АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ГЛИАЛЬНОГО НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА ГОЛОВНОГО МОЗГА

Аннотация:

Разработана методика моделирования хронического окислительного стресса in vitro с использованием фермента глюкозооксидазы. Моделирование окислительного стресса приводит к достоверному увеличению количества погибших клеток в культуре. Показано, что глиальный нейротрофический фактор обладает выраженным антиоксидантным эффектом. Выявлено достоверное снижение доли мертвых клеток в культуре при превентивном применении глиального нейротрофического фактора в концентрации 1 нг/мл. Ключевые слова: глиальный нейротрофический фактор, хронический окислительный стресс, первичные диссоциированные культуры, нейропротекция Глиальный нейротрофический фактор головного мозга (GDNF) рассматривается как один из возможных кандидатов в терапевтические агенты при самых сложных и многофакторных патологиях ЦНС. Показана его защитная роль при болезнях Альцгеймера и Паркинсона, при ишемическом повреждении. Изучение механизмов функционирования и адаптации нервной системы к условиям стресса является сложной и актуальной задачей современной нейробиологии и медицины. Одним из патологических механизмов, приводящих к усилению нейродегенерации при патологических состояниях, является активация окислительного стресса (ОС) и увеличение свободнорадикального окисления биомолекул клеток нервной системы. Описаны сложные рецепторзависимые молекулярные каскады нейропротективного действия GDNF и дистанционное влияние данного нейротрофина за счет миграции комплекса GDNF-GFRa к соседним клеткам, содержащим свободный внеклеточный кадгеринподобный домен Ret-киназы. Однако его влияние на выживаемость нейронов в условиях ОС остается неизученным вопросом. ОС для нервной ткани является одним из ключевых патофизиологических звеньев развития целого ряда заболеваний, поскольку нейроны лишены некоторых ферментов, отвечающих за антиоксидантную защиту клеток, и любое, даже незначительное увеличение интенсивности свободнорадикальных реакций может рассматриваться для нервных клеток как критическое. Наибольший интерес вызывает вопрос о непосредственном действии GDNF на клетки нервной системы без вовлечения системных защитных реакций организма. В связи с этим оптимальным является исследование влияния GDNF на выживаемость нейронов при моделировании ОС в условиях in vitro. Одним из принципиальных аспектов моделирования ОС является создание модели хронического стресса. Большинство существующих и применяемых моделей—это модели острого стресса, которые связаны с определением антиоксидантной емкости системы, однако настоящая патологическая реакция возможна только при возникновении долговременного хронического стресса. Цель данного исследования — разработать модель хронического ОС и изучить антиоксидантные свойства GDNF в условиях хронического ОС in vitro. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалом для исследований служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученных от 18-дневных эмбрионов мышей линии C57BI/6. Животных содержали в соответствии с Приказом Минздрава России № 267 от 19.06,2003 г. "Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации" и Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 1986 г.). Ферментативную диссоциацию клеток эмбрионального гиппокампа проводили при помощи обработки гиппокампа 0.25% раствором трипсина ("Gibco"). Культивирование первичных культур осуществляли в нейробазальной среде "Neurobasal" ('Thermo Fisher Scientific") в комплексе с биоактивной добавкой В27 ('Thermo Fisher Scientific"), L-глутамином ("Thermo Fisher Scientific") и ЭТС ("ПанЭко") по ранее разработанному протоколу в течение 21 сут in vitro (DIV) на стеклах, покрытых полиэтиленэмином ("Sigma") для повышения адгезии клеток на их поверхность. Исходная плотность культуры на матрице составляла 9000 кп/мм2, Жизнеспособность культур поддерживали в условиях СО2-инкубатора (МСО-18AIC; "Sanyo") при 35.5°С и газовой смеси, содержавшей 5% СО2. Оценку жизнеспособности клеток проводили на 1,3 и 7-й день после моделирования ОС. Подсчитывали количество клеточных ядер, окрашенных PI ("Sigma") (мертвые клетки) и ядер, окрашенных бис-бензимидом ("Sigma") (все клетки культуры). Визуализацию окрашенных клеточных ядер проводили с помощью инвертированного флюоресцентного микроскопа "AxioObserver А1" ("Carl Zeiss"). Долю погибших клеток рассчитывали как соотношение (в %) между бис-бензимид-позитивными и Pl-позитивными клетками. Полученные данные статистически обрабатывали в программе "SigmaPlot 11.0" ("Systat Software, Inc.") с помощью ANOVA. Различия считали достоверными при р<0.05. Данные представляли в виде среднего±стандартная ошибка среднего (M±SEM). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. На первом этапе исследований была разработана методика моделирования хронического ОС. Наиболее часто применяемые методы моделирования ОС связаны с однократным добавлением Н202, однако данный подход не позволяет адекватно оценить процессы адаптации нервной системы. Однократное добавление Н202 скорее является методом оценки антиоксидантной емкости системы, поскольку время жизни в белковом растворе такой высокореакционной частицы, как Н202, составляет менее 0.1 с. Для оценки системного действия окислительного дисбаланса нами был разработан метод моделирования ОС с помощью фермента глюкозооксидазы и подобраны ее оптимальные концентрации (рис. 1). Данный фермент катализирует дегидрирование глюкозы и перенос отнятого водорода на кислород воздуха с образованием Н2Оа, при этом глюкоза окисляется до глюконолактона. Накопление Н202, в свою очередь, приводит к образованию большого количества гидроксид-радикала, который, являясь сильным окислителем, нарушает структуру ряда клеточных структур, в том числе клеточную мембрану. Этот процесс осуществляется до тех пор, пока фермент находится в работоспособном состоянии, а в среде имеется достаточное количество субстрата, т.е. реакция может протекать несколько часов и даже суток. В отличие от добавления в среду непосредственно Н202, аппликация фермента приводит не к локальному повреждению, а носит системный, хронический характер, повреждая большое число клеток. В культуральной среде содержится порядка 20 ммоль глюкозы и даже при снижении ее концентрации в результате жизнедеятельности культуры этого количества достаточно для постоянной работы фермента. Условия ОС моделировали на 14-й день развития культуры. Согласно ранее полученным данным, на данном сроке развития в культуре преобладают химические синапсы, наблюдается спонтанная биоэлектрическая и кальциевая нейросетевая активность. ОС моделировали путем аппликации в культуральную среду глюкозооксидазы в концентрациях 20 и 50 нг/мл. В присутствии глюкозооксидазы клетки инкубировали в течение 1 сут, после чего оценивали жизнеспособность культуры: долю мертвых клеток в культурах определяли после моделирования ОС (рис. 2) Показано, что аппликация фермента в концентрации 20 нг/мл достоверно (р<0.001) увеличивала число мертвых клеток в культуре более чем в 5 раз по сравнению с интактной группой. Доля мертвых клеток через 24 ч после аппликации фермента составила 52.5±7.4% от общего числа клеток в культуре. Также было выявлено, что применение фермента в концентрации 50 нг/мл приводит к гибели большей части клеток (79.8±9.6%) уже на 1-е сутки. На 7-е сутки наблюдения в культуре не оставалось жизнеспособных нейронов. Оценка жизнеспособности была затруднительна, так как разрушалась большая часть ядерного материала клеток культуры. В связи с этим для дальнейших исследований была выбрана концентрация 5 нг/мл. При исследовании антиоксидантных свойств GDNF оценивали жизнеспособность во всех группах на 1,3 и 7-е сутки после воздействия (таблица). Показано, что за 7 сут наблюдения (15-21-е сутки развития) жизнеспособность в интактной группе достоверно не изменялась. В группе ОС уже в 1-е сутки регистрировалось достоверное (р<0.05; ANOVA) увеличение доли мертвых клеток в культуре. К 3-м суткам доля мертвых клеток увеличивалась еще в 3.3 раза, а на 7-е сутки этот показатель вырос еще больше (таблица). Проведенный морфологический анализ позволяет предположить, что при моделировании ОС преобладают процессы апоптотической гибели, так как через 7 сут после воздействия наблюдалось большое количество фрагментов клеток, напоминающих апоптотические тельца (рис.3). Для исследования роли GDNF в реализации адаптационных процессов нервной системы в условиях действия ОС и выявления его защитного потенциала была проведена оценка антиоксидантных эффектов, оказываемых GDNF, на жизнеспособность клеток первичных диссоциированных нейрональных культур. Нами было выявлено, что превентивное применение 1 нг/мл GDNF (группа OC+GDNF) оказывало выраженный антиокислительный эффект. На протяжении всего периода наблюдения доля мертвых клеток в культуре была достоверно (р<0.05) ниже, чем в группе ОС и не отличалась от значений интактных культур. Исследование морфологии культур также не выявило значимых различий с интактными культурами (рис.3). Поскольку GDNF является крупномолекулярным белком, то сам выступать как акцептор продуктов свободнорадикального окисления он может только в очень узком диапазоне, следовательно, можно предположить, что защитные эффекты GDNF связаны с активацией внутриклеточных механизмов посредством активации GFR-рецепторов. Однако данное предположение требует дальнейшего исследования.

Авторы:

Издание: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 8.-С.257-260. Библ. 11 назв.
Просмотров: 65