИИ НА ПОДКОЖНУЮ ИМПЛАНТАЦИЮ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗИРОВАННЫХ МАТРИКСОВ

Аннотация:

На основании данных морфологического анализа проведена гистологическая оценка тканевой реакции крысы на подкожную имплантацию децеллюляризированных матриксов интраторакальных органов и тканей. Изучен качественный клеточный состав воспалительного инфильтрата с оценкой динамики изменения количества макрофагов, Т- и В-лимфоцитов на 7-е и 14-е сутки после начала эксперимента. Показано, что реакция на имплантацию зависит не только от качества децеллюляризации и эффективности удаления молекул-антигенов, но и от исходной гистологической структуры, а также качества предимплантационной подготовки образца. Ключевые слова: децеллюляризация, биологические каркасы, тканевая инженерия, крысы Существует большое количество методик и способов получения децеллюляризированных матриксов, основанных как на физических и химических, так и на ферментативных воздействиях на орган-мишень. В результате в получаемой конструкции, как правило, не содержатся сохранные клетки и продукты их распада и в значительной степени сохраняется сложная геометрия органа, в том числе относительно нетронутая сосудистая сеть. Методика получения децеллюляризированного матрикса играет большую роль в последующей реакции тканей реципиента на имплантацию тканеинженерной конструкции. Необходимо найти тонкую грань между необходимостью полного удаления молекул-антигенов и сохранением качественного состава белков внеклеточного матрикса (ВКМ) органа. Одним из этапов изучения качества децеллюляризации органов является подкожная имплантация каркасов. Данная процедура помогает определить in vivo, насколько эффективно удалены клеточно-ассоциированные белки, а также их вклад в ответ тканей на имплантацию. Также можно уточнить местную реакцию тканей на применявшиеся в ходе децеллюляризации агрессивные химические вещества, которые, возможно, адгезировали к молекулам белков ВКМ. Цель данной работы — сравнительное изучение биосовместимости, биодеградации, местной тканевой реакции на имплантацию децеллюляризированных ВКМ интраторакальных органов и тканей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Работа выполнена на крысах-самцах Вистар (n=20) массой 210±40 г на базе лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины Кубанского государственного медицинского университета в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1972 г.) и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.) после одобрения протокола исследования локальным этическим комитетом (протокол № 21/1). Процедура эксплантации органокомплексов выполнялась после интраперитонеального введения летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг). Децеллюляризацию диафрагмы, легких, сердца крысы выполняли по модифицированным протоколам детергент-энзиматическим методом с использованием дезоксихолата натрия и ДНКазы. Предварительно были получены ацеллюлярные матриксы, не содержащие неповрежденных клеток и клеточных ядер и состоящие из белков ВКМ — коллагенов I и IV, ламинина, эластина, фибронектина. Из них были подготовлены имплантаты размером 0.5x1 см, которые перед оперативным вмешательством стерилизовали погружением в 10% раствор этанола на 15 мин с последующей 3-кратной отмывкой стерильным фосфатным буферным раствором. Животных наркотизировали растворами золетила (6 мг/кг; Zoletil 100) и ксилазина (0.5 мл/кг; Rometar, "Spofa"). Под кожу в межлопаточной области были помещены образцы исследуемых каркасов. Крысы были разделены на 3 группы: 1 -я — имплантация децеллюляризированного матрикса легкого; 2-я — имплантация децеллюляризированного матрикса диафрагмы; 3-я — имплантация децеллюляризированного матрикса сердца. Крыс выводили из эксперимента летальной дозой барбитуратов (150 мг/кг) на 7-е и 14-е сутки после начала эксперимента. Имплантат вместе с окружающими тканями выделяли хирургически, полученные образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине, дегидратировали с последующим заключением в парафин с помощью гистопроцессора "Leica" ТР1020 по стандартной методике. Заливку в парафин выполняли на модульной установке EG1150Н ("Leica"). Для общегистологической оценки препаратов с помощью ротационного микротома RM2235 ("Leica") получали парафиновые срезы толщиной 4 мкм на высоко адгезивных стеклах с последующей депарафинизацией, гидратацией, окрашиванием гематоксилином и эозином ("Sigma-Aldrich"). Проводили качественную оценку состава клеточного инфильтрата вокруг имплантата с помощью иммуногистохимического анализа. Для этого срезы депарафинизировали и гидратировапи, блокировали эндогенную пероксидазную активность 3% раствором Н202 в течение 10 мин, демаскировали антигены в цитратном буферном растворе (ab64236; "Abeam") на водяной бане в течение 40 мин. Реакции проводили со следующими первичными антителами: anti-CD3 (аЫ6669), anti-CD8 (ab33786), anti-CD20 (ab85809) ("Abeam"). Препараты дополнительно докрашивали гематоксилином Майера в течение 10 с. Нами была выбрана система детекции с использованием набора Rabbit specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit (ab64261; "Abeam"). Для морфологического обнаружения активированных провоспалительных макрофагов проводили иммуногистохимическую реакцию с антителами к маннозному рецептору макрофагов (ab64693; "Abeam"). В данном случае мы использовали флюоресцентную систему детекции со вторичным антителом Goat polyclonal Secondary Antybody to Rabbit IgG-H&L (Alexa Fluor 488, ab150081; "Abeam") в концентрации 1:500. Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе "Olympus" СХ41. Подсчет количества клеток, имевших положительную реакцию с антителами к исследуемым рецепторам, проводился на срезах в 4-5 полях зрения при увеличении 400 ручным методом. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В 1-й группе животных (имплантация ацеллюлярного матрикса легкого) уже на 7-е сутки происходило формирование тонкой соединительнотканной капсулы вокруг имплантата толщиной до 500 мкм, содержавшей полнокровные сосуды, пролиферирующие фибробласты и мононуклеарные клетки. Поры материала пропитывались фибрином, в нем обнаруживали диффузно-очаговую инфильтрацию лимфоцитами и макрофагами с незначительной примесью нейтрофилов. Окружающие капсулу ткани — отечные, содержали умеренное количество воспалительного клеточного инфильтрата, пролиферирующие фибробласты и новообразованные сосуды. На 14-е сутки произошло заметное уменьшение имплантата в размере за счет снижения степени выраженности отека тканей, уплотнения и уменьшения расстояния между коллагеновыми волокнами ацеллюлярного матрикса. Ткани имплантата проросли новообразованными тонкостенными сосудами. Деградация ВКМ не была выражена. Заметно снизилась степень воспалительной клеточной реакции как внутри материала имплантата, так и в окружающих тканях. И если изначально в инфильтрате присутствовали различные клетки, такие как Т-лимфоциты (СDЗ+-клетки), В-лимфоциты (СD20+-клетки) и провоспалительная фракция макрофагов (положительная реакция клеток с антителами к маннозному рецептору макрофагов), то уже на 14-е сутки в инфильтрате оставалось лишь умеренное количество В-лимфоцитов (рис. 1; таблица). Во 2-й группе (имплантация ацеллюлярного матрикса диафрагмы) через 7 сут матрикс сохранял пористую структуру. Вокруг каркасов формировалась соединительнотканная капсула из грануляционной ткани толщиной до 900 мкм, происходило врастание тяжей фибробластов внутрь имплантата. Клеточная воспалительная реакция была значительно выражена, в инфильтрате присутствовали как мононуклеарные клетки (Т-, В-лимфоциты, макрофаги), так и сегментоядерные лейкоциты, в том числе и эозинофильные. В тканях, окружающих капсулу, была значительно выражена отечность, обнаруживались полнокровные сосуды, преимущественно вокруг области имплантации. На 14-е сутки произошло заметное снижение отечности тканей, уплотнение и деградация ВКМ диафрагмы, резорбция его макрофагами и прорастание новообразованными сосудами с развитием в них явлений продуктивного капиллярита. Выраженность воспалительной клеточной реакции как внутри образца, так и в окружающих тканях заметно снизилась за счет уменьшения количества активированных макрофагов и Т-лимфоцитов. Содержание В-лимфоцитов в инфильтрате, как и в случае с имплантацией децеллюляризированных легких, явных изменений не претерпело (таблица; рис. 2). Морфологический анализ образцов 3-й группы (имплантация децеллюляризированного матрикса сердца) выявил развитие выраженной воспалительной реакции в месте операции. Имплантат на 7-е сутки был полностью окружен зоной демаркационного воспаления толщиной до 2 мм, состоящей из сегментоядерных лейкоцитов, В- и T-лимфоцитов, провоспалительно активированных макрофагов. Пролиферации фибробластов и образования соединительнотканной капсулы вокруг имплантата обнаружено не было. К 14-м суткам зона имплантации была также обильно васкуляризирована (до 5-6 сосудов в поле зрения при увеличении 400) и окружена плотной капсулой из фиброзной ткани с небольшим количеством сосудов. На фоне незначительного снижения сохранения числа Т-лимфоцитов (на 38%) и активированных макрофагов (на 42%) в инфильтрате внутри и вокруг имплантата на треть возрастало количество В-лимфоцитов (таблица; рис. 3). Полученные результаты позволяют рассматривать методику подкожной имплантации децеллюляризированных матриксов как важный этап in vivo оценки реакции тканевого ответа организма-реципиента в ответ на имплантацию тканеинженерных конструкций. У большинства исследователей остаются вопросы — является ли источник ткани или метод ее обработки основным фактором, определяющим реакцию организма реципиента. Мы намеренно взяли для исследования матриксы разных по своей гистологической структуре органов—легкого, диафрагмы и сердца, обработанных с применением схожих методик. Предыдущие исследования, направленные на ex vivo оценку данных ВКМ, показали полное их соответствие современным критериям оценки качества децеллюляризации. Полученные результаты обнаружили различную тканевую реакцию организма-реципиента на имплантацию ВКМ. Наименее выраженным был ответ на ВКМ легкого, который успешно интегрировался в ткани и не претерпевал существенных изменений. В 1-й группе имела место тенденция к полному снижению количества макрофагов и Т-лимфоцитов, что свидетельствует о хорошей биосовместимости и низкой иммуногенности и токсичности матриксов. Имплантация ВКМ мышечных органов, таких как диафрагма и сердце, привела к более выраженной макрофагальной резорбции матриксов и воспалительному ответу тканей. Во 2-й и 3-й группах содержание сегментоядерных лейкоцитов было значительно выше, чем в 1-й группе. Однако при ортотопической трансплантации диафрагмы, проведенной нами ранее, подобная морфологическая картина отсутствовала, что ставит все новые вопросы относительно различий тканевой реакции организма на гетеро- и ортотопическую трансплантацию имплантата. Также прослеживалась тенденция к увеличению содержания В-лимфоцитов, появлению эозинофилов в инфильтрате, при снижении количества макрофагов и Т-лимфоцитов. Мы связываем данные отличия с более плотной структурой и, как следствие, худшей отмывкой матрикса от детергентов и энзимов, а также с благоприятными условиями для развития бактериальной контаминации. Таким образом, тканевая реакция на имплантацию зависит от качества не только децеллюляризации и эффективности удаления молекул-антигенов, но и качества предимплантационной подготовки образца. Работа выполнена при поддержке государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (от 28.01.2015 г. ч. 1, раздел 1) "Разработка экспериментальных образцов тканеинженерных конструкций на основе децеллюляризированных матриксов для применения в регенеративной медицине" и комплексной НИР "Клеточные механизмы регенерации интраторакальных органов и тканей. Разработка тканеинженерных конструкций с использованием биологических и синтетических каркасов".

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.251-256. Библ. 9 назв.
Просмотров: 101