НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ в цитологии и гистологии

Аннотация:

В обзоре приведен анализ новых методических разработок и технических усовершенствований, появившихся за последние годы в световой микроскопии и направленных на увеличение оптического разрешения и качества светооптического изображения. Рассмотрены возможности и недостатки методов: «световой пластинки», лазерной сканирующей конфокальной и 2-фотонной микроскопии, 4Pi и FRET, TIRF, STED, STROM, PALM и GSD-микроскопии. Проанализированы достижения и проблемы новых методов световой микроскопии. Приведенные методы позволили значительно расширить исследовательские возможности, способствовали улучшению качества изображений, однако они так и не смогли обойти дифракционный предел, открытый Э.К. Аббе. Ключевые слова: световая микроскопия, методы. Присуждение Нобелевской премии 2014 г. в области химии за разработку методов так называемой сверхразрешающей световой микроскопии (СРСМ) подвело своеобразный итог стремительному рывку, который совершила за последние 30 лет световая микроскопия (СМ). Был опубликован ряд обзорных статей, посвященных возможностям сканирующей лазерной конфокальной микроскопии, на русском языке (Ченцов, 1994; Лежнев и др., 2001; Азнабаев и др., 2006; Кларк, Эберхардт, 2007; Феофанов, 2007; Лукашева и др., 2008; Коржевский и др., 2009; Ковалев, 2010; Незлин, 2010; Митрошина, 2012; Федоров, 2013) и много блестящих книг и статей на английском языке (Diaspro, 2001; Fornasiero, Opazo, 2015; Sheppard, 2017). При этом появилась своеобразная эйфория, связанная с ожиданиями того, что СРСМ вытеснит электронную микроскопию (ЭМ). Однако оригинальных статей с новыми, неизвестными ранее результатами, полученными с использованием СРСМ, опубликовано сравнительно немного. В связи с этим мы попытаемся критически оценить возможности методов СРСМ. При этом мы остановимся преимущественно на оригинальных работах, давших начало новым методам, и статьях, в которых эти методы используются или усовершенствуются. Особое внимание также будет уделено проблемам реально достижимого в исследованиях оптического разрешения. Для того чтобы понять, как новые методические подходы влияют на разрешение, получаемые результаты и можно ли доверять этим результатам, необходимо знать, какие принципы положены в основу метода. В настоящем обзоре мы кратко остановимся преимущественно на новых методах СМ, которые позволяют непосредственно увеличить оптическое разрешение, не углубляясь при этом в подробное описание физических основ того или иного метода. Современные разработки, направленные на увеличение оптического разрешения световых микроскопов. Одним из таких методов является метод «световой пластинки» (Light Sheet Fluorescence Microscopy; LSFM). Он был разработан для исследования толстых образцов и получения оптических срезов на глубине более 100 мкм (Heintzmann, Cremer, 1999; Pampaloni etal., 2015). Метод получил свое название из-за формы светового луча, который трансформируется специальными линзами в очень узкий параллелограмм, или «световую пластинку». Обычно объект освещается «световой пластинкой» через объектив, расположенный сбоку перпендикулярно оси объектива, используемого для наблюдения (рис. 1, а). Метод снижает фототоксичность и фотовыцветание образца почти в 10 000 раз по сравнению с конфокальными микроскопами. Если освещать образец «световой пластинкой», то теоретическое разрешение по оси Z будет равно толщине светового пучка (Chen et al., 2014; Strobl etal., 2017). Другим подходом для увеличения разрешения по оси является изучение криосрезов толщиной 90 нм под световым микроскопом (Dunlop et al., 2017). Еще одной прогрессивной разработкой стал метод флуоресцентной микроскопии на основе затухающей электромагнитной волны (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy; TIRF-микроскопия). В флуоресцентном микроскопе используется затухающая электромагнитная волна, которая генерируется при полном отражении света от границы сред (например, стекла и воды). При этом часть энергии излучения распространяется в твердой фазе в виде быстро затухающей (эванесцентной) электромагнитной волны (рис. 1, б), которая способна возбуждать флуорофоры (Fornasiero, Opazo, 2015). Данный подход может применяться в микроскопах самых разных оптических конфигураций, оснащенных как ртутной лампой, так и лазерами. Именно в случае TIRF-микроскопии при использовании иммерсионных объективов было достигнуто максимальное значение числовой апертуры (1.65). Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (Laser Scanning Confocal Microscopy; LSCM) является конечным этапом технических разработок в области сканирующей световой конфокальной микроскопии. В LSCM источник создает узкий пучок света, освещающий только одну точку в поле зрения (рис. 2, а). При этом луч движется по образцу, осуществляя растровое сканирование с помощью системы зеркал. Число фотонов, проходящих через периферические зоны поля зрения, меньше, поэтому качество изображения в центре образца значительно выше. Фокусирование луча лампы или лазера происходит с помощью диафрагмы, которая отсекает большую часть фотонов, испускаемых флуорофорами выше или ниже оптической фокальной плоскости (рис. 2, б). Тем не менее часть фотонов из этих плоскостей все же попадает на детектор, создавая «фон» и увеличивая размер точки образца по оси Z. Получить изображение с высоким разрешением и довольно низким уровнем «фона» можно, если, последовательно поднимая (опуская) объектив, получить серийные оптические срезы или «Z-стопку», на основе которых можно также построить 3D-модель объекта (рис. 2, г). При этом в каждый момент времени будет регистрироваться то количество фотонов, которое испускается из одной точки образца. Далее регистратор каждому пикселю (физическому элементу матрицы регистрирующих камер (дисплеев), формирующих изображение) присваивает число, пропорциональное числу зарегистрированных фотонов. Полное изображение строится компьютером путем присваивания каждому пикселю величины яркости, пропорциональной числу фотонов, полученных от каждой точки фокальной плоскости. Снизить «фон» и увеличить качество изображения можно также уменьшая размер отверстия диафрагмы. Однако при этом количество фотонов, попадающих на образец, резко уменьшается, и возникает необходимость в увеличении яркости и длительности облучения образа, что повышает опасность выцветания флуорофора. Считается, что разрешение LSCM приблизительно в 1.4 раза выше, чем у «классического» светового микроскопа. Модификация LSCM на основе диска Нипкова позволяет увеличить скорость получения изображения (рис. 2, в) и представляет собой вращающийся диск с рядами узких отверстий, покрывающих его поле. Для увеличения разрешения по оси Z в конфокальной лазерной сканирующей микроскопии используются так называемые 4Рi-микроскопы (Cremer et al., 1978; Hell et al., 1994). В них для возбуждения молекулы флуорофора, расположенной в одной точке пространства, и (или) регистрации флуоресценции используются два объектива (направленных один на другой), которые позволяют освещать и регистрировать флуоресценцию с двух сторон от образца (рис. 3,а). При этом изображение точки в зоне фокуса вместо формы овоида приобретает форму центральной крупной точки и двух более мелких — выше и ниже фокуса (рис. 3,б). Затем по определенному математическому алгоритму происходит деконволюция изображения (восстановление истинной формы сигнала), при этом верхняя и нижняя точки отсекаются. Однако из-за того, что фиксированная или живая клетка резко гетерогенна по своим физико-химическим параметрам, «отсечение» фона остается во многом субъективной операцией. Коммерческий опыт реализации 4Рi-микроскопов показал, что их преимущества (рис. 3, в, г) нивелируются возросшим неудобством в работе (например, достаточно трудно найти объект и правильно его расположить между двумя объективами) и стоимостью. Эффект выцветания флуорофора при использовании LSCM нашел практическое применение в научных исследованиях, например при изучении диффузии белков после индуцированного выцветания флуорофора (рис. 4, в); транспорта белков или липидов, меченных флуорофором (рис. 4, д); клеточных структур, в том числе их структурных и функциональных связей (рис. 4, а, б, г, д, ё). Снизить фототоксичность и увеличить проникающую способность удалось при разработке 2-фотонного микроскопа (Two-Photon Microscopy; ТРМ). Идея ТРМ-микроскопии основана на том, что хотя вероятность одновременного попадания двух фотонов на одну молекулу флуорофора при низкой интенсивности излучения мала, но она резко увеличивается при фокусировке очень мощного и довольно кратковременного импульса света. Одновременное попадание двух фотонов обычно с длиной волны, соответствующей красному свету, вызывает возбуждение флуорофора, который потом испускает один фотон, длина волны которого соответствует зеленому свету (Denk etal., 1990). В теории разрешение 2-фотонного микроскопа меньше, чем LSCM, так как в нем обычно используются флуорофоры, которые возбуждаются красным светом и, следовательно, испускают свет с большей длиной волны, чем в LSCM (где могут использоваться голубой и ультрафиолетовый свет, а регистрироваться синий свет). В последнее время интенсивно разрабатываются микроскопические системы (Betzig, Trautman, 1992; Klar etal., 2000; Hess etal., 2006; Sydor etal., 2015), которые при помощи различных технических приемов позволяют если не преодолеть, то обойти дифракционный барьер Аббе (Abbe, 1873). Остановимся, на наш взгляд, на наиболее значимых из них. STED-микроскопия (Stimulated Emission Depletion Microscopy; STED) или микроскопия на основе подавления спонтанного испускания фотонов использует феномен обратимого подавления флуоресценции с помощью облучения флуорофора светом с большей длиной волны, чем свет, вызывающий флуоресценцию (Klar et al., 2000). При реализации метода образец сначала облучается импульсом света лазера с такой длиной волны, которая способна возбудить флуорофор, затем немедленно точка облучается светом с длиной волны, сдвинутой в сторону красного спектра. При этом луч имеет форму круга с очень узким пустым центром (дыркой) (рис. 5, а). Попадание второго кругового (с отверстием в центре) пучка света на зону с возбужденным флуорофором ведет к тому, что последний теряет возбуждение и не испускает фотоны. При встрече флуорофора, находящегося в возбужденном состоянии, с фотоном, энергия которого соответствует разнице энергий между возбужденным и основным состояниями флуорофора, флуорофор возвращается в невозбужденное состояние до того, как произойдет спонтанная флуоресценция. Таким образом, объем образца, из которого исходит флуоресценция, уменьшается за счет перевода части молекул по краям пятна засветки в состояние, при котором они не способны излучать свет на рабочей длине волны сфокусированного лазерного излучения. Исключение составляет только центральная точка, которая не была засвечена вторым лучом. Из нее и испускаются фотоны, регистрируемые детектором в виде фотоэлектронного умножителя или цифровой камеры. Таким образом, STED-микроскопия позволяет достичь высокого разрешения в центральной области фокусного пятна (рис. 5, 6-1, 6-З). STED-микроскопы продолжают совершенствоваться. Был добавлен второй источник облучения, что позволило улучшить качество изображения (Gao, Nienhaus, 2017). В ряду разработок СРСМ, позволяющих обойти дифракционный барьер, — методы статистического определения локализации точечного источника света. Так, например, при достаточно низкой концентрации «примесных» молекул в каждый момент времени, внутри каждого дифракционно ограниченного объема образца люминесцирует только одна молекула. Это позволяет зарегистрировать ее изображение и координаты. Регистрация нескольких последовательных вспышек дает возможность вычислить место, где вспышки появляются с наибольшей частотой. Для этого высчитывается среднестатистический центр тяжести поля точек, этот центр описывается как сама точка, которая запоминается компьютером. Эта точка и принимается за место расположения флуорофора (рис. 5, в). Такая точка объекта обычно определяется после получения 1000 изображений, а принципы статистической обработки точечных источников света, примененные в STED-микроскопии, позволили повысить разрешение (Klar et al., 2000). Идея случайной последовательной активации флуорофоров с последующим определением положения излучающей точки статистическими методами лежит в основе STORM- (Rust et al., 2006; Huang et al., 2008) и PALM-микроскопии (Betzi et al., 2006). Стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STochastic Optical Reconstruction Microscopy; STORM) позволяет получить изображения клеток с высоким разрешением. В ней используется последовательное возбуждение молекул флуорофоров таким образом, чтобы каждая молекула была представлена в виде одной дифракционной точки. Это, в частности, возможно при использовании излучения малой мощности, достоверно возбуждающего лишь небольшую часть присутствующих в объекте флуорофоров. Повторяющиеся циклы импульсов позволяют определить положение всех молекул, а при наложении дают изображение с высоким разрешением и точными координатами каждой молекулы флуорофора. Первоначально были получены двухмерные STORM-изображения с заявленным латеральным разрешением 20—30 нм. Добавление 3-й координаты было достигнуто путем использования «астигматического» метода получения изображений, который генерирует две незначительно отличающиеся фокальные плоскости, анализируя эллиптичность и ориентацию изображения флуорофора, что позволяет определить положение молекулы по оси Z с точностью до 50—60 нм. Для построения трехмерного изображения биологических объектов применяют слабые цилиндрические линзы. У таких линз фокальные плоскости в направлениях X и Y несколько различаются. Поэтому эллиптичность и ориентация изображения флуорофора зависят от его положения по оси Z. Если флуорофор находится в средней фокальной плоскости (примерно посередине между фокальными плоскостями X и Y), то функция рассеяния точки изодиаметрична (имеет одинаковую длину по осям X и Y). Когда флуорофор находится выше фокальной плоскости, изображение больше сфокусировано по оси Y, чем X, поэтому оно выглядит не круглым, как в предыдущем случае, а овальным. Наоборот, если флуорофор находится ниже средней фокальной плоскости, функция рассеяния точки оказывается вытянутой вдоль оси Y. Фотоактивирующая световая микроскопия (Photo-Activated Localization Microscopy; PALM) основана на использовании возбуждающего излучения малой интенсивности. Она имеет определенные проблемы, поскольку в этом случае оказывается невозможным статистически достоверно осуществить регистрацию большого (несколько тысяч) числа фотонов от единственного флуорофора в пределах дифракционного пятна, не возбуждая другие близко лежащие флуорофоры. Решение этой проблемы было найдено в использовании так называемых переключаемых (photoswitchable) флуоресцентных красителей (Hell etal., 1994, 1995; Betzig etal., 2006). Такие флуорофоры могут находиться в трех состояниях — «активированном» (могут поглощать возбуждающее излучение), «возбужденном» (могут перейти в «темное» состояние с излучением фотона) и «темном» (молекула не может поглощать возбуждающее излучение). Переход из «темного» состояния в «активированное» происходит под действием «активирующего» излучения, длина волны которого меньше длины волны «возбуждающего» излучения. PALM использует похожий на STORM принцип, однако в клетке должны находиться флуорофоры, активирующиеся под воздействием света определенной волны. При этом сначала облучают не испускающий свет флуорофора образец тонким лучом одного света, а затем немедленно фиксируется флуоресценция облученной точки. Тем самым достигается минимизация размеров источника света. Разработан метод микроскопии, основанный на снижении возбудимости флуорофора (Ground State Depletion Microscopy; GSD Microscopy). В основе этого метода лежит прием удаления фона и последующего постепенного восстановления флуоресценции (Betzi et al., 2006; Bretsc-hneider etal., 2007; Han etal., 2010). GSD-микроскопия базируется на свойстве некоторых флуорофоров медленно восстанавливать флуоресценцию после ее подавления облучением пучком света высокой интенсивности. При этом объект сначала облучается мощным лазерным источником света и теряет способность к флуоресценции, затем включается детектор фотонов, который регистрирует «вспышки» отдельных молекул флуорофора, находящихся за счет предыдущего облучения в возбужденном состоянии. Эти вспышки очень похожи на те, что видны при использовании STORM, да и алгоритм обработки сигнала используется практически тот же: статистистически вычисляется позиция (точка) молекулы флуорофора, испускающей фотоны, и строится изображение из этих точек (рис. 5, 6-4). Еще одним методом сверхвысокого разрешения является метод, использующий структурированное освещение, — SIM-микроскопия (Structured Illumination Microscopy; SIM). Для этого в плоскости, сопряженной с фокальной, располагается решетка, создающая определенный рисунок освещения (например, из параллельных черных полосок). Индуцируемая флуоресценция повторяет рисунок освещения, при этом флуоресценция объектов, расположенных в фокальной плоскости, меняется при перемещении этого рисунка. Напротив, флуоресценция, исходящая из расположенных вне фокуса объектов, практически не зависит от сдвига решетки. Последующая компьютерная обработка позволяет отсечь флуоресценцию вне фокуса, улучшить разрешение и получить четкое изображение. По сути SIM-микроскопия основана на том же феномене статистического вычисления положения точечного источника света (рис. 5, г, д). В ней используется метод деконволюции, основанный на реальных параметрах системы данного микроскопа. При использовании метода SIM для улучшения разрешения требуется каждый оптический срез снимать не менее 15 раз (Vermeulen et al., 2015). На практике SIM дает разрешение, в 2 раза превышающее разрешение LSCM (Fornasiero, Opazo, 2015) (рис. 5, 6-2). Возможности методов световой микроскопии высокого разрешения и сложности их использования. Методы СРСМ постоянно совершенствуются. Разработана комбинация статистических методов с SIM и методом «световой пластинки». Последний используется с элементами томографии (Gustavsson etal., 2018). При этом если в объектив вставить цилиндрическую линзу, то появляется возможность различать точки, находящиеся выше и ниже фокусной плоскости, по их ориентации. В последние годы разработан математический аппарат для восстановления (деконволюции) размытых изображений (Wiesmann et al., 2015; Sage et al., 2017). Это позволяет улучшить качество светооптических изображений и несколько повысить разрешение (Zeitvogel et al., 2016). Разработана методика для определения центра испускания фотонов с помощью регистрации их уменьшенного числа (Nanoscopy with Minimal Photon Fluxes; MINFLUX). В ней для измерения разрешения используют искусственные трехмерные структуры, получаемые из специально ранжированных молекул ДНК (оригами) и помещаемые в идеальные условия для регистрации фотонов (Balzarotti et al., 2017). СРСМ сегодня представляет собой быстро развивающуюся отрасль научных исследований, но история использования этих методов еще довольно короткая (Sydor et al., 2017). Практически ни в одной из работ, использующих СРСМ, не было представлено данных о подтверждении полученного разрешения с помощью альтернативных методов, например коррелятивной светоэлектронной микроскопии (Kreft etal., 2010). При этом, по нашему мнению, до сих пор СРСМ не позволила получить по-настоящему новые результаты. Практически все наблюдения, сделанные с помощью этих методов, были описаны ранее с помощью электронной микроскопии. Например, с помощью усовершенствованного метода SIM на базальной части плазматической мембраны клеток, растущих in vitro, были визуализированы покрытые клатрином мембранные почки, которые имели вид колечек (Li etal., 2015). Однако эта структура была описана более 30 лет назад (Robinson, 2015). Данные о быстром движении синаптических везикул, полученные с помощью STED, спорны (Kamin et al., 2010), в то время как LSKM этот факт однозначно доказывает (Darcy etal, 2006а, 2006b). Действительно, новым результатом, полученным с помощью СРСМ, является обнаружение периодичности организации молекул актина (с шагом 180 нм), локализованных непосредственно под плазмалеммой отростков нейронов (Xu etal., 2013; D'Este etal., 2015; Sahl etal, 2017), однако эти данные также желательно подтвердить с помощью коррелятивной световой микроскопии и ЭМ. Использование методов СРСМ на практике связано с многочисленными методическими сложностями. Так, живые клетки часто гибнут (Waldchen et al., 2015), и требуется разработка способов поддержания их жизнеспособности. Есть проблемы с подготовкой клеток для анализа и выцветанием флуорофора. Например, все методы реконструкции на основе статистического анализа положения световой точки на горизонтальной плоскости (оси X и Y) вызывают сильное выцветание образца (Sydor et al., 2017), поэтому требуют высокорезистентных к выцветанию флуорофоров. При PALM-микроскопии требуется луч с очень низкой интенсивностью излучения, чтобы как можно меньше молекул флуорофора было затронуто. Как следствие требуется длительное время для «сбора» необходимого количества фотонов. Кроме того, в случае PALM могут активироваться молекулы, расположенные как выше, так и ниже плоскости фокуса. Поэтому нужно учитывать ряд факторов, ведущих к артефактам: множественная локализация одного и того же флуорофора; «фотомерцание»; неполная конверсия цвета флуорофора; смещение молекул и образца при длительном наблюдении; неоптимальная регистрация двухцветных изображений (так как фотоны с разной длиной волны по-разному преломляются на границе сред) (Deschout et al., 2014). 4Рi-микроскопию можно расценивать как довольно субъективный метод, так как в его основе лежит прием «отсечения фона». Поэтому если исследователь не знает, какую именно структуру он наблюдает, возникает возможность неправильной интерпретации изображения. Например, известно, что меченные флуорофором мембраны особенно часто дают артефакты изображений из-за гетерогенности распределения липидов (Burgert et al., 2015). Оказалось также, что SIM-микроскопия при проверке уровня разрешения с помощью коррелятивной световой микроскопии приводит к «потере» некоторых элементов (частиц) на изображении (не все точки оказываются на результирующем изображении) (Guggenheim et al., 2016). Таким образом, несмотря на оптимистические заявления разработчиков методов микроскопии сверхвысокого разрешения (Juette et al., 2008), на практике получить высокое разрешение на толстых образцах довольно трудно (Vermeulen et al., 2015). Так, часто происходит завышение размеров мелких структур. Например, частица вируса Semliki forest с диаметром 70 нм под флуоресцентным микроскопом имеет размер 400 нм (Vonderheit, Helenius, 2005). Сравнение изображений, полученных с помощью метода STORM, с теми же ЭМ-изображениями показало, что визуализация митохондрий с помощью STORM увеличивает размеры органоидов в 2 раза (Kim et al., 2015). Причем везикулы комплекса Гольджи, образуемые коатомером-I и имеющие размер 52 нм (Marsh et al., 2001), на изображениях, представленных в статье Хуанга с соавторами (Huang et al., 2016), имеют размер 100 нм. Теоретические проблемы разрешения в СРСМ подробно описаны в литературе (Sheppard, 2017). Обычно авторы приводят математические доказательства теоретически возможного разрешения предложенного метода, но недостаточное число изображений конкретных объектов. Однако следует отличать теоретическое или предсказанное разрешение от разрешения, которое можно получить на модельных объектах путем отсечения фона, статистического усреднения, а также при работе с биологическим образцом, с учетом его оптически гетерогенной среды, анизотропизма и других факторов, мешающих достичь теоретически возможного разрешения. Здесь полезно провести аналогию с методами ЭМ. На модельных системах разрешение просвечивающей и сканирующей ЭМ достигает 0.05 нм (Li et al., 2015). Однако в биологических образцах в реальности оно не превышает 2—3 нм, т. е. в 40 раз меньше. ЭМ не позволяет отличить золотые частицы диаметром 1.4 нм от осадка восстановленного осмия. Только при негативном контрастировании возможно достигнуть чуть большего разрешения, а использование ЭМ-томографии позволяет достигнуть разрешения 1 нм (Ziese et al., 2002; Yakushevska et al., 2007). Поэтому если на модельной системе нуклеиновых «оригами» разрешение СРСМ достигает 5—10 нм (Balza-rotti et al., 2017), то по аналогии с ЭМ на практике можно ожидать получение разрешения СРСМ не более чем в 150 нм. Разработчики методов СРСМ утверждают, что на клеточном уровне достигнуто разрешение в 15—50 нм (Meyer et al., 2008), что практически не подтверждено реальными научными исследованиями, так как все полученные к настоящему времени результаты неоднозначны. Так, Ким с соавторами (Kim et al., 2015) заявляют о разрешении на уровне десятков нанометров, полученном при использовании метода STORM, при этом на изображениях, представленных в статье, не выявляются щели между митохондриями размером около 100 нм. В другой статье (Huang et al., 2008) описываются изображения, где разрешение по оси Z составляет 102 нм, однако судя по представленному изображению, оно не превышает 200 нм. Еще в одном исследовании с помощью СРСМ были визуализированы триплеты микротрубочек в центриоле (Lau et al., 2012). При этом отдельные микротрубочки в триплетах остались неразрешимыми, а согласно приведенной масштабной линейке разрешение на изображении не превышало 150 нм. С помощью комбинации методов PALM- и 4Рi-микроскопии при исследовании целой клетки были визуализированы везикулы около комплекса Гольджи, покрытые коатомером—I (однако, скорее всего, это мембранные почки на цистернах комплекса Гольджи, так как везикулы быстро теряют покрытие после отделения от цистерны) (Huang et al., 2016). Эти данные требуют подтверждения с помощью LSCM. Однако авторы использовали сложный в применении метод 4Рi-микроскопии, а не методы PALM и STROM, в которых заявлено разрешение по оси Z не ниже 100 нм. При этом с помощью усовершенствованного метода SIM также были визуализированы покрытые клатрином мембранные почки или пузырьки (Li et al, 2015). Для проверки реального разрешения СРСМ, видимо, требуется широкое сотрудничество ученых, работающих с разными методами, в том числе с коррелятивной микроскопией. В качестве модельных объектов, например, могут быть использованы квантовые точки или частицы золота (диаметром более 20 нм), конъюгированные с флуорофором. Можно определить число квантовых точек с помощью СРСМ в эндосоме и затем проверить с помощью ЭМ-томографии. Везикулы можно метить «негативно» и по флуоресценции содержимого определять «слепым» методом их количество, а затем проверять полученные результаты с помощью коррелятивной микроскопии. Также в качестве модельных систем in situ можно использовать микротрубочки, каждый триплет которых имеет диаметр около 75 нм, микросферы с известным диаметром, центриоли и другие структуры с обязательной проверкой полученных результатов с помощью ЭМ. К настоящему времени уже разработаны протоколы, которые позволяют использовать на одном срезе STORM и просвечивающую ЭМ (Kim et al., 2015). Заключение: Таким образом, описанные нами методические разработки и технические усовершенствования способствовали улучшению качества получаемых светооптических изображений и значительно расширили исследовательские возможности СМ. Однако все перечисленные выше методы и разработки, несмотря на значительные возможности, все же не позволяют преодолеть «дифракционный предел» как таковой, а лишь «обходят» его. Пока реальное высокое разрешение методов СРСМ доказано только для линейных структур клетки, микротрубочек и митохондрий (Xu et al., 2013; D'Este et al., 2015; Sahl etal., 2017). Экспериментов, в которых полученное с помощью тех или иных методов СРСМ разрешение проверялось бы с помощью коррелятивной микроскопии, проведено чрезвычайно мало. Кроме того, требуется разработка или адаптация имеющихся методов стереологии (Безнусенко и др., 2005а, 20056) для количественной оценки данных, полученных методами СРСМ.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 2018
Объем: 11с.
Дополнительная информация: 2018.-N 5.-С.319-329. Библ. 0 назв.
Просмотров: 224