АДГЕЗИЯ ТИМОЦИТОВ К ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМ КЛЕТКАМ ТИМУСА И УЧАСТИЕ В НЕЙ НЕЙРОПИЛИНА-1 И ПЛЕКСИНА А1

Аннотация:

Клетки эпителия тимуса не только играют важную структурную роль, но также создают микроокружение, необходимое для созревания и дифференцировки тимоцитов. Одним из этапов созревания тимоцитов является их адгезия к эпителиальным клеткам тимуса, механизм которой изучен недостаточно. Цель исследования заключалась в изучении взаимодействия тимоцитов мыши с клеточными линиями кортикального сТЕС1-2 и медуллярного тТЕСЗ-10 эпителия тимуса, а именно динамики процессов адгезии, апоптоза, популяционного состава, а также экспрессии рецепторов нейропилина-1 (Nrp-1) и плексина А1 (PlexAl) среди адгезированных, неадгезированных и контрольных клеток, культивируемых без эпителия. Максимальный индекс адгезии наблюдали при 30-минутном совместном культивировании, после чего этот показатель снижался. Основной популяцией адгезированных клеток являлись незрелые лимфоциты CD4+CD8+, а относительное содержание зрелых тимоцитов CD4+ и CD8+ было ниже, чем в контроле. Впервые показано, что уже при коротких сроках сокультивирования (30 и 120 мин) среди популяции адгезированных клеток наблюдается увеличение (по отношению к контролю) содержания тимоцитов, находящихся в ранней фазе апоптоза. Впервые получены данные об участии Nrp-1 и PlexAl в процессе адгезии тимоцитов к клеткам эпителия тимуса мыши в качестве самостоятельных молекул в отсутствие их лиганда семафорина ЗА. Показано, что экспрессия Nrp-1 на поверхности адгезированных тимоцитов значительно снижается в процессе адгезии по сравнению с контролем, а экспрессия PlexAl повышается. Преинкубация тимоцитов с антителами к Nrp-1 повышала их адгезию к клеткам эпителия. Полученные данные способствуют лучшему пониманию межклеточных взаимоотношений в вилочко-вой железе. Ключевые слова: эпителиальные клетки, сТЕС1-2, тТЕСЗ-10, тимоциты, адгезия, апоптоз, Nrp-1, PlexAl. Клетки эпителия тимуса не только играют важную структурную роль как наиболее многочисленный компонент стромы, но и создают микроокружение, необходимое для созревания тимоцитов, синтезируя для этого целый ряд ростовых факторов, хемокинов, белков внеклеточного матрикса и тимусных гормонов (Klein et al., 2014). Различают кортикальные и медуллярные клетки эпителия тимуса, которые имеют общее происхождение, но разные фенотип и функции. Кортикальные клетки эпителия тимуса осуществляют позитивную селекцию тимоцитов, а медуллярные вместе с дендритными клетками и В-лимфоцитами мозгового слоя контролируют негативную селекцию и дифференцировку Т-регуляторных клеток. В процессе дифференцировки тимоциты активно мигрируют внутри тимуса и последовательно осуществляют кратковременные контакты с разными антигенпрезентирующими клетками (Klein, 2009). Переходя от одной эпителиальной клетки к другой, тимоциты многократно проходят смену адгезии с последующей деадгезией (потерей контакта), механизмы которых недостаточно изучены. Известно, что этап прикрепления тимоцитов к клеткам эпителия тимуса связан с наличием на тимоцитах адгезионных молекул, принадлежащих к семействам иммуноглобулинов — LFA-2 (CD2) (Singer, 1990) и Thy-1 (CD90) (Не et al., 1991) и интегринов — VLA-4 (а4(31, CD49d/CD29) и LFA-1 (aLp2, CD1 la/18) (Yarilin et al., 1999). Кроме того, в этом процессе принимают участие белки внеклеточного матрикса и рецепторы к ним, а именно VLA-5 и упомянутый выше VLA-4 (для взаимодействия с фибронектином), а также VLA3 и VLA-6 (для взаимодействия с ламинином) (Savino et al., 2002). Роль плексинов и нейропилина, которые теперь известны как рецепторы семафоринов (Chaudhary et al., 2014), в адгезии тимоцитов мало изучена. Участие нейропилина-1 (Nrp-1) в адгезии тимоцитов к клеткам эпителия тимуса рассматривалось только в качестве медиатора действия нейронального фактора семафорина ЗА (Lepelletier et al., 2007); роль Nrp-1 и плексинов как самостоятельных молекул в этом межклеточном контакте не изучалась. Цель настоящей работы заключалась в изучении взаимодействия тимоцитов мыши с клеточными линиями тимусного эпителия кортикального и медуллярного происхождения. В задачи входило изучение динамики процессов адгезии, развития апоптоза, популяционного состава адгезированных и неадгезированных клеток, а так же исследование роли в процессе адгезии таких молекул, как Nrp-1 и плексин А1 (PlexAl). Мы показали, что максимальный индекс адгезии (35 %) наблюдался при 30-минутном совместном культивировании тимоцитов и эпителиальных клеток, после чего этот показатель снижался; основной популяцией адгезированных клеток являлись незрелые лимфоциты CD4+CD8+. При контакте с эпителиальными клетками происходило развитие апоптоза тимоцитов, которое было более выражено при культивировании с клетками тТЕСЗ-10, чем с сТЕС1-2; в то же время существенной разницы по другим показателям — динамике адгезии и популяционному составу адгезированных тимоцитов при взаимодействии с клетками разных линий — не получено. Мы впервые показали, что уже при коротких сроках сокультивирования (30 и 120 мин) среди популяции адгезированных клеток наблюдается увеличение содержания тимоцитов, находящихся в ранней фазе апоптоза. Впервые получены данные об участии Nrp-1 и PlexAl в процессе адгезии тимоцитов к клеткам эпителия тимуса мыши в качестве самостоятельных молекул, в отсутствие их лиганда семафорина ЗА. Полученные нами данные способствуют лучшему пониманию взаимодействия между тимоцитами и эпителиальным компартментом, что имеет важное значение для функционирования вилочковой железы. Материал и методика: Клеточные культуры. Работу проводили на двух линиях тимусного эпителия мышей сТЕС1-2 (кортикального) и тТЕСЗ-10 (медуллярного), любезно предоставленных проф. М. Kasai из Токийского университета. Первоначально клеточные линии были получены из тимусов новорожденных мышей линии C57BL/6 и охарактеризованы по экспрессии цитокератинов с помощью иммуногистохимического метода (Kasai et al., 1996). Клетки культивировали в среде DMEM (Sigma, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Великобритания), 0.1 мг/мл гентамицина (Биолот, Россия) и 0.6 мг/мл глутамина (Биолот, Россия), при 5% ССК и 37°С. Клетки. Тимоциты получали от мышей-гибридов F1 (СВА X C57BL/6) массой 16—18 г, которых умерщвляли путем цервикальной дислокации. Суспензию тимоцитов получали путем раздавливания тимуса и последующего фильтрования через нейлоновый фильтр. Адгезия тимоцитов к клеткам эпителия. Эпителиальные клетки культивировали в 24-луночном планшете в объеме 500 мкл в концентрации 4 х 10 в 5степени кл/мл в среде, содержащей 10% фетальной сыворотки, в течение 1 сут до образования конфлюэнтного монослоя. После этого среду удаляли и в каждую лунку добавляли по 250 мкл тимоцитов в концентрации 5 х 10 в 6 степени кл/мл в среде, содержащей 1% фетальной сыворотки, и культивировали в течение 30 или 120 мин в СО2-инкубаторе. Кроме этого, при тех же условиях культивировали тимоциты без эпителия, которые использовали в качестве контроля. По окончании совместного культивирования тимоцитов и клеток эпителия монослой 2 раза осторожно отмывали от неприкрепившихся тимоцитов с помощью раствора DPBS (Биолот, Россия), содержащего 0.5% бычьего сывороточного альбумина (Биолот, Россия). Отмытые тимоциты собирали и считали неадгезированными клетками. Адгезированные клетки отделяли от дна планшета с помощью 200 мкл аккутазы (Sigma, США) и встряхивания на шейкере в режиме 500 об/мин при 37°С в течение 10 мин. Тимоциты и эпителиальные клетки, значительно различающиеся по размеру и морфологии, анализировали под световым микроскопом и считали в камере Горяева. Концентрация эпителиальных клеток была постоянной в пределах одного эксперимента. Индекс адгезии (ИА) определяли по отношению числа адгезированных тимоцитов к числу внесенных и выражали в %. Для изучения роли рецепторов клеток эпителия или тимоцитов их предварительно культивировали в среде, содержащей 1%-ную фетальную сыворотку, в течение 20 мин с поликлональными козьими антителами к Nrp-1 мыши (AF566; R&D Systems, США) в концентрации 1 мкг/мл, после чего клетки отмывали и изучали их способность к адгезии. Проточная цитофлуориметрия. Популяционный состав тимоцитов (адгезированных, неадгезированных и контрольных, культивированных без эпителия) определяли с использованием моноклональных антител против CD4 мыши, меченных фикоэритрином (РЕ) (BD Pharmingen, США), и CD8, меченных РЕ-Су7 (BD Pharmingen, США). Экспрессию Nrp-1 и PlexAl на поверхности тимоцитов выявляли на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США) с помощью козьих антител против Nrp-1 мыши, меченных карбоксифлуоресцеином (R&D Systems, США), а также моноклональных крысиных антител против PlexAl мыши, меченных аллофикоцианином (R&D Systems, США), и соответствующих изотипических контролей. Оценка апоптоза тимоцитов. Тимоциты окрашивали ДНК-связывающими красителями YO-PRO™-1 (Invitrogen, США) в концентрации 250 нМ и 4',6-диамино-2-фенилиндолом (DAPI; Biolegend Inc., США) в концентрации 1 мкг/мл при комнатной температуре в течение 10 мин (Надеев и др., 2015). С помощью YO-PRO-1 выявляли ранние стадии апоптоза, а с помощью DAPI — мертвые клетки. В каждом образце анализировали три группы клеток — живые (неокрашенные), в ранней фазе апоптоза (окрашенные YO-PRO-1), в состоянии некроза и (или) на поздних фазах апоптоза (окрашенные DAPI и YO-PRO-1) (Stemberger et al., 2010). Для каждого из образцов было проанализировано не менее 25 000 одиночных клеток на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США). Удаление слипшихся клеток из зоны анализа производили на основании оценки соотношения пикового и интегрального сигналов по параметрам прямого и бокового светорассеяния для каждой из проанализированных клеток. Обработку данных проводили при помощи программы Kaluza™ v. 1.3 (Beckman Coulter, США). Статистическая обработка. Данные обрабатывали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты и обсуждение Динамика прикрепления и апоптоз тимоцитов в процессе адгезии к эпителиальным клеткам тимуса. Зависимость индекса адгезии тимоцитов к клеткам эпителия тимуса от времени культивирования анализировали в течение 10—240 мин. Максимальный показатель адгезии на обеих линиях эпителия тимуса составлял около 35% через 30 мин совместного культивирования (рис. 1). При увеличении времени культивирования индекс адгезии постепенно уменьшался. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, также указывающих на то, что максимальный индекс адгезии (35—40%) наблюдается на сроке 30 мин совместного культивирования тимоцитов с разными клеточными линиями тимусного эпителия (Не et al., 1991; Vucevic et al., 2002). Авторы рассматривают этот срок как раннюю фазу адгезии, в которой участвуют такие адгезионные молекулы, как LFA-1, LFA-2, Thy-1 и др. (Не et al., 1991; Colic et al., 1994). На рис. 2 показаны результаты оценки апоптоза тимоцитов, культивируемых с кортикальными сТЕС1-2 (рис. 2, а, д) и медуллярными шТЕСЗ-10 (рис. 2, б, ё) эпителиальными клетками, на двух сроках культивирования (30 и 120 мин). Среди адгезированных тимоцитов относительное содержание клеток, находящихся в фазе раннего апоптоза, было значительно выше, чем в контроле на обоих сроках. Кроме того, при сравнении двух линий эпителия оказалось, что среди адгезированных тимоцитов показатель относительного содержания раннего апоптоза при культивировании с клетками тТЕСЗ-10 был в 3—4 раза выше, чем с клетками сТЕС1-2. Данные об увеличении апоптоза среди адгезированных тимоцитов по сравнению с контролем на таких ранних сроках культивирования (30 и 120 мин) получены нами впервые. Этот вопрос подробно исследовали в 90-х годах XX в. на клетках мышей, крыс и человека, и было показано, что совместное культивирование тимоцитов с эпителиальными клетками тимуса приводит к индукции апоптоза тимоцитов, но на более поздних сроках, а именно 3—4 ч и позже (Rinner et al., 1996; Schreiber et al, 1996; Sharova et al, 2001; Vucevic et al, 2002). При этом на более ранних сроках исследования (1.5—2 ч) апоптоз не выявлялся (Schreiber et al, 1996; Vucevic et al, 2002). Расхождения с нашими результатами могут быть связаны с тем, что авторы этих работ использовали недостаточно чувствительные методы исследования — морфологический и выявление клеток, содержащих меньше чем 2N ДНК («суб-G, пик»), при окрашивании иодидом пропидия (Schreiber et al, 1996). Использованный нами метод окрашивания клеток с помощью YO-PRO-1 является более чувствительным. Этот флуоресцентный краситель поступает в цитоплазму через лигандзависимые ионные каналы P2RX 7 на ранних стадиях апоптоза, а в интактных клетках не накапливается (Stemberger et al, 2010). Среди неадгезированных клеток относительное содержание тимоцитов, находящихся в фазе раннего апоптоза, не увеличивалось ни через 30, ни через 120 мин по сравнению с контролем при сокультивировании с клетками эпителия обеих линий (рис. 2, а, б, д, е). Эти данные свидетельствуют об относительной резистентности популяции неадгезированных клеток к апоптозу, на что указывают также и другие авторы (Schreiber et al, 1996; Mukamoto et al, 1999). При сопоставлении динамики деадгезии клеток и апоптоза, индуцированного в результате контакта с эпителиальными клетками, оказалось, что эти процессы происходят с разной скоростью: за 1.5 ч доля адгезированных тимоцитов уменьшалась на 2 и 5% на кортикальных и медуллярных клетках соответственно, а доля апоптозных клеток среди адгезированных тимоцитов увеличивалась на 6 и 17% соответственно. Таким образом, скорость увеличения доли апоптозных клеток была в 3 раза выше, чем скорость деадгезии клеток, что предполагает отсутствие связи между этими процессами. Содержание тимоцитов, находящихся в фазе позднего апоптоза (некроза), было выше среди неадгезированных клеток (7—8%) по сравнению с контролем (4—6%) и значительно снижено в популяции адгезированных клеток (1.5—3%) (рис. 2, в—е). Этот показатель не зависел от времени культивирования (30—120 мин) и типа эпителия (кортикального или медуллярного). На основании этого можно предположить, что неадгезированные тимоциты, находящиеся на стадии позднего апоптоза, в адгезии не участвуют и представляют собой мертвые клетки, получившие механические повреждения в процессе пробоподготовки. Таким образом, полученные данные указывают на то, что апоптоз тимоцитов развивался в результате контакта с эпителиальными клетками, а не спонтанно и затрагивал в основном популяцию адгезированных клеток. Распределение тимоцитов по экспрессии антигенов CD4 и CD8 в процессе адгезии. Фенотип тимоцитов, культивированных совместно с клетками эпителия в течение 120 мин, изучали в трех группах клеток — адгезированных, неадгезированных и контрольных (культивированных без эпителиальных клеток). Как показано на рис. 3, основной популяцией адгезированных клеток являлись незрелые лимфоциты CD4+CD8+; при этом относительное содержание зрелых CD4+- и СD8+-тимоцитов уменьшалось на клетках эпителия обеих линий. Наши результаты согласуются с данными, полученными другими авторами с использованием линий эпителиальных клеток крысиного и мышиного происхождения (Schreiber et al, 1996; Colic et al, 1998; Pezzi et al, 2016), что подтверждает адекватность использованной нами модели. Необходимость такого подтверждения связана с тем, что в наших исследованиях были использованы тимоциты от мышей-гибридов F1 (СБА X C57BL/6), а линии эпителиальных клеток были получены от мышей C57BL/6. Однако, согласно данным литературы, считается, что процесс адгезии тимоцитов к эпителиальным клеткам, так же как и сопровождающий его процесс развития апоптоза тимоцитов, не подвержены МНС-рестрикции и наблюдаются как в сингенной, так и в аллогенной системах (Singer et al, 1986; Guy et al, 1996), а также с клетками другого вида (Sharova et al, 2001). Таким образом, применение нашей модели можно считать вполне корректным. Анализ экспрессии Nrp-1 и PlexAl на тимоцитах в процессе адгезии. Поскольку мы предположили, что Nrp-1 и PlexAl могут участвовать в процессе адгезии тимоцитов к клеткам эпителия, было исследовано относительное содержание клеток, несущих данные маркеры среди адгезированных и неадгезированных тимоцитов. Содержание клеток Nrp-1+ в контроле составляло более 50%, а среди адгезированных клеток резко снижалось до 3% после культивирования с эпителиальными клетками обеих линий (рис. 4, а—г). Анализ относительного содержания клеток Nrp-1+ среди четырех основных популяций тимоцитов (см. таблицу) показал, что в контроле их содержание было наибольшим среди CD4+CD8+ и наименьшим — среди CD4+ и CD8+-thmoiwtob. Среди адгезированных клеток (120 мин культивирования) этот показатель уменьшался неравномерно в разных популяциях: среди CD4+CD8+ — в 22 раза, среди остальных популяций — в 4—9 раз (см. таблицу). Поскольку клетки с фенотипом CD4+CD8+ представляли собой основную популяцию прикрепляющихся клеток, наиболее выраженное снижение экспрессии Nrp-1 именно среди этой популяции тимоцитов указывает на участие данной поверхностной молекулы в адгезии. При этом относительное содержание клеток Nrp-1+ среди неадгезированных тимоцитов не отличалось от контроля. Nrp-1 является многофункциональным трансмембранным белком, который способен взаимодействовать с большим числом лигандов, среди которых наиболее хорошо изучены семафорин ЗА и ростовой фактор сосудистого эндотелия (VEGF) (Chaudhary et al., 2014). Вместе с тем, Nrp-1 независимо от взаимодействия со своими основными лигандами может также образовывать комплексы с различными рецепторами на поверхности той же самой клетки. Было показано, что этот рецептор может взаимодействовать с а 501 (VLA-5) интегрином и усиливать адгезию эндотелиальных и опухолевых клеток к фибронектину (Valdembri et al., 2009; Chen et al., 2014). Этот процесс сопровождается активным эндоцитозом комплекса Nrp-1 с интегрином VLA-5 в эндотелиальных клетках (Valdembri et al., 2009). Можно предположить, что выявленное нами резкое снижение содержания клеток Nrp-1+ среди адгезированных тимоцитов также связано с интернализацией этого рецептора с поверхности в результате контакта с эпителиальными клетками. Описанные нами данные об уменьшении содержания Nrp-1+ среди адгезированных тимоцитов не согласуются с результатами других авторов, полученными на тимоцитах человека. Так, было показано, что среди адгезированных тимоцитов их относительное содержание с фенотипом Nrp-1% наоборот, увеличивается после их культивирования с эпителиальными клетками (Lepelletier et al., 2007). Можно предположить, что данные расхождения связаны с особенностями экспрессии Nrp-1 на тимоцитах у разных видов млекопитающих. Если у мышей относительное содержание клеток Nrp-1+ весьма значительно и составляет до 70% всех тимоцитов (Corbel et al., 2007), то у человека таких клеток всего лишь около 5% (Lepelletier et al., 2007). Кроме того, у мышей Nrp-1 считается маркером Т-регуляторных клеток (Sarris et al., 2008), что нехарактерно для Т-лимфоцитов человека (Milpied et al., 2009). Содержание клеток Р1ехА1+ среди адгезированных тимоцитов в противоположность клеткам Nrp-1+ увеличивалось в результате культивирования с эпителиальными клетками обеих линий (сТЕС1-2 и шТЕСЗ-10) (рис. 4, д—з). Так, в контроле содержание клеток-Р1ехА1+ составляло 4—6%, а среди адгезированных — 12—15%. При этом относительное содержание клеток Р1ехА1+ среди неадгезированных тимоцитов не отличалось от контроля. Анализ содержания клеток Р1ехА1+ по четырем основным популяциям показал, что во всех группах в контрольных культурах доля клеток Р1ехА1+ была приблизительно одинаковой, а среди адгезированных равномерно увеличивалась в 3—4 раза (см. таблицу). Таким образом, полученные нами данные указывают на участие обеих молекул (Nrp-1 и PlexAl) в адгезии, причем их экспрессия на поверхности адгезированных тимоцитов за 2 ч культивирования изменялась противоположным образом. Влияние антител к Nrp-1 на адгезию тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса. Пре-инкубация тимоцитов с антителами повышала их адгезию к клеткам эпителия обеих линий на 10% (рис. 5). Можно предположить, что обработка антителами к Nrp-1 создает условия для более эффективного участия интегринов в процессе адгезии. В том случае, когда антителами обрабатывали не тимоциты, а клетки эпителия, эффекта не было. Это можно объяснить тем, что нейропилиновые рецепторы находятся в основном на тимоцитах, а на клетках эпителия их экспрессия невелика (Рутто и др., 2016). Nrp-1 и PlexAl в настоящее время рассматриваются как рецепторы нейронального и иммунорегуляторного фактора семафорина ЗА (Takamatsu, Kumanogoh, 2012). Между тем они первоначально были описаны в качестве адгезионных молекул. Так, было показано, что плексины участвуют в осуществлении клеточных контактов нейрональных клеток (Fujisawa et al., 1997), а нейропилин опосредует агрегацию фибробластов (Takagi et al., 1995). Позднее установили, что Nrp-1 мыши имеет два сайта межклеточной адгезии, которые располагаются в доменах b1 и b2 и связываются с неидентифицированным белковым лигандом на мембране других клеток (Shimizu et al., 2000). В иммунной системе Nrp-1 участвует во взаимодействиях Т-лимфоцитов и дендритных клеток человека, на поверхности которых он экспрессируется, и опосредует их контакт по типу гомофильного взаимодействия (нейропилин—нейропилин) (Tordjman et al., 2002). Таким образом, Nrp-1 и PlexAl являются не только рецепторами семафорина ЗА, но, кроме этого, способны участвовать в осуществлении межклеточных контактов в нервной и иммунной системах в качестве самостоятельных адгезионных молекул в отсутствие семафорина ЗА (Li et al., 2014). Полученные нами данные также указывают на общность механизмов межклеточных взаимодействий, происходящих в нервной и иммунной системах и позволяют по-новому рассматривать участие этих молекул в процессе адгезии тимоцитов к клеткам эпителия тимуса.Таким образом, в настоящем исследовании был проанализирован процесс адгезии тимоцитов мышей к клеткам кортикального и медуллярного эпителия тимуса. Было показано, что максимальный индекс адгезии наблюдался при 30 мин культивирования, после чего этот показатель снижался. Основной популяцией адгезированных клеток являлись незрелые лимфоциты CD4+CD8+. Апоптоз тимоцитов развивался в основном в результате контакта с эпителиальными клетками (а не спонтанно) и затрагивал популяцию адгезированных клеток. Увеличение содержания тимоцитов в ранней фазе апоптоза было впервые зарегистрировано уже через 30 и 120 мин культивирования. Процессы деадгезии и апоптоза, индуцированного в результате контакта с эпителиальными клетками, происходили с разной скоростью, что предполагает отсутствие связи между ними. Впервые показано участие Nrp-1 и PlexAl в адгезии тимоцитов к клеткам эпителия тимуса в качестве самостоятельных молекул в отсутствие их основного лиганда семафорина ЗА. При сравнении данных, полученных на разных линиях эпителия (сТЕС1-2 и тТЕСЗ-10), не было выявлено существенной разницы ни по динамике и уровню адгезии, ни по популяционному составу клеток, участвующих в адгезии. Различия касались только значительно более выраженной индукции раннего апоптоза в адгезирован-нах тимоцитах при культивировании с клетками тТЕСЗ-10. Это может быть связано с тем, что in vivo клетки CD4+CD8+ не контактируют с эпителием медуллярной зоны, поскольку в ней присутствуют только более зрелые тимоциты с фенотипом CD4+ или CD8+. Представленные в настоящей работе результаты имеют существенное значение для лучшего понимания межклеточных взаимодействий в процессе созревания тимоцитов.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 5.-С.348-356. Библ. 0 назв.
Просмотров: 127