УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СЕНСОМОТОРНОИ КОРЕ ПРИ ОТСТАВАНИИ РАЗВИТИЯ ДВИГАТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС, ПЕРЕНЕСШИХ ПРЕНАТАЛЬНУЮ ГИПОКСИЮ

Аннотация:

Проведено сравнительное изучение особенностей морфогенеза и синаптогенеза сенсомоторной коры и изменений двигательного поведения в раннем онтогенезе (Р5 и Р14) крыс с нормальным развитием и перенесших пренатальную гипоксию на Е14 (7% 02, 3 ч). У крыс после пренатальной гипоксии обнаружена задержка в созревании элементов нервной ткани сенсомоторной коры в первые 2 нед постнатального онтогенеза. В нейропиле сенсомоторной коры были выявлены следующие признаки незрелости нервной ткани — большой объем межклеточного пространства, многочисленные конусы роста, недостаточно дифференцированные нейроны, отсутствие зрелых синапсов, единичные шипики без шипикового аппарата и контакты между отростками в виде десмосом. У 14-суточных крысят, перенесших пренатальную гипоксию, помимо отставания формирования элементов нервной ткани обнаружены признаки деструкции нервных клеток — гиперхроматоз и хроматолиз с лизисом органоидов и разрушением наружной мембраны. Показано, что пренатальная гипоксия, являясь тяжелым стрессовым фактором, может вызывать отставание в развитии двигательной активности у крысят в раннем онтогенезе. В частности, такое отставание проявлялось в формировании реакции постановки конечности на опору — плейсинга — и в снижении общей спонтанной двигательной активности. Сопоставление полученных результатов с данными об аналогичных изменениях в дорсолатеральном стриатуме, описанными ранее, позволяет сделать вывод о том, что действие неблагоприятного фактора в период эмбриогенеза вызывает морфофункциональное отставание формирования элементов кортикостриарной системы, что приводит к нарушению развития двигательного поведения и координированных реакций животных. Ключевые слова: онтогенез, нейрогенез, синаптогенез, сенсомоторная кора, пренатальная гипоксия, двигательное поведение, крыса, электронная микроскопия. Снижение содержания кислорода может являться тяжелым стрессорным фактором и вызывать гипоксическое состояние у матери, сопровождающееся гипоксией плода, что в свою очередь может приводить к нарушению нормального процесса созревания организма (Nyakas etal., 1996; Соколова и др., 2016). В первые 2 нед после рождения у крыс, перенесших пренатальную гипоксию на Е14, наблюдали нарушения физиологического развития (набор массы, время открытия глаз и отделения ушной раковины) (Дубровская, Журавин, 2008). Это может быть связано с тем, что кортикальные отделы мозга еще не полностью сформировались и не могут полноценно принимать участие в анализе сенсорной информации, организации и координации двигательной активности животного. В период Ell—Е15 у крыс происходит формирование клеточных популяций базальных ганглиев (Reid, Walsh, 2002) и сенсомоторной коры (Rakic, 1995), которые в ходе дальнейшего развития определяют функционирование как пирамидной, так и экстрапирамидной систем организации движения животного. При действии гипоксии на самок на 14-е сут беременности у их потомства наблюдали нарушение пролиферации и миграции нейробластов, поступающих в кортикальную пластинку и образующих проекционные нейроны (Vasilev et al., 2016). Тем не менее причины последующего отставания формирования отделов конечного мозга в раннем постнатальном онтогенезе таких животных нельзя считать достаточно изученными. Основным методом настоящего исследования была выбрана электронная микроскопия, позволяющая в полном объеме оценить протекание нейрогенеза и самое главное синаптогенеза. Исследование синаптогенеза крайне важно для изучения формирования межклеточных связей, обеспечивающих пластичность нервной системы. Подобных ультраструктурных исследований нарушения формирования коры головного мозга у потомства самок, перенесших действие неблагоприятного фактора в период беременности, ранее не проводилось, что определяет новизну настоящей работы. Целью данного исследования являлось сравнительное изучение особенностей дифференцировки нейронов, формирования их отростков и дендритных шипиков, образования и созревания синаптических терминалей в ткани сенсомоторной коры, а также развития некоторых двигательных реакций в раннем онтогенезе (Р5 и Р14) у крысят из потомства самок, перенесших гипоксию на 14-е сут беременности. Материал и методика Животные. Исследование проводили на самцах крыс линии Вистар контрольной и экспериментальной (пренатальная гипоксия) групп в возрасте 5 (Р5) и 14 (Р14) сут после рождения. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколом обращения с лабораторными животными Института эволюционной физиологии и биохимии РАН, основанном на директиве Европейского сообщества по гуманному обращению с экспериментальными животными (European Communities Council Directive #86/609 for the Care of Laboratory Animals). Ha 14-е сут беременности самок экспериментальной группы подвергали действию нормобарической гипоксии в специальной камере емкостью 100 л, содержащей системы терморегуляции, вентиляции, газового анализа и адсорбции выдыхаемого С02. В ходе эксперимента содержание кислорода в камере снижали с 20.7 до 7.0% и поддерживали на этом уровне в течение 3 ч. Концентрация С02 в камере не превышала 0.2%, а температура поддерживалась на уровне 22°С. В камеру одновременно сажали не более 10 крыс. Исследование проводили на потомстве этих самок. На 20-е сут беременности (за 1 сут до родов) самок рассаживали по отдельным клеткам, в каждом выводке оставляли по 8 крысят. Контролем служили животные из потомства самок, не подвергавшихся действию гипоксии. Световая микроскопия. Светооптическое исследование проводили на контрольных животных (n=10 в каждой возрастной группе) и крысах, подвергшихся пренатальной гипоксии на Е14 (n=9). Ткань мозга фиксировали методом транскардиальной перфузии 10%-ным нейтральным формалином на фосфатном буфере (PBS, 4 °С, рН 7.4), замороженные фронтальные срезы толщиной 20 мкм изготавливали на криостате Leica CM 1510S (Leica Microsystems, Германия). Для исследования отбирали срезы сенсомоторной коры мозга (Bregma = 3.30 mm по Paxinos and Watson 2006), окрашенные по Нисслю. С помощью микроскопа ImagerA (Zeiss, Германия) оценивали состояние нейронов. Электронная микроскопия. На Р5 (контроль n=5, гипоксия n=4) и Р14(n=4 в каждой группе) проводили электронно-микроскопическое исследование. Ткань фиксировали методом транскардиальной перфузии смесью 1%-ного глутаральдегида и 1%-ного формальдегида на 0.1 М PBS, рН 7.4, дофиксировали 1%-ным 0s04, контрастировали уранил-ацетатом, обезвоживали и заливали в Аралдит по стандартному протоколу (Журавин и др., 2005). На ультратоме LKB-III (LKB, Швеция) изготавливали ультратонкие срезы толщиной 500 А, которые затем исследовали на электронном микроскопе FEI Тесnai V2 (FEI, США). Исследование развития двигательной активности в раннем постнатальном онтогенезе проводили на крысах контрольной (n=56) и гипоксической (n=65) групп. Реакция постановки передней конечности на опору или плейсинг (chin tactile placing; см.: Allam, Abo-Eleneen, 2012). Крысенка брали за кожу на холке и дотрагивались его подбородком до горизонтально натянутой тонкой проволоки. Реакцию постановки передней конечности на опору — горизонтальную проволоку — оценивали в течение 1 мин по 4 балльной системе: 0 — нет реакции, 1 — слабый хаотический подъем конечностей без контакта с проволокой, 2 — подъем конечности до опоры с заминкой, 3 — точный и быстрый подъем обеих конечностей с постановкой на опору. Спонтанная двигательная активность. В течение 1 мин проводили регистрацию суммарной продолжительности разнообразных движений — спонтанных хаотических движений конечностей, головы, туловища и периодических координированных ритмических сгибаний и разгибаний (за исключением дыхательных движений). Статистическая обработка данных. Для оценки достоверности выявляемых между группами различий использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Результаты: Динамика развития нервной ткани сенсомоторной коры мозга в онтогенезе крыс. Электронно-микроскопическое исследование показало, что на Р5 у контрольных крыс нервная ткань сенсомоторной коры незрелая, с большим объемом межклеточного пространства, где выявляются тонкие нейрональные отростки с большим количеством дендритных трубочек (рис. 1, а, б). В нейропиле коры обнаружено большое количество конусов роста с крупными светлыми округлыми ростовыми везикулами и вакуолями различного размера и формы. В некоторых конусах роста заметны мелкие пузырьки, похожие на синаптические, которые скапливаются на одном из их полюсов. В таких местах заметны уплотнения синаптической мембраны. Клетки образуют однородную популяцию незрелых малодифференцированных нейронов с маленьким ободком бедной органоидами цитоплазмы вокруг овального ядра (рис. 1, а). В цитоплазме таких нейронов наблюдается большое количество свободных рибосом. Преобладают клеточные контакты в виде десмосом (рис. 1, в). Незрелые синаптические контакты и шипики встречаются редко. На Р5 после пренатальной гипоксии выявлено заметное отставание в скорости созревания нервной ткани сенсомоторной коры мозга. Конусы роста встречались редко, причем только вблизи нейронов. Молодые мало-дифференцированные нейроны располагались группами (рис. 1, г). Овальные ядра молодых нейронов содержали диспергированный хроматин. В нейропиле преобладали контакты в виде десмосом (рис. 1, е). На рис. 1, д продемонстрированы многочисленные синаптические окончания на поверхности крупного нейрона. Каких-либо деструктивных изменений нейронов на этой стадии развития крыс после пренатальной гипоксии не обнаружено. К 2 нед постнатального онтогенеза у контрольных крыс заметны признаки созревания и дифференцировки всех компонентов нервной ткани сенсомоторной коры. Однако в I молекулярном слое, где все еще преобладает большой объем межклеточного пространства, заметны тонкие нейрональные отростки, идущие в разных направлениях. Определить их принадлежность к аксонам или дендритам на данной стадии развития невозможно (рис. 2, а). Нейропиль II—III пирамидных слоев сенсомоторной коры 2-недельных контрольных крыс — незрелый, неплотный (рис. 2, б). Некоторые конусы роста с крупными округлыми ростовыми везикулами и вакуолями расположены рядом с клеткой (рис. 2, в). Нейроны на этой стадии представляют собой дифференцированные клетки с крупным овальным ядром и иногда с двумя ядрышками. В окружающей ядро цитоплазме таких клеток содержится полный набор клеточных органоидов — рибосомы, шероховатый эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи и митохондрии. Набор этих органоидов важен для белкового синтеза и дыхания клетки. В нейропиле пирамидных слоев четко выявляются отростки глиальных клеток и многочисленные дендриты с ответвлениями и дендритическими трубочками. На ответвлениях дендритов появляется небольшое количество шипиков, но без шипикового аппарата (рис. 2, г). В этот период развития выявляется незначительное количество истинных синапсов со скоплением синаптических пузырьков в пресинаптическом отделе и с выраженным утолщением синаптических мембран (рис. 2, г). В некоторых синаптических окончаниях выявляются одиночные типичные гранулярные пузырьки и небольшое количество уплощенных плеоморфных пузырьков. Тонкие миелинизированные волокна, особенно их крупные пучки, в этот период развития в коре не встречаются. В нейропиле сенсомоторной коры преобладают асимметричные аксодендритические контакты и симметричные аксосоматические контакты. У 2-недельных крыс, перенесших пренатальную гипоксию, заметно значительное отставание нейрогенеза и синаптогенеза по сравнению с контрольными сверстниками. В пирамидных слоях у таких крыс по сравнению с контрольными животными наблюдали менее плотный нейропиль: большой объем межклеточного пространства с многочисленными конусами роста (рис. 2, д, ё). Нейроны менее дифференцированные, много свободных рибосом в узком ободке цитоплазмы вокруг ядра. Шипиков меньше, синапсы менее зрелые, отсутствуют миелинизированные волокна. На рис. 2, д представлены крупный нейрон и продольно срезанный дендрит, которые окружены межклеточным пространством с редкими аксонными окончаниями. Таким образом, в первые 2 нед постнатального онтогенеза в сенсомоторной коре контрольных животных происходят снижение объема межклеточного пространства и числа конусов роста, интенсивная дифференцировка и созревание нейронов, увеличение количества отростков, формирование новых синапсов, развитие шипиков и становление межнейронных связей. Однако в случае пренатальной гипоксии сохраняются увеличенный объем межклеточного пространства и большое количество конусов роста. Темпы дифференцировки, созревания клеток, нейрогенеза и синаптогенеза снижены, что приводит к нарушению формирования структуры сенсомоторной коры в раннем постнатальном развитии. Нейродегенеративные изменения клеток в сенсомоторной коре. На препаратах, окрашенных по Нисслю, у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, наряду с признаками отставания формирования элементов нервной ткани сенсомоторной коры были обнаружены признаки деструкции нервных клеток на Р14 (рис. 3, а, б, г)), в то время как на Р5 деструктивных изменений нейронов не было обнаружено. На Р14 у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, в сравнении с контролем были выявлены изменения ультраструктурных особенностей пирамидных нейронов. У части крупных пирамидных нейронов происходило набухание клеточных тел и их отростков с появлением вакуолей и лизисом органоидов в цитоплазме (ЭПР, комплекса Гольджи, рибосом и митохондрий, см. рис. 3, б, в). В клетках и их отростках появлялись электронно-прозрачные вакуоли. Такие нейроны были окружены набухшими и разросшимися глиальными отростками. На рис. 3, г показан нейрон, характеризующийся нарушением целостности ядерной оболочки, распадом митохондрий и исчезновением рибосом. Перечисленные признаки характерны для клеток в состоянии хроматолиза, который мы наблюдали на препаратах, окрашенных по методу Ниссля (рис. 3, б). У другой части нейронов, имеющих небольшие размеры, происходило сморщивание тел клеток и их отростков, цитоплазма становилась более электронно-плотной (или гиперхромной при окраске по Нисслю) (рис. 3, д, е). Объем клеточного ядра уменьшался, вокруг него можно было наблюдать тонкий ободок темной цитоплазмы. Из-за повышенной гиперхромности у таких нейронов трудно различить органоиды — митохондрии и ЭПР. Такой тип дегенерации клеток известен как гиперхроматоз. На рис. 3, ж показаны сморщенные темные отростки подобных клеток с электронно-плотной цитоплазмой. Дегенерацию по типу гиперхроматоза наблюдали у нейронов как в I молекулярном слое, так и в пирамидных слоях сенсомоторной коры. В развитии реакции постановки передней конечности на опору (плейсинг) животные, перенесшие пренатальную гипоксию, демонстрировали существенное отставание от контрольных сверстников (рис. 4). В возрасте 5 сут отставание составляло 53% (при 1.61±0.12 балла в контроле и 0.86±0.08 балла в экспериментальной группе, р<0.001), а в возрасте 2 нед разница в выполнении исследуемых реакций животными контрольной и экспериментальной групп сокращалась до 16% (при 2.68±0.08 балла в контроле и 2.26±0.11 балла в экспериментальной группе, р = 0.007). Спонтанная двигательная активность. При анализе такой менее специфической реакции, как спонтанная двигательная активность, было обнаружено, что ее продолжительность была выше (р<0.01) в контрольной группе, чем в экспериментальной, как у крысят в возрасте 5 сут (27.00±1.43 и 23.09±1.24 с соответственно), так и у крысят в возрасте 14 сут (58.08±1.50 и 36.50±3.62 с соответственно). Обсуждение: При анализе полученных морфологических данных главное внимание обращали на такие показатели, как степень зрелости клеточных элементов нервной ткани и нейропиля, а самое главное, на уровень синаптогенеза, который дает возможность определить ведущую роль сенсо-моторной коры контрольных крыс в возрасте 2 нед в поддержании характерных для данной стадии развития поведенческих реакций (Nyakas et al., 1996; Дубровская, Журавин, 2008; Дубровская и др., 2017). При проведении сравнительного ультраструктурного исследования нервной ткани сенсомоторной коры на Р5 и Р14 у контрольных крыс и крыс, перенесших пренатальную гипоксию, у последних было отмечено значительное отставание формирования межнейронных связей. У контрольных крыс к 2 нед после рождения происходит интенсивный процесс формирования синаптических терминалей, у которых появляются синаптические пузырьки, митохондрии и истинные терминали с утолщением специализированных участков мембран. В то же время у гипоксических животных было отмечено значительное отставание в формировании этих признаков. Однако и у контрольных животных, и у крысят, перенесших пренатальную гипоксию, на этой стадии отсутствуют синаптические пузырьки с нейромедиаторами в терминалях, зрелые синаптические контакты и шипиковый аппарат в дендритных шипиках. Несмотря на имеющиеся свидетельства об активном врастании таламокортикальных волокон в кору 1—6-суточных крысят (Жарская и др., 1984), признаков процесса миелинизации у крысят в данный период развития нами не обнаружено. У крысят, подвергшихся пренатальной гипоксии, нами ранее были обнаружены аналогичные признаки незрелости ткани дорсолатерального стриатума (слабодифференцированные нейроны, незрелый нейропиль, отставание синаптогенеза) в течение первых 2 нед жизни (Журавин и др., 2005, 2007). Это может свидетельствовать об отставании развития целого ряда отделов головного мозга, в том числе сенсомоторной коры и стриатума, которые включены в пирамидную и экстрапирамидную системы организации движений крыс. Выявленное отставание развития данных систем согласуется с литературными данными о временном паттерне формирования проекционных нейронов новой коры и стриатума (Reid, Walsh, 2002), а также с наблюдаемым нарушением как специфических для сенсомоторной коры (плейсинг), так и неспецифических (спонтанная двигательная активность) двигательных реакций у крысят, перенесших пренатальную гипоксию в период формирования этих клеток (Е14). Через 2 нед после рождения у крысят, перенесших пренатальную гипксию, наряду с отставанием дифференциации и созревания нервной ткани обнаружены признаки дегенеративных изменений нейронов на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях — хроматолиз и гиперхроматоз. Предположение о гибели дегенерирующих клеток согласуется с обнаруженным нами ранее повышением экспрессии проапоптотических белков Р53 и каспазы-3 и их колокализацией в телах клеток коры мозга (Васильев и др., 2008), а также с наблюдениями других авторов (Отеллин и др., 2002). Ранее нами были обнаружены аналогичные дегенеративные изменения клеток стриатума (как по типу хроматолиза, так и по типу гиперхроматоза), также наблюдавшиеся в течение 2 нед после рождения у крысят, подвергшихся пренатальной гипоксии (Журавин и др., 2007). Возможно, такая гибель клеток связана с элиминацией пирамидных нейронов, интенсивно происходящей в этот период (Vasil'ev et al., 2016). Различие в темпах постепенного развития двигательных реакций, характеризующих состояние сенсомоторной коры (плейсинг; см.: De Ryck et al., 1992; Schallert, 2006; Fan et al., 2008) или головного мозга в целом (спонтанная двигательная активность), отражает функциональную незрелость сенсомоторной коры, наблюдавшуюся на ультраструктурном уровне. Таким образом, результаты сравнительного исследования структурной и ультраструктурной организации сенсомоторной коры в раннем онтогенезе (Р5 и Р14) контрольных крыс и крыс, перенесших гипоксию на Е14, свидетельствуют о влиянии нарушения формирования сенсомоторной коры на двигательную активность животного. Также важно отметить, что незрелость межнейронных контактов препятствует обеспечению синаптической пластичности, что в свою очередь может являться причиной наблюдавшихся нами ранее поведенческих дисфункций (Дубровская, Журавин, 2008; Дубровская и др., 2017) у крыс, перенесших пренатальную гипоксию. Помимо отставания в развитии нами отмечены синхронные нейродегенеративные изменения в отделах кортикостриарной системы (сенсомоторная кора и стриатум) у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, что может также вносить свой вклад в развитие двигательных дисфункций у таких животных.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 5.-С.390-397. Библ. 0 назв.
Просмотров: 97