АНАЛИЗ ЗАВИСИМОСТИ АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОТ СТРУКТУРЫ СОЕДИНЕНИЙ В РЯДУ ЗАМЕЩЕННЫХ ГЛИПРОЛИНОВ

Аннотация:

Синтезирован ряд С-замещенных N-фенилацетилглицилпролинов и изучена связь их структуры и антигипоксической активности в условиях нормобарической гипоксии в дозах 0,1-1 мг/кг внутрибрюшинно в зависимости от С-замещения. Показано, что антигипоксической активностью обладают амид и этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина, способные в биологических средах циклизоваться с образованием цикло-пролилглицина, идентичного эндогенному пептиду с антигипоксической, нейропротективной и другими видами ней-ропсихотропной активности. Антигипоксический эффект был стереоспецифичен: D-энантиомеры были неактивны. У этих соединений обнаружена и нейропротективная активность на клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y в условиях 6-оксидофаминовой нейротоксичности в диапазоне концентраций 10 в -7степени - 10 в -5степени М. Метиламид N-фенилацетилглицилпролина и аналог с открытой карбоксильной группой, неспособные циклизоваться в цикло-пролилглицин, были неактивны. Делается вывод, что активность замещенных глипролинов связана с их превращением в цикло-пролилглицин. Ключевые слова: цикло-пролилглицин; замещенный глипролин; антигипоксическая активность; нейропротективная активность; связь "структура — активность"; пролекарство. Многолетние фундаментальные исследования в "НИИ фармакологии им. В.В. Закусова" привели к открытию эндогенного нейропептида циклопролилглицина (ЦПГ). В фармакологических исследованиях с синтезированным аналогом установлено, что нейропептид способен регулировать память и тревогу, а также обладает антигипоксическим и нейропротекторным действием. ЦПГ подобен пирацетаму, но проявляет основные фармакологические эффекты в 100 - 1000 раз меньших дозах. Как и пирацетам, ЦПГ способен оказывать положительное модулирующее действие на глутаматные АМРА-рецепторы и приводить к усилению синтеза мозгового нейро-трофического фактора BDNF. Нами был сконструирован линейный замещенный глипролин ГЗК-111, этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина, химическая структура которого предполагает возможность превращения в цикло-пролилглицин в биологических средах. Было показано, что ГЗК-111 in vitro в плазме крови крысы действительно превращается в циклопролилглицин и проявляет характерную для последнего активность; ноотропную, анксиолитическую и антигипоксическую. Для расширения группы замещенных глипролинов и подтверждения того, что их активность связана с образованием циклического дипептида, в настоящей работе синтезирован ряд аналогов соединения ГЗК-111 с разным замещением по С-концу и изучена их фармакологическая активность. Синтез аналогов осуществлен по общей схеме (схема). Низкоалкильные эфиры А - фен ил ацетил глицилпролина синтезировали (схема) методом смешанных ангидридов с использованием изобутилхлорформиата в условиях Андерсона. В качестве карбоксильной компоненты использовали TV-фенилацетилглицин, полученный из глицина и хлорангидрида фенилуксусной кислоты по Шоттен - Бауману, а в качестве аминокомпоненты — метиловый или этиловый эфир пролина, полученные из метанола или абсолютного этанола в присутствии хлористого тионила по методу Бреннера. Дипептид с открытой карбоксильной группой (соединение IV) получали гидролизом 1 М щелочью этилового эфира - фенилацстил глицил-L-пролина. Энантиомеры амида N-фенилацетилглицил-Х-пролина (соединения V и VI) получали обработкой соответствующих этиловых эфиров дипептидов аммиаком в метаноле. Метиламид TV-фенил ацетилглицил-1-пролина (соединение VII) получали аминолизом метилового эфира соответствующего дипептида. Изучена антигипоксическая активность всех синтезированных соединений в тесте нормобарической гипоксии с гиперкапнией в дозах 0,1; 0,5 и 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении за 60 мин до тестирования. У соединений с антигипоксической активностью исследованы нейропротекторные свойства, анализ которых проводили на культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y в условиях 6-оксидофаминовой нейротоксичности в диапазоне концентраций 10 в- 8степени - 10 в -5степени М при внесении соединений за 24 ч до токсина. Антигипоксическая активность обнаружена только у амида V. В дозе 1 мг/кг соединение достоверно увеличивало продолжительность жизни животных, уступая описанному ранее этиловому эфиру I (ГЗК-111) как по дозам, так и по выраженности эффекта. Эффекты амида V, как и низкоалкильного эфира I, являются стереоспецифичными, его D-энантиомср (соединение VI) неактивен (таблица). Глипролин с открытой карбоксильной группой IV и метиламид VII также были неактивны (таблица). Описанное ранее соединение I проявляло нейропротективную активность в концентрациях 10 в -7степени - 10 -6степени М (рис. 1,а). Соединение V также проявляло нейропротективную активность до концентраций 10 в -7степени М (рис. 1,6). Изучение связи антигипоксической активности соединений I, II и IV - VII и их структуры показало, что эффект наблюдается только для эфира (I) и незамещенного амида (V), но не для соединения со свободной карбоксильной группой (IV) и замещенного амида (VII). Возможное объяснение состоит в том, что после энзиматического отщепления N-фенилацетильной группы происходит спонтанная циклизация дипептида с образованием дикетопиперазина, которой, как известно, подвергаются только низкоалкильные эфиры и незамещенные амиды. Это связано с влиянием минус-индукционного эффекта алкильного заместителя амидной группы в случае замещенного амида и отрицательного заряда у соединения с открытой карбоксильной группой на величину частичного положительного заряда на карбониле, атакуемом свободной электронной парой аминного азота (рис. 2). Таким образом, активность проявляется только у соединений, которые предположительно способны метаболизироваться с образованием ЦПГ — эфир (I) и незамещенный амид (V). Превращение соединения I в ЦПГ в плазме крови крысы in vitro ранее показано экспериментально. Экспериментальная химическая часть В работе использовали коммерческие аминокислоты (Sigma, Reanal). Используемые растворители очищали и сушили стандартными методами. Температуру плавления определяли в открытых капиллярах на приборе Optimelt МРА100 (Stanford Research Systems, США) и не корректировали. ПМР-спектры регистрировали в растворах диметилсульфоксида - d 6 (ДМСО-dg) или CDC13 в шкале 5, м.д. (J, Гц) на спектрометре АС-250 (Bruker, Германия) с рабочей частотой 250 МГц и Fourier 300 (Bruker, Германия) с рабочей частотой 300 МГц. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан. Удельное оптическое вращение измеряли на поляриметре ADP 440 Polarimeter (Bellingham + Stanley Ltd, Англия). TCX проводили на пластинках Kieselgel 60 G/F254 (Merck, Германия) в системах диоксан — вода, 9:1 (А), хлороформ — метанол, 9:1 (Б). Соединения с амидными группами обнаруживали в парах йода, соединения с открытой карбоксильной группой — бромкрезоловым зеленым, содержащие ароматические группы — в УФ-лучах. Элементный анализ проводили на приборе для определения углерода и водорода с 4 электрическими печами (600 - 900°С, тип МА-Г/6Р, завод ЛЭТО, Россия) в токе кислорода и на аппарате для определения азота с 3 такими же электрическими печами в токе углекислого газа. Данные элементного анализа соединений относительно процентного содержания С, Н и N отклоняются от теоретических не более чем на 0,4%. Энантиомеры этилового эфира N-фенилацетил-глицилпролина (C6H5-CH2-C(O)-Gly-Pr0-OEt). Получали аналогично. I (C6H5-CH2-C(О)-Gly-L-Pro-OEt, ГЗК-111). Tпл 111-112°С; [a]D23 - 90,0° (с 1, вода); Rf= 0,80(А). II (C6H5-CH2-C(O)-Gly-D)-Pro-OEt). Tпл 112-113 °С; [a]D23 + 90,0° (с 1, вода); Rf =0,80 (А). Метиловый эфир N-фенилацетил-глицил-L-пролина (C6H5-CH2-C(O)-Gly-L-Pro-OCH3, III). К охлажденному до - 10°С раствору 1,5 г (7,8 ммоль) N-фенилацетилглицина в 10 мл ДМФА при интенсивном перемешивании одновременно прибавляли 1,1 мл (7,8 ммоль) изобутилхлорформиата и 0,9 мл (7,8 ммоль) N-метилморфолина. После 2-3 мин перемешивания прикапывали раствор 1,3 г(7,8 ммоль) хлоргидрата метилового эфира N-пролина и 0,9 мл(7,8 ммоль) N- мeтилморфолина в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали еще 30 мин при — 10°С и 1 ч при комнатной температуре. Осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток растворяли в СНС13. Раствор последовательно промывали 3% NaHC03, водой, 1М раствором НС1 и вновь водой, сушили безводным сульфатом натрия и упаривали. Полученное масло затирали под эфиром, осадок отфильтровывали и получали 1,1 г (46%) III в виде белого кристаллического порошка. Twl 117— 118°С; [a]D23-85° (с 1, метанол); Rf= 0,65 (А). ПМР-спектр (ДМСО-dg) 5, м.д.: 1,81 и 2,13 (два м, 2Н, СРН2 Pro), 1,89 (м, 2Н, ОН2 Pro), 3,46 (м, 4Н, С5Н2 Pro, СН2Аг), 3,61 (с, ЗН, ОСН3, мажорный конформер), 3,68 (с, ЗН, ОСН3, минорный конформер), 3,84 и 4,03 (два дд, J 17,6 Гц, J 5,6 Гц, 2Н, СаН2 Gly), 4,31 (дд, J 4,0 Гц, J 8,5 Гц, 1Н, СаН Pro, мажорный конформер), 4,70 (дд, J 4,0 Гц, J 8,5 Гц, 1Н, СаН Pro, минорный конформер), 7,2-7,3 (м, 5Н, Аг), 8,15 (т, J 5,6 Гц, 1Н, NH Gly). C16H20N2O4. N-Фенилацетил-глицил-L-пролин (С6Н5-СН2-C(C>)-Gly-L-Pro-OH, IV). Суспензию 0,300 г (3,5 ммоль) этилового эфира N-фепилацетилглицил-L-пролина в 1,5 мл 1 М раствора NaOH перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч до получения раствора, затем подкисляли 2 М раствором НС1 до рН 3. Раствор упаривали в вакууме, полученный остаток растворяли в 15 мл хлороформа, нерастворившуюся часть отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме. Остаток затирали под эфиром, полученный осадок отфильтровали и сушили в вакууме при комнатной температуре. Получали 0,200 г (73%) продукта. Тпл 165- 166°С; [a]D23-75° (с 1, метанол); Rf=0,35 (А). ПМР-спектр (CDC13) 8, м.д.: 1,9 - 2,8 (м, 4Н, ОН2 Pro, С('Н2 Pro), 3,45 - 3,56 (м, 2Н, CSH2 Pro), 3,60 (с, 2Н, СНоАг), 3,86 и 3,98 (два дд, J 17,95 Гц, J 4,7 Гц, J 4,01 Гц, 2Н, CaH2 Gly), 4,35 (м, 1Н, СаН Pro, минорный конформер) и 4,53 (м, 1Н, СаН Pro, мажорный конформер), 6,45 (дд, J 4,7 Гц, J 4,01 Гц, 1Н, NH, мажорный конформер) и 6,85 (д.д., J 4,7 Гц, J 4,01 Гц, 1Н, NH, минорный конформер), 7,2-7,3 (м, 5Н, Аг).C15H18N2O4. Амид N-фенилацетил-глицил-L-пролина (С6Н5-CH2-C(0)-Gly-L-Pro-NH2, V). Раствор 0,500 г (1,57ммоль) этилового эфира N-фeнилацетилглицил-L-пролина в 10 мл насыщенного аммиаком метанола оставляли плотно закрытым на 5 дней при комнатной температуре. Окончание реакции определяли с помощью ТСХ. После завершения реакции метанольный раствор концентрировали до начала выпадения осадка. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом и сухим эфиром, перекристаллизовывали из этилового спирта. Получали 0,385 г (85%) кристаллического продукта. Тпл 179-180°С. [a]D23-67°С (с 1, метанол). Rf=0,35 (Б). ПМР-спектр (ДМСО-с16) 8, м.д.: 1,7-2,1 (м, 4Н, СШ2 Pro, СН, Pro), 3,5 (с, 2Н, СН-Аг), 3,6 (м, 2Н, CSH2 Pro), 3,85 и 4,0 (два дд, J 17,6 Гц, J 5,6 Гц, 2Н, CaH2 Gly), 4,18 (дд, J 4,0 Гц, J 8,6 Гц, 1Н, CaH Pro, мажорный конформер), 4,3 (дд, J 4,0 Гц, J 8,6 Гц, 1Н, CaH Pro, минорный конформер), 7,2 - 7,3 (м, 5Н, Аг), 6,9 и 7,2 (два с, 2Н, NH2), 7,56 (т, J 5,6 Гц, 1Н, NH, минорный конформер), 8.11 (т, J 5,6 Гц, 1Н, NH, мажорный конформер). c15h19n3o3. Амид N-фeнилацетил-глицил-L-пролина (С6Н5-CH2-C(0)-Gly-Z)-Pro-NH2, VI). Получен аналогично V из этилового эфира А - фенилацетил глицил - D - пролина. Выход 65%. Тш 178- 180°С; [a]D22 + 67° (с 1, метанол); Rf=0,35 (Б). ПМР-спектр (ДМСО-с16) 8, м.д.: 1,7-2,1 (м, 4Н, OH2 Pro, СРН, Pro), 3,5 (с, 2Н, СН.Аг), 3,6 (м, 2Н, СРН2 Pro"), 3,86 и 3,96 (два дд, J 17,6 Гц, J 5,6 Гц, 2Н, CaH2 Gly), 4,19 (дд, J 4,0 Гц, J 8,6 Гц, 1Н, СаН Pro, мажорный конформер), 4,3 (дд, J 4,0 Гц, J 8,6 Гц, 1Н, CaH Pro, минорный конформер), 7,2-7,3 (м, 5Н, Аг), 7,0 и 7,3 (два с, 2Н, NH2), 7,57 (т, J 5,6 Гц, 1Н, NH, минорный конформер), 8,12 (т, J 5,6 Гц, 1Н, NH, мажорный конформер). C15H19N303. Метиламид N-фенилацетил-глицил-пролина (C6H5-CH2-C(0)-Gly-L-Pro-NHCH3, VII). К раствору 0,300 г (1 ммоль) метилового эфира А-фeнилацетил-глицил-L-пролина в 5 мл метанола добавляли 2,5 мл насыщенного CH3NH2 абсолютного этанола. Полученный раствор оставляли плотно закрытым на 7 дней при комнатной температуре. Окончание реакции определяли с помощью ТСХ. После завершения реакции раствор упаривали в вакууме, полученное масло затирали под эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом и сухим эфиром. Полученное вещество перекристаллизовывали из этилового спирта, получали 0,251 г (84%) метиламида. Гпл 180-181°С; [a]D23-76° (с 1, метанол); Rf=0,31 (Б). ПМР-спектр (ДМСО-d6)сигма, м.д.: 1,67-2,21 (м, 4Н, СyH2 Pro, СбетаН2 Pro), 2,50-2,60 (м, ЗН, NHCH3), 3,49 (2Н,с, СН2Аr); 3,51 (м, 2Н, СсигмаН2 Pro), 3,85 и 4,0 (2 м, 2Н, CaH2 Gly), 4,22 (дд, J 4,1 Гц, J 8,5 Гц, 1Н, СаН Pro), 7.12 - 7,39 (м, 5Н, Аr), 7,72 (м, 1Н, NHCH3, мажорный конформер), 8,02 (м, 1Н, NHCH3, минорный конформер), 8,15 (т, J 5,6 Гц, 1Н, NH). C15H19N303. Экспериментальная биологическая часть: Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах массой 25 - 29 г (питомник "Столбовая"). Животных содержали в виварии при свободном доступе к пище и воде. Соблюдались этические правила гуманного обращения с животными, изложенные в директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС. Условия содержания животных соответствовали СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" от 29 августа 2014 г. № 51. Все манипуляции с животными были одобрены биоэтической комиссией ФГБНУ "НИИ фармакологии им. В.В. Закусова". Эксперименты проводили с 10.00 до 16.00 ч. Животных помещали в экспериментальную комнату за 3 - 4 ч до начала опыта. Испытуемые вещества растворяли в физеологическом растворе и вводили внутрибрюшинно. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор (0,9% водный раствор NaCl). Антигипоксическая активность изучена на модели нормобарической гипоксии с гиперкапнией ("баночная" гипоксия), согласно. Исследования проводили на животных одинаковой массы (разброс в группах не более 2 г). Каждая группа состояла из 10 животных. Вещества вводили внутрибрюшинно в виде раствора в 0,9% NaCl за 1 ч до начала эксперимента. Антигипоксическую активность соединений изучали в дозах 0,1; 0,5 и 1 мг/кг внутрибрюшинно. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем физиологического раствора. Далее животных помещали по одному в банки объемом 200 см3 и герметически закрывали. Гибель животного регистрировали по последнему атональному вдоху. Нейропротекторная активность in vitro изучена на клеточной модели повреждения дофаминергических нейронов нейротоксином 6-OHDA с использованием клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y. Клетки линии SH-SY5Y рассеивали с плотностью 10 тыс. клеток в лунку в 96-луночные планшеты в среде DMEM, содержащей 15% FBS и 2 мМ L-глутам и па и инкубировали при 37°С и 5% СО2 до образования монослоя. Для индукции 6-гидроксидофаминовой токсичности в культуральную среду вносили 6-OHDA в конечной концентрации 100 мкМ и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в 5% С02. После этого заменяли среду и культивировали в течение 24 ч в тех же условиях. Вещества вносили за 24 ч до повреждающего воздействия в диапазоне конечных концентраций от 10 в -5 до 10 в -8 М. Для определения жизнеспособности клеток использовали МТТ-тест. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре "Multiscan EX" ("Thermo") при длине волны 600 нм. Статистический анализ проводили с помощью стандартного пакета программ "Statistica 6.0" (Statsoft, Inc, США). Для оценки статистически значимых различий между экспериментальными и контрольными группами животных использовали непараметрический U-критерий Манна - Уитни. Результаты МТТ-теста анализировали с помощью U-критерия Стьюдента. Результаты оценивали как значимые при р < 0,05. Рассчитывали средние показатели по группе и стандартные ошибки средней (т ± SEM).

Авторы:

Издание: Химико-фармацевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 6.-С.13-17. Библ. 17 назв.
Просмотров: 64