УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБА ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА

Аннотация:

Представлены результаты исследований по разработке нового способа идентификации цитратассимилирующих энтеробактерий. В последние годы, ввиду значительного увеличения циркуляции этих микроорганизмов у лиц с дисбиотическим состоянием кишечника, возникла необходимость в большем объеме их идентификации. Предлагается простой и не затратный способ идентификации этой группы микроорганизмов при помощи ограниченного набора тестов. Способ защищен патентом на изобретение. Ключевые слова: условно-патогенные бактерии (УПБ), цитратассимилирующие энтеробактерии. Проблема дисбактериоза кишечника продолжает оставаться актуальной, несмотря на значительное количество научных и научно-практических работ в этой области, регистрируемое в последнее время. Актуальность проблемы во многом связана со значительной распространенностью этого состояния как у детей, так и у взрослых, формирующегося под влиянием различных факторов, имеющих непрекращающуюся тенденцию к росту. В ходе микробиологической диагностики этого нарушения выяснилось, что свыше 70,0% всех дисбактериозов связано с увеличением в микробном пейзаже условно-патогенных бактерий (УПБ), в том числе, цитратассимилирующих энтеробактерий. К цитратассимилирующим бактериям семейства Enterobacteriacaeae относятся представители различных родов и видов, обладающие способностью использовать цитрат натрия как единственный источник углерода. При посеве такого микроорганизма на питательную среду, содержащую цитрат натрия (среду Симмонса), в ходе реакции происходит сдвиг РН в щелочную сторону, в результате чего среда окрашивается в ярко-синий цвет (исходная среда имеет зеленую окраску). К наиболее часто встречаемым в медицинской практике цитратассимилирующим энтеробак-териям относятся: род Клебсиелла -«.pneumoniae (с подвидами пневмонии, озены и риносклерома-тис), K.oxytoca; род Цитробактер - C.amalonaticus, C.freundii, C.koseri, C.youngae; род Энтеробактер - E.aerogenes, Е.cloacae; род Серрация - S.marcescens, S.plymuthica, S.rubidaea; род Провиденция; род Протеус - P.vulgaris, P.mirabilis. Эти микроорганизмы являются условно-патогенными. Они в незначительных количествах могут находиться в толстом отделе кишечника человека, составляя его так называемую «нормальную» микрофлору. При дисбиотических нарушениях кишечника (дисбактериозе) количество условно-патогенной микрофлоры, и в том числе цитратассимилирующих бактерий, может значительно увеличиться и превысить возрастную норму, что выявляется при целенаправленной микробиологической диагностике и требует соответствующего лечения. Кроме того, нельзя не учитывать и факт значительного увеличения изоляции при дисбактериозах кишечника многокомпонентных микробных ассоциаций, в состав которых, как правило, входят цитратассимилирующие бактерии, а также возможно сти этих микроорганизмов вызывать инфекционные заболевания с кишечной и внекишечной локализацией. Идентификации, как таковой, группы цитратассимилирующих бактерий, дающих возможность определить не только род, но и вид, а иногда и подвид, используя при этом ограниченный набор тестов, в доступной нам литературе не встретилось . Наибольшую популярность в последние годы приобрели автоматические бактериологические анализаторы для микрообъемной идентификации, в том числе, энтеробактерий. В нашей стране широкое распространение получил метод идентификации бактерий с помощью баканализатора Vitek - 2 Compact (производства фирмы Bio Merieux, Франция). Подобной техникой оснащены крупные лаборатории и медицинские центры. Такого типа баканализаторы позволяют быстро, без значительных физических затрат и при этом с большой точностью идентифицировать значительное число известных микроорганизмов. Однако большим недостатком идентификации микроорганизмов с помощью этого баканализатора является высокая стоимость как самой аппаратуры, так и расходных материалов к ней, что делает невозможным исследование большого объема материала; кроме того, такая аппаратура едва ли доступна для маленьких лабораторий или других небольших медучреждений. При использовании подобных анализаторов для идентификации цитратассимилирующих энтеробактерий происходит необоснованный расход тест-систем, так как для каждого штамма микроорганизма аппарат использует 64 диагностических теста, тогда как цитратассимилирующие бактерии не требуют такого количества, а могут быть определены с помощью гораздо меньшего набора, что позволяет значительно удешевить их идентификацию, сохранив при этом достаточно высокую точность. Известен ряд методов идентификации энтеробактерий, число и эффективность которых из года в год повышается. Наиболее востребованными и достаточно точными являются макро- и микрообъемные методы биохимической идентификации: использование СИБов - систем индикаторных бумажных, ПБДЭ - пластин биохимических, диагностирующих энтеробактерии - обе системы производства «Микроген», г. Нижний Новгород . Однако обе эти системы не лишены недостатков, так, для системы ПБДЭ необходимо наличие большого числа (20) лунок с субстратами и требуется использования таких тестов, которые при идентификации цитратассимилирующих бактерий могут быть опущены или заменены другими. Кроме того, при использовании этой системы нередко бывают затруднения при учете результатов в связи с недостаточным размером лунки, что сказывается как на точности посева, так и - на учете результатов. Наиболее близким является способ использования СИБов, дающий возможность провести идентификацию с помощью 13 тестов, но он неудобен технически, требует значительных затрат рабочего времени, лабораторной посуды с предварительным ее мытьем, заготовкой, стерилизацией и некоторыми другими манипуляциями, что также увеличивает время выполнения исследования, трудозатраты и, в конечном итоге - его стоимость. Кроме того, способ с использованием СИБов обладает низкой глубиной идентификации: он предназначен только для межродовой и межвидовой идентификации и не способен определить подвид микроорганизма. Цель исследования - разработка способа идентификации цитратассимилирующих энтеробактерий с использованием ограниченного набора тестов. Материалы и методы. Материалом для исследования служили цитратассимилирующие условно-патогенные энтеробактерии, изолированные из фекалий 490 детей и взрослых с выявленными дисбиотическими нарушениями. Основными диагностирующими тестами были: учет образования индола и сероводорода (на МПБ или 1% пептонной воде), подвижности (на 0,3 % агаре) и ассимиляции цитрата натрия (на среде Симмонса). Всего в параллельных опытах изучено 150 культур цитратассимилирующих энтеробактерий. Исследование кишечной микробиоты и оценку результатов проводили по стандартной методике , идентификацию штаммов УПБ - классическим микробиологическим методом, с помощью СИБов «Микроген» (Нижний Новгород), баканализатора Vitec 2 Compact 30 и предлагаемого нами способа. Результаты и обсуждение. Результаты проделанной работы позволили предложить новый способ идентификации цитратассимилирующих энтерорбактерий .В предлагаемом способе, включающем пересев изучаемой колонии микроорганизмов, выросших на средах Эндо или Симмонса, первичная идентификация производится с использованием ограниченного набора тестов, индолообразования, продукции сероводорода, подвижности и утилизации цитрата натрия, по характеру изменения которых изучаемые микроорганизмы вначале подразделяются на шесть условных групп, а в дальнейшем, в зависимости от принадлежности к определенной группе, используется основной и, при необходимости, дополнительный для каждой группы тест, а именно: лизин и при необходимости мочевина - для I группы; лизин и, при необходимости, (последовательно) сорбит, аргинин и рамноза - для III группы; фенилаланин, а в дальнейшем малонат натрия - для 1\/группы; фенилаланин и в дальнейшем лактоза - для VI группы; бактерии II и V группы идентифицируются только по первичным тестам (табл.1). В схему включены роды, виды, и подвиды цитратассимилирующих энтеробактерий в соответствии с [10,14]. Способ осуществляется следующим образом: чистую культуру изучаемого микроорганзма, выросшую на чашечных средах Эндо или Симмонса, засевают на мясо-пептонный бульон (МПБ) или 1% пептонную воду (для определения продукции индола и сероводорода), на 0,3% полужидкий мясо-пептонный агар (для определения подвижности) и на пробирочную среду Симмонса (для определения утилизации цитрата натрия). В том случае, если изучаемый штамм изолирован со среды Симмонса, посев на эту среду в пробирке не делается. После инкубации посевов в термостате при 370 С в течение 18 - 20 час производят учет результатов; при этом идентифицируемые микроорганизмы в зависимости от изменения указанных субстратов могут быть отнесены к одной из шести групп: к I группе относятся неподвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия при росте на среде Симмонса Klebsiella pneumoniae с подвидами (ssp. pneumoniae, ssp.ozenae, ssp. rhinoscle- romatis), основным тестом для дифференциации которых является лизин, а дополнительным - мочевина. ко II группе относятся неподвижные бактерии, продуцирующие индол, не образующие сероводород и ассимилирующие цитрат натрия; в эту группу входит только единственный вид - Klebsiella oxytoca, который окончательно дифференцируется уже по первичным тестам. III группа включает подвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и утилизирующие цитрат натрия - Enterobacter cloacae ssp.cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Serratia plymuthica и Serratia rubidaea, основной дифференцирующий тест группы - лизин, дополнительные тесты - сорбит и аргинин и при необходимости дальнейшей идентификации - рамноза. IV группа включает подвижные штаммы, образующие индол и не образующие сероводород, а также ассимилирующие цитрат натрия - Citrobacter amalonaticus , Citrobacter koseri, а также бактерии рода Providencia. Основной дифференцирующий тест группы - фенилаланин, дополнительный -малонат натрия. V группа объединяет подвижные штаммы, продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат; сюда, как и во II группу, относится единственный вид - Proteus vulgaris, который дифференцируется по первичным четырем тестам (отдельные штаммы этого микроорганизма могут не утилизировать цитрат). Роды и виды бактерий, составляющие VI группу, подвижны, не продуцируют индол и продуцируют сероводород, в большинстве утилизируют цитрат натрия - Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae. Основной дифференцирующий тест группы - фенилаланин, дополнительный - лактоза.Для сравнения основных параметров предлагаемого способа было произведено параллельное изучение одних и тех же штаммов цитратассимилирующих энтеробактерий с использованием трех способов: с помощью индикаторных дисков (СИБ), производства «Микроген», Нижний Новгород, баканализатора Vitek- 2 Compact 30, производства фирмы «Bio Merieux, Франция и предлагаемого способа. Результаты, полученные при этом, свидетельствуют о высокой точности предлагаемого способа, практически не уступающего способам сравнения. Кроме того предлагаемый способ дает возможность идентифицировать большинство микроорганизмов не только до рода и вида, но и до подвида, также, как при использовании высокоточного способа с использованием баканализатора Vitek- 2 Compact 30, тогда как способ с использованием СИБов идентифицирует только до рода и вида. Количество используемых тестов значительно меньше у предлагаемого, чем у способов сравнения. Стоимость исследования одного микроорганизма у предлагаемого способа в 1,5 раза меньше, чем при применении СИБов, и в 5,4 раза ниже, чем при использовании баканализатора Vitek- 2 Compact 30. Кроме того, предлагаемый способ поможет проводить идентификацию цитратассимилирующих штаммов энтеробактерий без использования импортной техники и расходных материалов, что является своего рода средством импортозамещения. Способ был внедрен в работу лаборатории бактериальных инфекций ФБУН Хабаровский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора. В течение последних трех лет с помощью предлагаемого метода нами было идентифицировано более 450 штаммов цитратассимилирующих энтеробактерий, изолированных от лиц с дисбиоти-ческими нарушениями кишечника. Выводы: 1. Разработан новый способ идентификации цитратассимилирующих энтеробактерий , дающий возможность определить не только их род, но и вид и даже подвид, используя при этом ограниченный набор тестов. 2.Способ обладает высокой точностью, требует минимального набора питательных сред и незначительных трудозатрат, а стоимость его в несколько раз ниже всех использованных в исследовании способов идентификации. 3. Указанный способ идентификации может быть применен при проведении исследований на выявление дисбиотических нарушений кишечника, а также при диагностике инфекционных заболеваний, как кишечной, так и внекишечной локализации, обусловленных УПБ.

Авторы:

Издание: Дальневосточный журнал инфекционной патологии
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 34.-С.71-77. Библ. 14 назв.
Просмотров: 273