ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОНОЦИТОПОДОБНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Аннотация:

Иммуносупрессивные свойства опухоли обеспечиваются составляющими ее микроокружение (МО) клетками иммунной системы, в том числе макрофагами. Последние обеспечивают опухолевым клеткам приобретение более агрессивного фенотипа и способности к метастазированию. Наивный макрофаг, мигрируя внутрь тела солидной опухоли, встречается с новыми субпопуляциями опухолевых клеток, и его функции изменяются. В нашем исследовании была использована схема последовательного сокультивирования клеток эпидермоидной карциномы человека А431 с моноцитоподобными клетками ТНР-1, модулирующая продвижение макрофага по опухоли. Исследовали свойства макрофагов и опухолевых клеток в зависимости от этапа сокультивирования, а оценивали цитокиновый профиль МО и уровень матриксных металлопротеиназ (ММР) 2 и 9. Мы продемонстрировали, что именно первая встреча наивного моноцита с опухолевыми клетками вызывает значительные изменения пролиферативных и миграционных свойств клеток А431, высвобождение проопухолевых цитокинов во внеклеточное пространство и поляризацию моноцитов в М2-фенотип. Одним из анализируемых цитокинов, появление которого в МО значительно возрастало после 1-го этапа сокультивирования, был TNF-a, известный индуктор апоптоза, который способствовал массовой гибели клеток ТНР-1, в основном уже приобретших проопухолевый фенотип. Наши данные указывают на то, что функция макрофагов зависит от цитокинового профиля в МО, и представляют один из сценариев взаимодействия раковых и стромальных клеток в реальной опухоли. Ключевые слова: микроокружение опухоли, макрофаги, цитокины, А431, ТНР-1. Опухолевые клетки поддерживают свою жизнеспособность во многом благодаря наличию микроокружения (МО), которое состоит из стромальных и иммунных клеток, белков, ростовых факторов, молекул РНК, везикулярных частиц, микроэлементов и других компонентов (Witz, 2008). Некоторые клетки МО при контакте с опухолью утрачивают свою защитную функцию и становятся проопухолевыми. Это приводит к тому, что злокачественные опухоли избегают иммунной атаки со стороны хозяина, хотя обладают всеми чертами, необходимыми для активации иммунного ответа: клетки опухолей часто несут мутантные или неправильно процессированные белки, которые могут вызвать иммунную реакцию организма, причем в районе опухоли часто развивается воспалительная реакция (Munn, Bronte, 2016). Согласно общепринятой в последние годы точке зрения, способность опухоли избегать иммунной атаки со стороны хозяина обеспечивается населяющими ее Т-лимфоцитами, макрофагами, дендритными клетками и другими представителями иммунной системы. Попадая в опухолевую ткань, эти клетки начинают синтезировать иммуносупрессивные цитокины, что приводит к повышению концентрации миелоидных супрессорных клеток (MDSC) в опухоли, к активации регуляторных Т-лимфоцитов Fox3+ (Tregs), поляризации опухолеассоциированных макрофагов в М2-фенотип и подавлению пролиферации Т-клеток (Razavi etal., 2016). Кроме того, опухолеассоциированные макрофаги помимо секреции способствующих росту опухоли цитокинов поддерживают локальный непрерывный процесс воспаления, который в свою очередь благоприятствует генетической нестабильности опухолевых клеток (Mantovani et al., 2008; Hanahan, Weinberg, 2011). К списку цитокинов, концентрация которых возрастает в МО, относятся интерлейкины IL-1бета, IL-6, IL-8, IL-10 и факторы TGF-1бета и TNF-a. Провоспалительный цитокин IL-1бета благодаря активации сигнального пути IL-1бета/IL-1RI/бета-катенин провоцирует эпителиально-мезенхимный переход (ЭМП) опухолевых клеток (Jimenez-Gardino etal., 2017). Другой провоспалительный цитокин, IL-6, является резидентом МО большого количества опухолей, в частности немелкоклеточного рака легкого (Abulaiti etal., 2013), рака молочной железы (Chang et al., 2013), простаты (Giri et al., 2001), поджелудочной железы (Lesina etal., 2011) и опухолей другого происхождения. IL-6 через свой рецептор IL-6R и Ja nus-сигнальный путь активирует STAT3, а это приводит к усиленной пролиферации опухолевых клеток, приобретению ими устойчивости к противоопухолевым препаратам, индукции ЭМП и в конечном итоге ведет к усилению метастазирования (Mace et al., 2013; Domingues et al., 2017). IL-8, который также замечен в МО опухолей разного гистогенеза, может высвобождаться из опухолеассоциированных фибробластов, попавших под влияние опухоли, и самих опухолевых клеток (Domingues et al., 2017). IL-8 рекрутирует в опухолевый очаг новые наивные клетки иммунной системы, стимулирует ангиогенез опухоли (Suarez-Carmona et al., 2015) и ЭМП опухолевых клеток (Sanmamed et al., 2014). Еще одним фактором, регулирующим МО, является TNF-a, плейотропный цитокин, который играет ключевую роль в регуляции апоптоза, опухолевого ангиогенеза, воспаления и иммунитета. TNF-a может играть как про-, так и противоопухолевую роль (Наш et а!., 2016). Продуцируемый клетками МО, TNF-a стимулирует экспрессию других цитокинов, промежуточных продуктов активных форм кислорода, оксида азота и простагландинов (Balk-will, 2009). TNF-a участвует почти на всех этапах канцерогенеза и выполняет различные функции, зависящие от типа опухоли и МО: при высоких концентрациях TNF-a коррелирует с регрессией опухоли, а при продолжительно низких концентрациях, напротив, способствует прогрессии опухоли, стимулируя экспрессию других факторов роста и цитокинов (Balkwill, 2009). Любая солидная опухоль представляет собой объемное образование, и наивный макрофаг, мигрируя внутрь тела опухоли, встречается с новыми и новыми популяциями опухолевых клеток. Что происходит с макрофагами по мере их продвижения по опухолевой ткани, как меняется их фенотип, как меняется цитокиновый профиль МО и как на эти события реагируют опухолевые клетки? Целью настоящей работы было найти ответы на эти вопросы. Материал и методика Клетки эпидермоидной карциномы человека А431 и клетки моноцитарной лейкемии ТНР-1 (суспензионная культура) были получены из Коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки обеих клеточных линий культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с содержанием 4.5 мг/мл глюкозы, 2 мМ L-глютамина, 10 % фетальной бычьей сыворотки (Gibco, США) и 0.05 мг/мл гентамицина (Биолот, Санкт-Петербург) в атмосфере 6 % С02 при 37 °С. Моноцитоподобные клетки ТНР-1 традиционно используют в качестве модели недифференцированных макрофагов (Старикова и др., 2005). Для того чтобы имитировать процесс продвижения макрофага внутри опухолевой ткани и, возможно, для приобретения ими нового фенотипа мы применили модель in vitro поэтапного «обучения» макрофагов. Клетки А431 высевали в чашки Петри 10 см в концентрации 60 тыс./мл накануне эксперимента. После того как клетки прикреплялись ко дну чашки, вносили клетки ТНР-1 в соотношении 1:1. Сокультивирование проводили 24 ч, после чего обученные макрофаги (1-й этап) пересаживали к свежим клеткам А431, посеянным накануне, в аналогичных соотношениях (рис. 1). Для того чтобы выдержать соотношение 1 : 1 на всех этапах сокультивирования, на 1-м этапе совместное культивирование проводили в трех чашках Петри, на 2-м — в двух и на 3-ем — в одной. Суспензионные клетки ТНР-1 собирали с помощью пипетирования. При каждом пересеве считали число мертвых клеток в культуре с помощью окрашивания трипановым синим и камеры Ньюбауэра. После каждого этапа отдельно собирали клетки А431, ТНР-1 и кондиционированную среду, в которой проводили сокультивирование, замораживали и хранили при -80 °С. Всего было проведено по 6 повторов каждого этапа. Содержание цитокинов IL-1бета, IL-6, IL-8 и TNF-a в кондиционированной среде после каждого из трех этапов сокультивирования клеток оценивали с помощью мультиплексного иммунологического анализа на магнитных микросферах и технологии MilliPlex согласно рекомендациям фирмы-производителя (Merck, Германия). Mil-liplex Human Cytokine Magnetic Panel HCYTOMAG-6OK была любезно предоставлена компанией Merk. Было проведено два независимых измерения цитокинового профиля культуральной среды. Активность ММР клеток А431 в процессе совместного культивирования с макрофагами оценивали с помощью зимографии. Для этого после каждого из трех этапов сокультивирования удаляли суспензионные клетки ТНР-1, клетки А431 тщательно промывали PBS и вносили бессывороточную среду, в которой клетки культивировали в течение 18 ч. Среду отбирали, центрифугировали при 3000 g 5 мин и смешивали с буфером для проб, содержащим SDS. Акриламидные гели для электрофореза полимеризовали в присутствии 1 мг/мл желатина. Пробы подвергали электрофорезу в полученных гелях и отмывали от SDS 2.5%-ным раствором Тритона Х-100 2 раза по 30 мин. Затем гели инкубировали в реакционном буфере (50 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 0.15 М NaCl, 10 мМ СаС12и 0.05 % Brij 35) в течение 12 ч. После прохождения протеолитической реакции гели окрашивали красителем Кумасси синим R-250 и выявляли неокрашенные зоны с мол. массой, соответствующей ММР-2 и ММР-9. Оценка экспрессии маркера проопухолевых макрофагов (F4/80). Наивные клетки ТНР-1 и клетки ТНР-1, собранные после 1-го этапа сокультивирования, окрашивали антителами к маркеру F4/80 (Cell Signaling, США) на холоде (4 °С) в течение 2 ч, после чего отмывали с помощью холодного PBS, фиксировали в 4%-ном растворе формалина и окрашивали вторичными антителами, меченными А1еха-б47 (Invitrogen, США). Ядра окрашивали с помощью 4',6-диамидино-2-фенилин-дола (DAPI; Sigma, США). Для выявления контакта между опухолевыми клетками А431 и клетками ТНР-1 (представляющих в наших экспериментах макрофаги) использовали клетки ТНР-1, трансдуцированные с помощью лентивирусной конструкции геном зеленого флуоресцентного белка GFP. Клетки А431 высевали на покровные стекла в лунки 24-луночной платы в концентрации 60 тыс./мл и на следующее утро вносили в эти же лунки клетки THP-1-GFP в соотношении 1:1. Культивирование проводили в течение 24 ч, после чего стекла с клетками тщательно промывали холодным PBS и фиксировали в растворе 4%-ного формальдегида, окрашивали фаллоидином, меченным Alexa 633 (Life Technology, США). Ядра окрашивали DAPI. Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа TSL SP 5 (Leica, Германия) с использованием лазеров с длинами волн 405 и 647 нм. Проточная цитофлоуриметрия. Наивные клетки ТНР-1 и клетки ТНР-1, собранные после трех этапов сокультивирования, инкубировали в полной культуральной среде с антителами к F4/80 (Abeam, Великобритания) в течение 2 ч при 4 °С, вторичными антимышиными антителами, меченными Alexa 488 и реактивом Anexin-V Alexa Fluor ТМ 633 (оба Life Technology, США), для определения уровня апоптоза. Клетки анализировали с помощью цитометра CytoFlex Flow (Beckman Coulter, США), используя лазеры с длинами волн 488 и 647 нм. Иммуноблотинг. Для выявления маркеров дифференцировки макрофагов с проопухолевым фенотипом клетки ТНР-1, прошедшие 1-й и 2-й этапы обучения, собирали, центрифугировали и трижды промывали в растворе PBS. К сухому клеточному осадку добавляли лизи-рующий буфер High RIPA: 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 0.1 % Тритона Х-100, 0.5 % SDS, 1 % DOC, 2 мМ EDTA и 100-кратный раствор ингибитора протеаз (Mammalian Inhibitor Protease, Sigma). После трех циклов замораживания-оттаивания лизат центрифугировали при 10 000 об/мин, в супернатанте определяли концентрацию белка по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Лизаты клеток (по 20 мкг на дорожку) использовали для электрофореза и иммуноблотинга. Мембрану последовательно инкубировали с антителами к аргиназе 1 (Arg-1, маркеру макрофагов М2) и вторичными антимышиными антителами, меченными пероксидазой хрена (Abeam, Великобритания). Для контроля равномерности нанесения белковых проб использовали антитела к GAPDH (Abeam, Великобритания). Оценку миграции и пролиферации клеток А4 3 1 проводили сразу после сокультивирования с клетками ТНР-1 в режиме реального времени с помощью прибора xCELLigence RTCA DP (Biosciences, Inc.). В лунки 16-луночной Е-платы, на дно которых напылен золотой электрод, сопротивление которого изменяется в зависимости от площади соприкосновения клеток с поверхностью лунки, вносили клетки А431 (по 200 тыс./мл) после 1, 2 и 3-го этапов совместного культивирования. Измерение сопротивления (импеданс) проводили каждые 10 мин в течение 36 ч. Оценку миграционных свойств клеток А431 после совместного культивирования с клетками ТНР-1, прошедшими 1, 2 или 3 этапа обучения, проводили с помощью камер Бойдена (Boyden chambers) или планшетов с двуполостными лунками с полупроницаемой перегородкой, на нижнюю поверхность которой напылен золотой электрод (для измерения миграционных свойств клеток в режиме реального времени). Клетки А431 после совместного культивирования с обученными ТНР-1 сеяли в среде без сыворотки в концентрации 100 тыс./мл, либо в верхнюю полость лунки планшета, либо в верхнюю полость камеры Бойдена. В нижнюю полость помещали культуральную среду, содержащую 10 % фетальной сыворотки. Измерение сопротивления (импеданс) на нижней стороне полости проводили каждые 10 мин в течение 24 ч. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения прибора RTCA, Software 1.2. Клетки в камере Бойдена окрашивали красителем Гимза, клетки из внутренней части камеры удаляли с помощью ватной палочки, оставшиеся на внешней поверхности камеры клетки фотографировали (камера AxioCamERc5S; Zeiss, Германия). Статистическая обработка. Анализ проводили при помощи программы Microsoft Excel 2010 для малых выборок. Данные представлены средними значениями со стандартными отклонениями. Статистически значимыми считали различия при Р < 0.05. Каждый эксперимент повторяли 2—4 раза. Результаты: Совместное культивирование клеток А431 с моноцитоподобными клетками ТНР-1 приводит к изменению фенотипа последних. Для того чтобы понять, влияют ли опухолевые клетки в нашей модели на свойства и фенотип клеток ТНР-1, модулирующих в нашем исследовании макрофаги, мы исследовали изменения морфологии клеток ТНР-1 с помощью конфокальной микроскопии. При сокультивировании с клетками А431 клетки ТНР-1 изменяют свою сферическую форму на распластанную, для которой характерны адгезионные контакты (рис. 2, а). Это одно из подтверждений макрофагальной дифференцировки, так как циркулирующие в крови моноциты имеют округлую шарообразную форму (Eligini et al., 2013). Чтобы проверить, сопряжены ли изменения морфологии моноцитов с их переходом к проопухолевому фенотипу, мы использовали конфокальную микроскопию и проточную цитофлуориметрию с окраской клеток антителами к маркеру макрофагов М2 — F4/80 и маркером апоптоза — Annexin-V. Это позволило нам оценить, какая доля клеток ТНР-1, приобретших проопухолевый фенотип, погибла по механизму апоптоза. Небольшое количество наивных клеток ТНР-1 до сокультивирования экспрессирует на своей поверхности маркер М2-фенотипа F4/80 (рис. 2, б, в), но после 1-го этапа сокультивирования доля клеток, положительных по этому маркеру, выросла до 61.12%. Однако 42.04% клеток этой субпопуляции были комитированы к апоптозу, о чем свидетельствуют данные проточной цитофлуорометрии (рис. 2, в). Вопреки нашим ожиданиям по мере обучения клетки ТНР-1, представляющие в нашем исследовании макрофаги, не приобретали, а теряли проопухолевый фенотип. После 2-го этапа сокультивирования 52.28 % клеток несли маркер F4/80 и 67.02% от этого количества встали на путь апоптоза (рис. 2, в). К 3-му этапу только 17.01% клеток были положительными по F4/80 и 76.03% от этого количества были положительными по Annexin-V (рис. 2, в). Данные об утрате клетками ТНР-1 проопухолевого фенотипа макрофагов М2 в процессе сокультивирования с агрессивными опухолевыми клетками были подтверждены с помощью другого маркера проопухолевых макрофагов— Arg-1. В нормальных условиях клетки ТНР-1 экспрессируют невысокий уровень Arg-1 (рис. 2, г). При сокультивировании с клетками А431 уровень Arg-1 в клетках ТНР-1 резко повышается уже на 1-м этапе, но при последующих этапах приближается к контрольному (рис. 2, г). Совместное культивирование клеток А431 с клетками ТНР-1 приводит к изменению цитокинового секретома. Цитокиновые профили в МО (IL-ф, IL-6, IL-8 и TNF-a) определяли с помощью мультиплексного иммунологического анализа на магнитных микросферах и технологии MilliPlex. Результаты этого эксперимента показали, что встреча опухолевых клеток с наивными клетками ТНР-1, модулирующими макрофаги (1-й этап), приводит к значительному повышению количества всех четырех цитокинов в среде сокультивируемых клеток. Ко 2-му этапу уровень цитокинов возвратился к контрольному значению и по мере обучения макрофагов больше не вырос. Кроме цитокинов важными игроками в МО являются ММР — основные ферменты, расщепляющие белковые компоненты внеклеточного матрикса. Избыточная деградация внеклеточного матрикса является характерной чертой процесса метастазирования. ММР секретируются в основном под действием провоспалительных цитокинов, а главным их источником считаются активированные макрофаги, нейтрофилы, фибробласты, а также эндотелиальные и опухолевые клетки (Бережная, 2009). Чтобы понять, происходит ли изменение уровня ММР в среде в процессе сокультивирования клеток А431 с клетками ТНР-1, мы оценили активность ММР-2 и ММР-9 с помощью зимографии. Уровень активности ММР-2 и ММР-9 в культуральной среде, полученной в результате сокультивирования клеток А431 и ТНР-1, значительно возрастал на 1-м этапе и постепенно понижался в процессе обучения (рис. 3, б). Сокультивирование клеток А-431 с клетками ТНР-1 приводит к усилению пролиферативных и миграционных свойств опухолевых клеток. Чтобы понять, способны ли обученные макрофаги влиять на свойства опухолевых клеток, такие как способность к пролиферации или к миграции, мы провели три этапа обучения клеток ТНР-1 (рис. 1) и после каждого этапа исследовали пролиферативные и миграционные свойства клеток А431. Сокультивирование клеток А431 с клетками ТНР-1, прошедшими обучение с опухолевыми клетками в течение 2-го и 3-го этапов, существенно не влияло на скорость роста опухолевых клеток (рис. 4, а), однако после сокультивирования с наивными ТНР-1 клеточный индекс, отражающий скорость пролиферации клеток А431, значительно увеличивался по сравнению с клеточным индексом интактных клеток А431 (рис. 4, а). В экспериментах по изучению миграционных свойств опухолевых клеток наивные ТНР-1 оказали наиболее значительное влияние на способность опухолевых клеток к миграции по сравнению с клетками ТНР-1, прошедшими 2 или 3 этапа сокультивирования (рис. 4, б). Данные, полученные с использованием камеры Бойдена (рис. 4, в), подтвердили результаты экспериментов с применением прибора xCELLingence: после совместного культивирования клеток А431 с наивными клетками ТНР-1 (1-й этап) гораздо большее количество клеток прошло сквозь поры проницаемой мембраны и оказалось на ее нижней стороне (рис. 4, в). Обсуждение Опухолеассоциированные макрофаги неравномерно распределяются в пространстве опухоли, как было показано в недавнем исследовании на опухолях молочной железы человека (Tashireva et al., 2017). Локализация макрофагов в определенных структурах опухоли может влиять на поведение опухолевых клеток и коррелировать с повышенным количеством метастатических узлов у пациентов (Tashireva et al., 2017). Функция макрофагов также зависит от их локализации в МО (Budakov et al., 2017), а это значит, что поведение и дифференцировка макрофагов определяются цитокиновым профилем в той или иной точке опухолевого узла (Stakheyeva et al., 2017). В наших экспериментах мы попытались воспроизвести in vitro те события, которые происходят с макрофагами, попавшими в МО, по мере их прохождения внутрь опухоли. Мы оценили изменения фенотипа макрофагов, свойств опухолевых клеток и содержания цитокинов в культуральной среде при последовательном сокультивировании клеток А431 и ТНР-1 (рис. 1). В результате экспериментов мы выяснили, что наивные клетки ТНР-1 при первом же контакте с опухолевыми клетками значительно меняют свой фенотип на проопухолевый, о чем говорит повышенная экспрессия маркеров М2-фенотипа F4/80 и Arg-1 у клеток ТНР-1. Однако мы заметили, что 26.1% популяции клеток ТНР-1 погибает по механизму апоптоза уже после 1 -го этапа сокультивирования с клетками А431, причем среди клеток, несущих на своей поверхности маркер F4/80, уровень апоптотических клеток еще выше — 42% (рис. 2). С каждым этапом сокультивирования доля апоптозных клеток, несущих F4/80, возрастала и достигала на 3-м этапе 76% (рис. 2). Вследствие этого и общая доля клеток, несущих маркер F4/80 в популяции ТНР-1, также неуклонно уменьшалась (рис. 2, б). Анализ цитокинового профиля в культуральной среде после сокультивирования клеток А431 и ТНР-1 позволил внести ясность в причины массовой гибели макрофагов. Согласно данным мультиплексного анализа, появление в клеточной среде IL-1бета, IL-6, IL-8 и TNF-a приходилось на 1-й этап сокультивирования (рис. 3). Важно, что среди этих цитокинов был TNF-a, известный мощный индуктор апоптоза, запускающий процесс программированной клеточной смерти через соответствующий рецептор TRAIL (TRAIL: TNF-related apoptosis-inducing ligand) (Fiorucci et al., 2005), и уровень его содержания доходил до 120 пг/мл. Клетки ТНР-1 экспрессируют рецептор TRAIL на высоком уровне (Wei et al., 2010; Liu et al., 2017), и это делает их крайне чувствительными к действию TNF-a. Мы предполагаем, что именно выброс TNF-a индуцировал апоптоз в популяции клеток ТНР-1, причем апоптозная программа реализовывалась и на 1-м, и на 2-м, и на 3-м этапах, когда TNF-a в среде уже не было (рис. 3). Вероятно, гибель макрофагов, изменивших свой фенотип на проопухолевый, и стала причиной того, что эти клетки не смогли повлиять на свойства клеток А431 при дальнейшем сокультивировании. Действительно, и пролиферативные, и миграционные способности клеток А431, связанные с повышенным содержанием в среде IL-1(3, IL-6 и IL-8 (рис. 3), усилились только в результате первого контакта между наивными опухолевыми клетками и макрофагами (рис. 4), так же как и уровень ММР-2 и ММР-9 в культуральной среде (рис. 3, б). Мы не можем сказать сегодня, насколько описанный феномен является универсальным, будет ли он повторяться при использовании других линий опухолевых клеток. Однако учитывая то, что опухоль обычно сопровождается хроническим воспалением (Balkwill, Mantova-ni, 2001), что позволяет ее назвать «незаживающей раной» («non-healing wound») (Dvorak, 1986), можно ожидать от опухолевых клеток секреции определенных цитокинов, влияющих на жизнь и смерть макрофагов, попадающих в ее сферу влияния. А это значит, что элементы МО не менее чем сами опухолевые клетки должны стать мишенью для противоопухолевой терапии.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 5.-С.357-364. Библ. 0 назв.
Просмотров: 132